Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы. Использование полиморфных микросателлитов для Генетического анализа и картирования поведенческих признаков 10
1.1. Микросателлиты и теория их использования 10
1.1.1. Микросателлитные повторы, их локализация в геноме, полиморфизм, функции 10
1.1.2. Микросателлитные повторы как генетические маркеры 14
1.1.3. Сравнение микросателлитов с другими генетическими молекулярными маркерами 16
1.2. Методы генетического анализа признаков поведения, использующие микросателлиты 23
1.2.1. Особенности генетической структуры признаков поведения 23
1.2.2. QTL анализ, его принципы, преимущества и недостатки 24
1.2.3. Метод генов-кандидатов и принцип позиционного клонирования мутаций. 28
1.2.4. Генетический анализ реакции замирания. Применение QTL анализа для картирования галоперидоловой каталепсии. 29
ГЛАВА 2. Материалы и методы 35
1.1. Экспериментальные животные. 35
1.1.1. Условия содержания 35
1.1.2. Гибридологический эксперимент 35
1.1.3. Селекционный эксперимент 35
1.2. Измерение каталепсии 37
1.3. Выделение ДНК 37
1.4. Выбор микросателлитных маркеров 39
1.5. ДНК-типирование 39
1.6. Тестирование функциональной активности 5НТід рецепторов 40
1.7. Статистическая обработка результатов 41
1.7.1. Оценивание выраженности каталепсии 41
1.7.2. Проверка гипотезы о сцеплении альтернативнго признака с неполной пенетрантностью 41
ГЛАВА 3. Результаты исследования 46
1.1. Доля каталептиков у мышей линий СВА, AKR и их гибридов Fi и бэюсроссов. 46
1.2. Локализация гена предрасположенности к каталепсии методом одномаркерного анализа 47
1.3. Локализация гена предрасположенности к каталепсии методом интервального оценивания 52
1.3.1. Картирование гена каталепсии по методу Brodkin et al. (2002) 52
1З.2. Картирование гена каталепсии методом максимального правдоподобия и минимумах2 54
1.4. Динамика выраженности каталепсии в ходе селекции на данный признак 56
1.5. Изменение концентрации генотипов и соответствующих аллелей СВА и AKR у мышей в ходе селекции на каталепсию 57
1.5.1. Бэккроссы 57
1.5.2. Мьпли поколения селекции SIH S2. 57
1.5.3. Мыши поколения З^и-S^..' 60
1.6. Изучение функциональной активности 5HTJA рецепторов у мышей линий СВА, AKR и Sn поколения селекции 60
ГЛАВА 4, Обсуждение результатов 62
Выводы 72
Список литературы
- Микросателлиты и теория их использования
- Методы генетического анализа признаков поведения, использующие микросателлиты
- Тестирование функциональной активности 5НТід рецепторов
- Локализация гена предрасположенности к каталепсии методом одномаркерного анализа
Введение к работе
Актуальность проблемы
Основной задачей феногенетики поведения является выявление молекулярных, клеточных и физиологических механизмов трансдукции информации, закодированной в ДНК, в сложный поведенческий признак. Решение этой задачи включает выявление относительной доли наследственности и среды в формировании поведенческого фенотипа, исследование характера генетической детерминации поведенческих реакций на уровне целого организма, изучение физиологических и биохимических каналов, через которые реализуется генетическая информация на уровне поведения. Особенно важным является изучение генетической структуры патологий поведения и высшей нервной деятельности.
Каталепсия (реакция замирания, животный гипноз, мнимая смерть) является одной из форм пассивной защитной реакции замирания, поскольку в естественных условиях она связана со страхом (Gallup, 1977; Klemm, 1989; Dixon, 1998). Она представляет собой обездвиженность с пластическим мышечным тонусом и встречается у всех позвоночных, включая млекопитающих (Карманова, 1977). В чрезмерно выраженной форме у человека каталепсия является синдромом патологического поведения, характерного для некоторых аффективных растройств и ряда форм шизофрении (Singerman, Raheja, 1994; Krager et al., 2003; Taylor, Fink, 2003).
