Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор настоящего состояния проблематики 6
2. Цель работы 23
3. Использованные методы 24
3.1. Сбор материала и его обработка 24
3.2. Скрининг анализ 27
3.3. Подтверждающий анализ 28
3.3.1. Элюирование аминокислот из фильтровальных бумаг 28
3.3.2. Определение уровня креатинина в образцах 28
3.3.3. Деминерализация образца мочи 29
3.3.4. Тонкослойная хроматография 30
3.4. Количественный анализ 33
3.4.1. Подготовка образца для анализа 33
3.4.1.1. Элюирование аминокислот из фильтровальных бумаг 33
3.4.1.2. Приготовление стандартов аминокислот 34
3.4.1.3. Дериватизация образцов 34
3.4.2. Хроматографическое определение 35
3.4.3. Определение концентрации креатинина в образце 36
4. Результаты работы и обсуждение 37
4.1. Сбор и обработка материалов 37
4.2. Элюирование образцов 39
4.3. Бумажная хроматография 43
4.3.1. Метод бумажной хроматографии 43
4.3.2. Выделение свободных аминокислот 44
4.3.3. Результаты скрининг анализа 46
4.4. Тонкослойная хроматография 59
4.4.1. Метод тонкослойной хроматографии 59
4.4.2. Аминокислоты, определённые методом тонкослойной хроматографии 66
4.4.3. Результаты подтверждающего анализа 67
4.5. Жидкостная хроматография высокого давления 72
4.5.1, Метод жидкостной хроматографии высокого давления 72
4.5.2, Свободные аминокислоты в элюатах крови и мочи 74
4.5.3, Результаты количественного анализа 82
Резюме работы 90
Приложение 92
Список использованных источников
- Сбор материала и его обработка
- Элюирование аминокислот из фильтровальных бумаг
- Бумажная хроматография
- Аминокислоты, определённые методом тонкослойной хроматографии
Введение к работе
Подобно остальным низкомолекулярным соединениям, аминокислоты фильтруются в почечных клубочках в первичную мочу и до 98% реабсорбируются обратно в проксимальных канальцах. Здоровый организм человека выделяет небольшое количество свободных аминокислот, спектр которых сравнительно постоянен. Факторами, оказывающими заметное влияние на выделение аминокислот с мочой, являются возраст, содержание белков в пище и, в случае некоторых аминокислот, пол выделителя [1].
Самое сильное влияние из перечисленных факторов оказывает возраст индивидуума. Это происходит из-за созревания некоторых системов канальцевой реабсорбции в течение первого года жизни ребёнка. Онтогенетическое созревание канальцев оказывает влияние главным образом на экскрецию пролина, гидроксипролина и глицина (физиологическая иминоглицинурия, имеющая место в течение первого полугода жизни), а также лизина и цистина (физиологическая цистинурия в течение первого полугода жизни) [2]. По мере того, как система канальцевой реабсорбции созревает, пролин и гидроксипролин перестают выделяться с мочой, что происходит на 5-7 месяце жизни. Уровень цистина и лизина в моче также сильно уменьшается, и эти аминокислоты выделяются только в следовых количествах. Экскреция таурина у новорожденных превышает суммарное количество всех остальных аминокислот в моче, но сильно снижается в течение первой недели жизни и остаётся относительно низкой в детском возрасте. Если взять пять аминокислот, наиболее часто идентифицированных в моче здоровых индивидуумов различных возрастных категорий, то картина получается весьма разнообразной: в моче у недоношенных детей наиболее часто встречаются глицин, тирозин, пролин, гидроксипролин и аланин, у новорожденных - таурин, глицин, пролин, тирозин и этаноламин, у грудных детей - глицин, аланин, гистидин, серии и глутамин, у детей школьного возраста - глицин, гистидин, таурин, 1-метил-гистидин и глутамин, а у взрослых наиболее частыми аминокислотами являются глицин, гистидин, глутамин, серин и аланин [3,4].