Существуют различные типы каталепсии. В целом их можно объединить в две большие группы: фармакологические виды каталепсии, как морфинная (De Ryck et al., 1980) или галоперидоловая (Sanberg, 1980; Patel, Hitzemann, 1999), и наследственные типы реакции замирания. Из последних известны каталепсия крыс ГК (Барыкина и др., 1983; Kolpakov et al., 1996) и щипковая каталепсия у мышей.
Интересной для генетических исследований каталепсии является щипковая каталепсия (pinch-induced catalepsy) мышей. У некоторых особей этого вида кратковременную реакцию замирания можно вызвать раздражением рефлексогенной зоны шеи (Ornstein, Amir, 1981; Klemm, 1983).
Полагают, что эта рефлекторная реакция имеет адаптивное значение и в естественных условиях проявляется у самок при копуляции, у детенышей при их транспортировке матерью и т. д.
Выявлены межлинейные различия по скорости развития каталепсии у мышей (Ornstein, Amir, 1981). Высокая предрасположенность к щипковой каталепсии по сравнению с мышами других линий была обнаружена у мышей линии СВА (Куликов и др., 1989). У 54% самцов и самок этой линии развивалась стойкая реакция замирания. Для изучения закономерностей наследования предрасположенности животных к каталепсии был проведен гибридологический анализ признака на мышах двух контрастных линий: СВА - с максимальной его выраженностью и некаталептической AKR. Анализ показал, что этот признак является аутосомным, рецессивным, моно- или олигогенным с неполной пенетрантностью (Куликов, 1989; Kulikov et al., 1993).
Однако генетическая структура каталепсии и локализация гена или генов, определяющих данную патологию, до настоящего времени оставалась не выясненной. Общеизвестна ключевая роль дофаминовых (особенно D2 типа) рецепторов в проявлении каталепсии (Klemm, 1989). Работами, проводимыми в Институте цитологии и генетики СО РАН (Kulikov et al., 1995; Popova, Kulikov, 1995), показана важная роль серотониновой системы мозга, а именно: ключевой фермент биосинтеза серотонина, триптофангидроксилаза, 5-НТіД и 5-НТгд рецепторы вовлечены в регуляцию каталепсии у мышей.
Большая часть поведенческих признаков являются количественными, контролируются полигенно и значительно зависят от факторов внешней среды (Мазер, Джинкс, 1985; Васильева, 1999; Crusio, 1999), но при этом молено выделить главные гены с большим вкладом в изменчивость признака, чем остальные гены (Мазер, Джинкс, 1985). Для изучения генетической структуры количественных признаков был разработан специальный подход -QTL (quantitative trait loci) анализ. Локусы ДНК, для которых методом QTL показано статистически достоверное сцепление с поведенческим признаком, могут включать полигены, участвующие в определении наследственной
изменчивости по данному признаку (Plomin et al., 1994; Le Roy, 1999; Moisan, 1999; Roubertoux, 2001).
Одними из лучших маркеров для QTL анализа являются микросателлитные последовательности, поскольку обладают такими свойствами, как полиморфиость, кодоминаитность и достаточно высокая частота встречаемости в геноме (Hearne et al., 1992; Bennett, 2000; Pitel, Riquet, 2000; Schlotterer, 2004).
Так, у мышей был проведен QTL анализ каталепсии, возникающей при введении галоперидола. В результате было показано, что этот тип реакции замирания связан с геном дофаминовых D2 рецепторов (Patel, Hitzeraann, 1999). Такое заключение не являлось неожиданным, поскольку галоперидол по механизму воздействия является блокатором дофаминовых рецепторов, преимущественно D2 типа. Природа же генетических факторов, контролирующих щипковую каталепсию, до настоящего времен оставалась невыясненной. Сложность картирования щипковой каталепсии у мышей в том, что она относится к альтернативным признакам с неполной пенетрантностыо, и для картирования ее генов не приемлемы существующие программы QTL подхода, основанные на регрессионном анализе.
Целью настоящего исследования было выявление генетической структуры щипковой каталепсии у мышей СВА и картирование генов или гена, определяющих у этих животных высокую предрасположенность к каталепсии. Для выполнения цели исследования были поставлены следующие задачи:
1. определить на хромосомах мыши локусы, ответственные за
предрасположенность к каталепсии, при помощи полиморфных
микросателлитных маркеров;
выявить гены-кандидаты и проверить их связь с наследственной предрасположенностью к каталепсии;
изучить в процессе селекции на каталепсию изменения параметров этого признака и особенности генотипов селектированных животных;
показать возможность картирования альтернативных поведенческих признаков с неполной пенетрантностью.
Научная новизна.
впервые проведен генетический анализ наследственной щипковой каталепсии у мышей и определена ее генетическая структура, включающая один майорный ген и несколько полигенов;
впервые установлено, что ген, определяющий высокую предрасположенность к каталепсии, находится в дистальном фрагменте хромосомы 13 мыши;
селекция на каталепсию привела к фиксированию в потомстве локуса ДНК, полученного от каталептической линии СВА и тесно связанного с геном серотониновых 5-НТ1Л рецепторов;
показана возможность картирования альтернативного признака с неполной пенетрантиостъго классическим подходом QTL анализа с использованием полиморфных микросателлитных маркеров.
Научно-практическая ценность.
Результатами данной работы установлена генная структура сложного поведенческого признака - щипковой каталепсии у мышей СВА, которая у данных животных выражается в гипертрофированной форме. Поскольку реакция замирания представляет собой важный элемент пассивно-оборонительного поведения, то изучение ее генетического механизма способствует более глубокому пониманию эволюционной значимости каталепсии.
Кроме этого, была продемонстрирована возможность картирования альтернативного признака с неполной пенетрантностью классическим подходом QTL анализа с помощью полиморфных микросателлитных маркеров.
В данном исследовании показана также тесная связь предрасположенности к каталепсии с участком ДНК мыши, несущим ген 5-НТ,л рецепторов нейромедиатора серотонина, что привлекает внимание исследователей к более детальному изучению функций этих рецепторов и их роли в формировании поведенческих признаков.
Получены в результате селекции на каталепсию мыши со стабильно высокой долей каталептиков, значительно большей, чем у родительской линии СВА. Возможно дальнейшее использование этих животных в изучении генетических и физиологических факторов каталепсии, а также ее связи с другими формами поведения.
Положения, выносимые на защиту.
высокая предрасположенность к каталепсии у мышей инбредной линии СВА кодируется одним майорным геном, локализованным в дистальном участке хромосомы 13 (между 58 и 75 сМ) и рядом не сцепленных с ним полигеиов,
вклад главного гена в наследование склонности к реакции замирания составляет 18%, а полигенов - 32%,
селекция на каталепсию привела к закреплению в потомстве аллеля микросателлитного маркера D13Mit76, полученного от родительской линии СВА и тесно связанного с геном 5-НТід рецепторов,
наиболее вероятным геном-кандидатом на роль главного гена каталепсии является геи, кодирующий 5-HTja рецептор нейромедиатора серотонина.
Апробация работы.
Результаты данной работы были представлены и обсуждены на Ученых Сессиях Института цитологии и генетики в 2000, 2003 годах, на XXXIX, XL и XLII международных научных студенческих конференциях "Студент и научно-технический прогресс" (Новосибирск, 2001, 2002, 2004), VII Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2004), III Съезде генетиков и селекционеров "Генетика в XXI веке; современное состояние и перспективы развития" (Москва, 2004), Международной школе молодых ученых «Геномика человека и модельных объектов» (Звенигород, 2004), 9ой зимней школе CIMO (Хельсинки, 2005), V Съезде физиологов Сибири (Томск, 2005), Международной летней школе по нейрогенетике поведения (Москва, 2005).
Публикации.
Материал диссертации представлен в 9 публикациях, в том числе в 3 статьях в отечественных реферируемых журналах.
Структура и объем работы.
Работа включает все необходимые разделы: введение, обзор литературных данных, материалы и методы, результаты и их обсуждение, выводы и список использованной литературы. Общий объем составляет 95 машинописных листов. Представлено 13 рисунков и 8 таблиц.
Благодарности.
Автор выражает сердечную благодарность своим научным руководителям Поповой Н.К. и Куликову А.В. за помощь при написании этой диссертационной работы, а таюке аспирантке лаборатории нейрогеномики поведения Кондауровой Е.М. за помощь в проведении экспериментов. Отдельную благодарность за поддержку технического обеспечения работы над диссертацией автор приносит Антонову Д.Л.