После приёма пищи выделение аминокислот с мочой достигает максимального значения [5]. При голодании наблюдается значительное уменьшение выделяемых аминокислот: взрослые, голодающие один день, выделяют лишь 51% уровня до голодания. Это снижение является результатом значительного уменьшения экскреции аминокислот в период от 8 часов до 11 часов утра и отсутствия максимального выделения после приёма пищи.
За исключением глицина, ,женщины выделяют с мочой меньше 4 аминокислот, чем мужчины [6]. Повышенная экскреция одной или нескольких аминокислот с мочой называется гипераминоацидурия. Почти у всех аминокислот, содержащихся в белках, существуют наследственные нарушения метаболизма. Наследственные нарушения метаболизма входят в группу моногенных нарушений в большинстве случаев с аутосомально-рецессивным типом наследования [7, 8, 9], которые сопровождаются умственной отсталостью разных степеней из-за токсического повреждения центральной нервной системы [10, 11, 12]. Развитие детей с наследственным нарушением метаболизма аминокислот проходит без клинических признаков сразу после рождения. Признаки повреждения центральной нервной системы 4 появляются позже, когда эти изменения уже необратимы [13, 14]. Для того, чтобы предупредить эти необратимые повреждения, необходимо вовремя идентифицировать детей с наследственными нарушениями метаболизма с использованием биохимических анализов крови и мочи, с помощью которых определяется повышение уровня или присутствие типичного метаболита. На основе этих определений можно вовремя и правильно диагнозировать наследственное нарушение метаболизма и подходящим диетическим и медикаментозным лечением предупредить необратимые нарушения центральной нервной системы [15, 16, 17].
Наследственные нарушения метаболизма отличаются от хромосомных отклонений молекулярным дефицитом, который у более половины метаболических нарушений связан с ферментной системой [18, 19]. Поэтому иногда эти заболевания называют "энзимопатиями".
Наследственные нарушения метаболизма аминокислот возникают вследствие точечных мутаций генетической информации, результатом которых являются нарушения ферментных реакций или же изменения белковых структур, необходимых для нормальных биохимических 4 процессов, происходящих в организме [20, 21]. Нарушение цепи реакций метаболизма может позже привести к клиническим изменениям в различных органах. На основе до сих пор признаваемой гипотезы "один ген = один фермент" и существовании 20000 - 40000 генов у человека можно ожидать столько же ферментных нарушений, но проявление этих нарушений зависит от взаимодействия генов между собой, а также от влияния факторов окружающей среды [22]. С одной стороны, неполное проявление некоторых генов уменьшает количество возможных ферментных нарушений, но, с другой стороны, полиморфизм их проявления приводит к всё новым метаболическим нарушениям. Таким образом, полиморфизм ферментной системы индивидуума является причиной существования различных метаболических нарушений лёгкой формы или временного характера, которые затрудняют дифференциальную диагностику классических нарушений метаболизма аминокислот [23]. Ферментные отклонения определяются аутосомально-рецессивным типом наследования, когда нарушение метаболизма проявляется только у гомозигот, у которых мутированы оба аллеля. Родители поражённого ребёнка являются гетерозиготами и носителями одного изменённого аллеля и фенотипически бывают здоровыми [24]. Эти заболевания более часто проявляюся в семьях, в которых родители являются родственниками. Отношение между больными мужского пола и больными женского пола составляет 1 : 1. У семейных пар, в которых муж является гомозиготным больным, а жена - здоровой гомозиготой, могут родиться исключительно здоровые гетерозиготные дети. У пары гомозиготного больного и клинически здоровой гетерозиготы будет половина гомозиготных детей с метаболическими нарушениями, а другая половина детей родятся фенотипически здоровыми гетерозиготами [25].