Микросателлиты и теория их использования
Наличие повторяющихся последовательностей, которые в геноме эукариот занимают большую часть (Сингер, Берг, 1998; Жимулев, 2003), представляет собой одно из самых загадочных явлений, называемое избыточной ДНК. Выделяют два типа данных последовательностей: интерсперсии (повторы, чередующиеся с уникальными последовательностями) и тандемные повторы, включающие в свою очередь сателлитную, минисателлитную и микросателлитную ДНК, которые различаются по размеру повторяющегося фрагмента и общей длине (Bennett, 2000).
Микросателлиты, или SSR (short simple repeat), или STR (short tandem repeat) получили свое название по аналогии с минисателлитами (Nakamura et al.s 1987; Chambers, MacAvoy, 2000), которые являются повторяющимися вдоль всего генома фрагментами по 10-100 пн и суммарной длиной 100 пн -20-тпн (Jeffreys et al., 1985). Микросателлиты же содержат приблизительно от 2-3 до нескольких десятков копий однотипных участков ДНК по 1-6 пн, т. е. в среднем длина микросателлита составляет 10-100 пн (Vogt, 1990; Weber, 1990; Bennett, 2000). Существует несколько формул записи микросателлитных повторов, например, (dC-dA)n.(dG-dT)n, (CA)n.(GT)n или (CA)n/(GT)n и (СА)П или (TG)n (Beckmann, Weber, 1992; Callan et al;, 1993).
SSR диспергированы в геномах прокариот (Field, Wills, 1996; Hancock, 1996) и эукариот (Toth et al., 2000; Zane et al., 2002), причем у последних они представлены намного шире (Li et al., 2004). Например, в геноме человека насчитывают более 1 млн микросателлитных локусов, которые в целом занимают где-то 3% генома (Ellegren, 2004).
Некодирующие районы эукариотических геномов включают в себя все типы микросателлитов (но больше моно- и динуклеотидов) (Toth et al., 2000; Morgante et al., 2002), которые встречаются здесь в 5-ГО раз чаще, чем случайные последовательности (Sarkar et al., 1991). В экзоиах эукариот содержится значительно меньше SSR (Metzgar et al., 2000; Kantety et al., 2002), и состоят они в основном из три- и шестинуклетидных повторов (Field, Wills, 1996; Toth et al,, 2000; Wren et al., 2000), что связано с негативной селекцией против мутаций со сдвигом рамки считывания в кодирующих участках (Metzgar et al, 2000). Микросателлиты находят также в регуляторных областях генов (Kashi et al., 1997; Morgante et al., 2002; Li et al., 2004).
Характер повторяющихся последовательностей и их распределение в значительной мере зависят от таксономической группы (Beckmann, Weber, 1992; Tautz, Schlotterer, 1994). Так, в геноме мыши было найдено в 2-3 раза больше микросателлитов, чем у человека. Более того, мышиные SSR оказались в среднем длиннее (Ellegren, 2000).
Частота встречаемости микросателлитов у всех изученных организмов зависит от размера генома, наивысшим этот показатель был у млекопитающих и составил в среднем 1 SSR яокус на 2-30 тпн (Stallings et al., 1991; Hancock, 1996; Katti et al., 2001; Lander et al., 2001). Частота микросателлитных локусов связана с участком хромосомы. У человека и мыши она выше вдвое на концах хромосомных плечей (Ellegren, 2000).
Долгое время считалось, что микросателлитные повторы являются «бесполезными» элементами генома, однако последние исследования показывают, что это не так (Kashi et al., 1997; Marcotte et al., 1999; Li et al., 2002; Li et al., 2004), возможные функции микросателлитов представлены ниже (Рис. 1).
Микросателлиты задействованы в организации хроматина, они формируют петлеобразные структуры ДНК (шпильки), которые участвуют в транскрипции (Catasti et al., 1999). Помимо этого, центромерные тандемные повторы принимают участие в сцеплении сестринских хроматид и формировании кинетохора (Murphy, Karpen, 1995).