Дефицит фермента у больного вызывает:
1) токсический эффект повышения уровня определённого метаболита перед барьером;
2) стимуляцию абнормальных ферментных процессов, а этим и продукцию абнормальных метаболитов, которые могут быть токсичными или могут ингибировать дальнейшие процессы в цепи реакций метаболизма. Например, в случае фенилкетонурии повышенный уровень фенилаланина ингибирует метаболизм эссенциальных аминокислот, что приводит к нарушению миелинизации нервных клеток [26, 27];
3) снижение продукции нормального метаболита, что приводит к патологическому состоянию из-за дефицита этого метаболита;
4) изменения эпителиального транспорта, что приводит к увеличению потери биологически необходимых метаболитов. Например, результатом цистинурии является насыщение мочи и появление мочевых камней [28, 29]. Формы проявления наследственных нарушений метаболизма могут быть следующими:
1) острые признаки метаболического отклонения, такие как метаболический ацидоз, алколоз, кома, нарушение дыхания, судороги, цианоз, которые могут привести к смерти новорожденного, если не идентифицировать заболевание вовремя и не начать подходящее лечение [30];
2) хронические признаки, которые проявляются постепенно, начиная с 6-7 месяца жизни, такие как судороги, психомоторическая отсталость, гепатоспленомегалия, катаракта, повреждение различных органов;
3) прерывающиеся признаки метаболических заболеваний, которые являюся результатом определённых ситуаций, таких как повышенный приём белков, острые инфекции, приём лекарств, пубертальные изменения, беременность. Своевременный диагноз в этих случаях может предупредить повторные метаболические кризисы, которые постепенно ухудшают клиническое состояние пациента.
Существование наследственных нарушений метаболизма аминокислот признал в начале XX века английский педиатр и биохимик Гаррод [31], который утверждал, что альбинизм, алкаптонурия, цистиурия и пентозурия являются результатом метаболического дефицита. Его мнение не было принято, даже когда генетики определили, что наследование этих четырёх заболеваний объясняется менделевскими законами. Для признания доводов Гаррода потребовались дальнейшие биохимические исследования в этой области, такие как изучение механизма тирозиноза, а также работы Фёллинга [32], который подробно описал клинические и метаболические изменения при фенилкетонурии и изолировал типичный для этого заболевания патологический метаболит в моче - фенилпировиноградную кислоту. Внедрение хроматографических методов анализа в практику клинико-химических лабораторий в сороковых годах XX века [33], а также открытие методов скринингового анализа , [34, 35] дало возможность идентифицировать целый ряд доселе незнакомых метаболических нарушений, В результате дальнейшего бурного развития биохимической диагностики наследственных нарушений метаболизма аминокислот были определены более чем 200 ННМ аминокислот (Табл. 1), у 20 из которых возможно сложное диетическое лечение [36, 37], а у остальных применяется генетическая превенция [38, 39].
В течение последних 20 лет изменилась и клиническая симптоматология наследственных нарушений метаболизма аминокислот. В прошлом неизбежным результатом ННМ были психомоторическая отсталость и олигофрения. Благодаря своевременному скриниговому определению и улучшению биохимической диагностики метаболических заболеваний в настоящее время стало возможным предупреждение этих последствий. В поле внимания диагностики вошли сложные метаболические нарушения новорожденных. Ещё десять лет тому назад такие типичные заболевания, как фенилкетонурия, лейциноз, гомоцистинурия, тирозиноз, считались одной нозологической единицей каждое. Сегодня же каждое из них представляет группу от четырёх до десяти различных метаболических нарушений.
Сбор материала и его обработка
Образцы мочи были собраны у следующих четырёх различных групп детей и взрослых: I. Популяция с возможной повышенной частотой наследственных нарушений метаболизма аминокислот (популяция риска). 1) Дети из специальных школ и детских садов в возрасте от 1 года до 16 лет (936 образцов). 2) Дети из интернатных школ для лиц с нарушениями слуха, речи и зрения (244 образца). II. Пациенты психиатрических больниц (595 образцов). III. Популяция амбулаторных и стационарных пациентов государственных больниц без раковых заболеваний (410 образцов). IV. Здоровые лица со всей территории Монголии (4108 образцов).
Сбор образцов мочи здоровых взрослых для скринингового анализа наследственных нарушений метаболизма аминокислот проводился по всей территории Монголии таким образом, чтобы были представлены все географические зоны страны. Монголия делится на четыре основных географических зон, а именно: зона пустынь, степная зона, лесная и горная зоны. Территория страны также делится на 18 административных единиц -областей (аймаков). Материал для настоящего исследования собирали в следующих десяти областях: Архангай, Тув, Булган, Сэлэнгэ, Завхан, Баянулгий, Дорнод, Сухбаатар, Умнуговь, Баянхонгор, а также в двух наиболее крупных городах страны - в Улаанбаатаре и Дархане (рис. 1 в Приложении).
Сбор образцов мочи здоровых взрослых был проведён в рамках летних научно-исследовательских экспедиций. Летом группы врачей и научно-исследовательских работников разъезжаются в разные части Монголии в зависимости от направления исследования и в полевых условиях проводят медицинский осмотр и исследование местного населения. Образцы мочи здоровых, использованные в настоящей работе, были собраны во время трёх летних экспедиционных сезонов от лиц, которые при осмотре врачами исследовательских групп были определены как практически здоровые.
Образы мочи популяции риска были собраны от детей из специальных школ и детских садов, осмотренных врачами этих учреждений, а также от взрослых пациентов различных больниц на основе диагноза их заболеваний и других данных из истории болезни.
Собирали утреннюю мочу у исследуемых с нормальным режимом питания.
Образцы крови для дифференциальной диагностики были собраны от пациентов с положительными результатами скринингового и подтверждающего анализов, а также от членов их семьи.
Образцы мочи и крови, собранные для анализа в настоящей работе, были нанесены и фиксированы на полосках фильтровальных бумаг, предназначенных специально для этой цели, фирмы Imuna, Sarisske Michalany.
Данный метод сбора материала был выбран в качестве наиболее подходящего метода, принимая во внимание условия при сборе материала и его сложную транспортировку из Монголии в Прагу. Образцы мочи собирались из разных областей (аймаков) Монголии, даже из самых отдалённых, которые находятся на расстоянии до 1300 километров от столицы Улаанбаатар, и куда не едет регулярный транспорт. Площадь территории, на которой проводился сбор образцов, составляет около 1,5 миллионов квадратных километров. Транспортировка материала из Монголии в Чехословакию также является весьма сложной. Эти факты были причиной выбора метода фиксации и хранения образцов [68, 69], подходящий для транспортировки на большие расстояния.
Образцы мочи и крови наносятся на полоски специальной фильтровальной бумаги и сушатся при комнатной температуре. Этим методом фиксированные образцы можно хранить в сухом, тёмном месте более 6 месяцев. Собирались образцы утренней мочи и капиллярной крови при нормальном питании.
Материалы и химикалии. Полоска специальной фильтровальной бумаги фирмы Imuna, Sarisske Michalany, одноразовая пипетка.
В целях популяционного скрининга была использована модификация метода нисходящей бумажной хроматографии [70, 71]: на хроматографической бумаге прокалывали 40-50 отверстий с диаметром 5 мм. В отверстия вставляли диски фильтровальных бумаг с фиксированными образцами для анализа тех же размеров, что и отверстия. Нисходящее разделение аминокислот проводилось в системе растворителей уксусная кислота - н-бутанол - вода в отношениях 1 : 4 : 5 в течение 16-18 часов. По окончании разделения аминокислот хроматограмма сушилась при комнатной температуре и проявлялясь с применением 0,4% раствора нингидрина в спирте.
Материалы и химикалии. Хроматографическая бумага Whatmann ЗММ размером 46 х 57 см, хроматографическая камера. Уксусная кислота, ч.д.а., н-бутанол, ч.д.а., нингидрин чистый фирмы Lachema, Brno, Chemapol, Praha.
Элюирование аминокислот из фильтровальных бумаг
4 диска, вырезанных из полосок фильтровальной бумаги с фиксированным образцом, помещали в пробирку, добавляли 100 мкл 50% водного раствора этанола и оставляли на ночь при комнатной температуре. Материалы и химикалии. Пробирка 1 мл, автоматическая микропипетка 100 мкл фирмы Finnpipette, Finland. Этанол 96%, аптека №30, Прага.
Количество образца, которое наносилось на тонкий слой микроцеллюлозы, определяли на основе концентрации креатинина в данном образце. Уровень креатинина измеряли на автоматическом анализаторе по принципу цветной реакции Яффе при 500 нм.