Также микросателлиты вовлечены в регуляцию метаболических процессов ДНК, наряду с минисателлитными последовательностями они предлагаются в качестве «горячих» точкек рекомбинации (Jeffreys et al., 1998), причем значение имеет не только состав повторяющейся единицы, но и число повторов (Li et al., 2002). Некоторые микросателлиты способствуют образованию Z-конформации ДНК (Biet et al., 1999).Кроме этого, SSR могут участвовать в терминации репликации-ДНК (Field, Wills, 1996). Наконец, у многих видов микросателлитные последовательности находятся в экзонах минорных генов системы репараций MMR (mismatch repair). Предположительно, эти SSR выступают в роли генетического модулятора эволюционной скорости мутирования (Chang et al., 2001).
Микросателлиты участвуют в регуляции генной активности, влияя на транскрипцию генов, находясь как в самих промоторных сайтах (Hoffman et al., 1990; Stallings et al., 1991), так и в нитронах (Gebhardt et al., 1999). Другие SSR, находящиеся в регуляторных последовательностях, служат сайтами связывания с регуляторными белками (Csink, Henikoff, 1998), и для эффективности связывания важно количество повторов (Winter, Varshavsky, 1989). Кроме этого, микросателлитные последовательности могут оказывать влияние на генную трансляцию (Martin-Farmer, Janssen, 1999).
Методы генетического анализа признаков поведения, использующие микросателлиты
Поведенческие признаки животных и человека наследуются по тем же законам, что и морфологические, физиологические, биохимические особенности организма (Plorain, 1990; Plomin et al., 1994). Поведение является одним из тех признаков организма, посредством которых он приспосабливается к весьма широким вариациям в среде обитания (Беляев, 1972; Трут, 1978). Поведенческие признаки относят к категории количественных, поскольку они представленны большим числом градаций, полигенно контролируются и находятся в большой зависимости от условий внешней среды (Frank,1974; Мазер, Джинкс, 1985; Васильева, 1999). Это обстоятельство затрудняет применение к ним классических методов генетического анализа.
Известно, что в полигенных системах вклад индивидуальных генов не является одинаковым и можно выделить гены большого эффекта, имея в виду непосредственное генное действие, и гены малого эффекта. Первые, которые Мазер называл также главными генами (Мазер, Джинкс, 1985), а Рендел -майор-генами (Rendel et al., 1965), выполняют основную функцию разрешения формирования признака определенного качества. Остальные гены, проявляющиеся только на фоне данных главных генов, выполняют функцию усиления или ослабления их действия. Группу таких генов Рендел называл минорными (Rendel et al., 1965), а Мазер - полигенами (Мазер, Джинкс, 1985).
Гибридологическому анализу, поставляющему основные сведения о генах, поддаются, в первую очередь, олигогенные мутации генов. Так, при помощи этого метода удалось установить, что некоторые формы поведения определяются одним или двумя генами. Примером монофакториальиого ф наследования патологической формы поведения может служить различная чувствительность мыщей к действию звукового раздражителя (Collins, Fuller, 1968). Напротив, анализ мутаций минорной группы затруднителен при помощи гибридологического анализа (Васильева, 1999), поэтому в настоящее время для генетического анализа и картирования поведенческих признаков активно применяются методы молекулярной биологии, использующие молекулярные маркеры, расположенные по всей длине ДНК изучаемого генома (Зорина и др., 1999; MacClern, 1999).
Как было сказано выше, основной трудностью в генетике поведения является то, что большая часть поведенческих признаков определяется некоторым числом генов (Frank,1974; Мазер, Джинкс, 1985), локализация которых неосуществима при использовании стандартных генетических методов. Одним из возможных решений этой проблемы является QTL (quantitative trait locus) анализ или анализ локусов количественных признаков (Plomin et al., 1994; Le Roy, 1999; Moisan, 1999; Roubertoux, 2001), l предложенный около 15 лет назад (Lander, Botstein, 1989). Ф Понимание количественного наследования на молекулярном уровне требует подробного описания индивидуальных генов, ответственных за развитие признака: их числа, хромосомной локализации и величины вклада каждого гена в исследуемый признак. Все это возможно определить с помощью QTL анализа (Flint et al., 1995; Le Roy, 1999; Moisan, 1999; Belknap etal.,2001).
Суть метода заключается в анализе сцепления между районами ДНК и фенотипическими характеристиками, т. е. в определении числа и последующей локализации хромосомных участков, содержащих полигены, которые связаны с качественно или количественно измеряемыми фенотипами. Данный метод применим для инбредных линий всех животных и растений (Le
Roy, 1999; Moisan, 1999; Le Roy, Elsen, 2000). В упрощенном варианте пример схемы анализа можно представить следующим образом: проводится скрещивание двух инбредных линий, одна из которых несет рецессивный определяемый при тестировании признак поведенческой патологии (линия А), а другая характеризуется его отсутствием (линия В). Затем возвратно скрещивают животных \ с одной из родительских линий (для конкретизации с линией А), среди бэккроссов, таким образом, половина особей будут гомозиготами по маркеру, полученному от родителя А, другая половина животных будут гетерозиготами, содержащими оба аллеля данного маркера (Рис.3).
Тестирование функциональной активности 5НТід рецепторов
Исследование локализации генов, кодирующих предрасположенность к каталепсии, было осуществлено методами одномаркериого анализа и интервального картирования, разработанных для альтернативных признаков с неполной пенетрантностью. При одномаркерном анализе, проведенном на бэккроссах-каталептиках, сцепление между предрасположенностью к каталепсии (выражаемой в процентах каталептиков) и каждым маркером оценивалось независимо от других маркеров. При предположении, что все аллели, определяющие высокую предрасположенность к каталепсии, получены от линии СВА, достоверное преобладание гомозиготных генотипов (с/с) над гетерозиготными (с/а) для какого-либо маркера свидетельствует о сцеплении этого маркера с геном, кодирующим каталепсию. У бэккроссов-каталептиков проверка отклонения распределения числа гомо- (Нл) и гетерозигот (Nc/a) от их случайного распределения (1:1) проводилась с помощью критерия %2 с одной степенью свободы: X2 = (Nc/c-N)2/N + (Nc/a-N)2/N, где N = (Nc/c + Nc/a)/2.
Для уменьшения вероятности ошибки второго рода (принятие гипотезы, когда она ложна) вводилась поправка Бонферрони на множественное сравнение (Lynch, Walsh, 1998): Р = PQ/П, где п - число используемых маркеров. Одномаркерный анализ позволяет определить хромосому, на которой находится ген, кодирующий признак.
Ген, кодирующий альтернативно распределенный признак с неполной пенетрантностью, картировали более точно на данной хромосоме с помощью интервального оценивания посредством двух независимых статистических подходов.
Первый базируется на методе %2 (Brodkin et а!., 2002), в этом анализе использовались только бэккроссы-каталептики. Исследуемая хромосома с помощью набора полиморфных маркеров разбивается на ряд интервалов размером 10-15 сМ. Число гомо- и гетерозиготных особей по дочитывается для каждого маркера и каждого интервала между двумя соседними маркерами аналогично тому, как и для одномаркерного анализа. Для подсчета числа гомо- и гетирозигот для интервала между соседними маркерами рекомбинантные особи . предварительно удаляются. Исключение рекомбинантных особей сопровождается уменьшением числа наблюдений, что должно приводить к уменьшению величины х2. Случай, когда удаление рекомбинантных особей вместо ожидаемого уменьшения приводит, наоборот, к увеличению х2, расценивается как доказательство локализации гена, кодирующего признак, в данном интервале (Brodkin et al., 2002).
Второй подход опирается на классический метод максимального правдоподобия, разработанный для парных признаков. Данный метод использует данные по всем бэккроссам: и каталептикам, и некаталептикам. Выдвигаются две статистические гипотезы. Согласно гипотезе Н0, предрасположенность к каталепсии определяется некоторым числом диспергированных в геноме полигенов, каждый из которых вносит свой небольшой вклад в развитие признака. Гипотеза Hi предполагает, что реакция замирания контролируется рядом полигенов и одним майер-геном, пенетрантность которого сопоставима по величине с суммарной пенетрантностью многочисленных полигенов. Hi:PCc/c=(l-r)xp/2 + m/4 PNc/c - (1 -г) х (1 -руї + г 12 - ml А ?Сы =гхр/2 + т/4 РШ,= г х (\-р)/2 + (1-г)/2 - т/4 Гипотеза НО выводится из гипотезы Hi при параметрах г -0.5 ир = 0. H0:PCc/c=PCCAi=m/4 PNc/c=PNcA1=0.5-m/4 где г - оцениваемая величина сцепления каталепсии с маркером, которая является функцией от расстояния между геном каталепсии и маркером (Lynch, Walsh, 1998), р - пенетрантность главного гена каталепсии, т - суммарная пенетрантность полигенов, РСс/с, PNc/o, РСс/а и PNc/a - ожидаемые доли каталептиков (PC) и некаталептиков (PN) с генотипами с/с (гомозиготы) и с/а (гетерозиготы). г , величина коэффициента рекомбинации, оценивалась как r = d/10Q, если d 10, г - (1 - edm )/2, если 10 d 50, г = 0.5, если d 50, где d - расстояние (сМ) между геном каталепсии и маркером. Позиции маркеров на хромосоме определяли согласно генетической карте хромосом, приведенной в базе данных Mouse Genome Database (MGD, hup: //mgd .hgmp же. ас .uk).
Все множество бэккроссов по каждому из проверяемых маркеров было разбито на четыре фенотипические группы: 1) гомозиготы - каталептики, 2) гомозиготы - некаталептики, 3) гетерозиготы - каталептики и 4) гетерозиготы - некаталептики. Проверку соответствия предсказаний численностей каталептиков и некаталептиков для гипотез Н] и Но наблюдаемым численностям особей в четырех фенотипических группах проводили с помощью метода минимума % (Крамер, 1975) и метода максимального правдоподобия (Le Roy, 1999), которые позволяют не только тестировать гипотезу, но и оценить ее параметры (позиция и пенетрантность главного гена, пенетрантность полигенов). Логарифм величины правдоподобия вычислялся по формуле: L = 2iSjNyxlogPy+C, где Nu - наблюдаемое число животных в j-й группе для і-ого маркера, Ру - ожидаемая доля каталептиков и некталептиков в j-й группе для і-ого маркера, С - константа.
Гипотеза Ні сравнивалась с гипотезой Но вычислением LOD или десятичного логарифма отношения величины правдоподобия для Ні к величине правдоподобия для Н0 (Lynch, Walsh, 1998).
Помимо этого, гипотезы оценивались методом х" по следующему уравнению: X2-2iZj(Nij-NixPu)2/(NixPu),df-nmx3-npj где Ni- общее число наблюдений для і-ого маркера (Ni = EjNy, j = 1...4), nra - число маркеров, np - число оцениваемых параметров (np = 3 для гипотезы Hi и iip= 1 для гипотезы Н0). . Значения параметров подбираются таким образом, чтобы минимизировать величину %2 или максимизировать величину L. Поиск минимума или максимума функций проводился по алгоритму Хука-Дживса при помощи программы, реализованной на языке BASIC (Bimday, 1984).
Оценку числа степеней свободы (df) для критерия %2 проводили как df= число маркеров х 3 - число оцениваемых параметров.
Коэффициент, равный 3, для первого члена формулы определялся условием нормировки для четырех наблюдаемых групп для каждого маркера. Доверительный интервал для положения гена, определяющего каталепсию, был построен при использовании принципа one-LOD (Lander, Botstein, 1989; Lynch, Walch, 1998).
Локализация гена предрасположенности к каталепсии методом одномаркерного анализа
Процент каталептиков в линии СВА составил 50% (125 из 252) (Рие.5), что хорошо согласуется с полученными ранее данными (54%, KuHlcov et al., 1993) (х2 = 1.93, р 0.1) и указывает иа то, что предрасположенность к каталепсии стабильно наследуется в поколениях линии СВА.
По этому признаку не было обнаружено половых различий ( = 1,94, р 0,16) (ТаблЛ). Среди мышей линии AKR и реципрокных гибридов Fj не было найдено ни одного каталептика, что также подтверждает полученные ранее данные (ТаблЛ). Таким образом, вышесказанное вкупе с более ранними данными (Куликов и др., 1989) указывает на то, что каталепсия наследуется как аутосомный рецессивныый моно- или олигогенный признак.
Из 296 бэккроссов 79 оказались каталептиками, что составляет 27 % (Рис.8). По доле каталептиков у бэккроссов не было выявлено ни половых (Х2=1,7, р 0,19), ни реципрокных различий (х2== 0,01, р 0,9) (ТаблЛ), поэтому для дальнейшего исследования данные по самцам и самкам для бэккроссов анализировались совместно. Полученное распределение каталептиков и некаталептиков среди бэккроссов согласовывалось с ожидаемым (74, Xі =0,35, р 0,05), подсчитанным исходя из предположения о наличии менделевского расщепления 1:1 и 50%-ой пенетрантности исследуемого признака.
Пусть для полиморфного микросателлитиого маркера с - аллель, полученный от СВА, а а - полученный от AKR. Согласно моногенной гипотезе, каталепсия будет проявляться только у бэккроссов, гомозиготных по аллелю каталепсии с; полученному от СВА. При тесном сцеплении между геном каталепсии и полиморфным микросателлитным маркером среди
бэккроссов-каталептиков число животных, имеющих генотип с/с будет достоверно превышать число особей с генотипом с/а. Равенство частот генотипов с/с и с/а у бэккроссов-каталептиков будет свидетельствовать об отсутствии сцепления. В качестве меры превышения числа гомозигот над числом гетерозигот: был выбран стандартный тест %2 с одной степенью свободы. Критическое значение х2 при уровне значимости, равном 0.05, для проверки гипотезы о сцеплении, скорректированное на число маркеров, равное 65 (Р = Ро/65), было 11.3 (Куликов и др., 2003; Куликов, Базовкина, 2003).
Получили, что гипотеза об отсутствии сцепления строго отвергается только для одного маркера D13Mit78 (х =17.78, р 0.002), локализованного в теломериом фрагменте (75 сМ) хромосомы 13 (Рис.7). Действительно, из 77 исследованных бэккроссов-каталептиков 57 особей были гомозиготами по аллелю СВА.
Близкое к критическому значению %2 (10.92, р 0.058) было получено для маркера D13MU76, расположенного в положении 61 сМ на хромосоме 13. Для других маркеров, локализованных более проксимально на хромосоме 13 или на других 18 аутосомах, значения %2 были ниже критического (не более 5.0) (Рис.7).
Несмотря на достоверное значение критерия %2г моногенной модели предрасположенности к каталепсии противоречит наличие 20 гетерозигот среди 77 каталептиков, наблюдаемых при ДНК-типировании с маркером D13Mit78. Предположим, что такая ситуация связана с рекомбинацией в данном районе хромосомы 13. Поскольку маркер D13Mit78 находится практически в самом конечном участке хромосомы, то рекомбинация может произойти только проксимальнее маркера D13Mit78, т. е. между маркерами D13Mit76 и D13Mit78, на участке протяженностью 14 сМ. Значение частоты кроссинговера в данном локусе не соответствует полученному числу гетерозигот, следовательно, существует другое объяснение их возникновению. Разумным будет принятие модели наследования каталепсии, включающей главный ген в теломерном участке хромосомы 13 и несколько полигеиов, вовлеченных в регуляцию признака и определяющие его оставшуюся вариабельность, т. е. наличие среди бэккроссов гетерозигот по маркеру D13Mit78.
С маркером D9Mitl29, расположенным на растоянии 2 сМ от гена дофаминовых D2 рецепторов, не было обнаружено сцепления для ВС (%2 = 0,12, р 0,05). Следовательно, генетико-молекулярный механизм регуляции естественной оборонительной реакции, какой является щипковая каталепсия, отличается от механизма, определяющего тесно сцепленную с геном D2 рецептора чувствительность к каталептогену галоперидолу, (Kanes et al., 1996; Patel, Hitzemann, 1999).
Стоит также отметить, что при анализе результатов не было выявлено сцепления предрасположенности к каталепсии с: маркерами D7Mit227 и D10Mitl03, локализованными на хромосомах 7 и 10, на расстоянии 8 сМ от генов, кодирующих гены триптофангидроксилазы tphl и tph2, соответственно. lie был установлен факт наличия сцепления признака каталепсии с маркером Ш4МІ192, расположенным на хромосоме 14 мыши (Hsieh et al., 1990) на расстоянии 3,5 сМ от гена 5-НТ2А рецепторов.