Материалы и химикалии. Автоматический анализатор Cobas Mira Plus фирмы Roche. Пикриновая кислота чистая, гидроксид натрия, ч.д.а., стандарт креатинина фирмы Lachema, Brno, Chemapol, Praha. Для того, чтобы содержание неорганических солей в натуральной моче не мешало эффективному разделению свободных аминокислот на тонком слое микроцеллюлозы, образец мочи деминерализовали на колонке катекса следующим способом [72]: 2 мл натуральной мочи наносили на колонку так, чтобы моча медленно протекала через колонку катекса. Аминокислоты сильно кислотного характера элюировали 10 мл воды, аминокислоты, связанные на катексе, промывали из колонки 8 мл 2М раствора аммиака. Элюат выпаривали под вакуумом при температуре 50С до полной сухости. Высушенный образец ратворяли непосредственно перед хроматографическим анализом в 400 мкл 50% водного раствора изопропанола. Материалы и химикалии.
Стеклянная колонка с диаметром 7 мм, вакуумный выпариватель В-490 фирмы Buchi, катекс Ostion KS, Общество химического и горнодобывающего производства, Usti nad Labem.
Аммиак 25%) водный раствор, ч.д.а., изопропанол, ч.д.а., фирмы Lachema, Brno, Chemapol, Praha.
I. Разделение аминокислот
В целях выбора подходящего метода разделения наиболее широкого спектра свободных аминокислот на тонком слое микорцеллюлозы были опробованы три различные системы растворителей [73, 74, 75].
Количество образца мочи, определённое на основе концентрации креатинина в данном образце, наносили с помощью микрошприца на стартовую точку в нижнем левом углу стеклянной пластинки с тонким слоем микрокристаллической целлюлозы на расстоянии 10 мм от краёв. При нанесении образца мочи пластинку держали под струёй сухого тёплого воздуха до полного испарения растворителя. Разделение свободных аминокислот проводили в стеклянной полунасыщенной хроматограф и чес кой камере. После хроматографирования в первой системе растворителей пластинку извлекали из камеры и сушили под струёй тёплого воздуха. При разделении аминокислот во второй системе растворителей пластинку поворачивали на 90 по отношению к направлению хроматографирования в первой смеси.
Системы растворителей.
Система А является подходящей для эффективного разделения свободных аминокислот. Разделение проводится по два раза в обоих смесях. Первая смесь: изопропанол - 5% раствор аммиака = 48 : 12. Два раза на 100 минут. Вторая смесь: н-бутанол - уксусная кислота - вода — 40 : 10 : 10. Два раза на 75 минут. Система Б является подходящей для общей ориентации. Разделение проводится два раза в первой смеси и один раз во второй смеси.
Бумажная хроматография
С помощью метода одномерной нисходящей бумажной хроматографии можно определить в биологической жидкости основных 19 свободных аминокислот (Рис. 2). На хроматограмме разделённые аминокислоты можно идентифицировать в следующем порядке от места нанесения образца: цистин, лизин, гистидин, аспарагин, глутамин, аргинин, аспарагиновая кислота, глицин, глутаминовая кислота, треонин, аланин, пролин, тирозин, триптофан, метионин, валин, фенилаланин, лейцин и, после воздействия высокой температуры, (3-аминоизомасляная кислота, которая находится в позиции между метионином и валином (Рис. 2 в Приложении). Пятна, в основном, фиолетового цвета разных оттенков, соответствующие отдельным аминокислотам, появляются в течение 30 минут после проявления хроматограммы раствором нингидрина, но не являются достаточно отчётливыми. После сушения при комнатной температуре в течение 2 часов уже можно идентифицировать все 19 разделённых аминокислот, кроме (3-аминоизомасляной кислоты. Эта аминокислота появляется на хроматограмме только после нагревания до 100С в течение 10 минут. В случае более длительного воздействия высокой температуры фон хроматограммы становится тёмным, что мешает идентификаии цветных пятен аминокислот.
Чувствительность бумажной хроматографии колеблется между 10-100 мкл для различных аминокислот. Метод является весьма простым по технике выполнения и не требует сложной лабораторной аппаратуры и дорогих химикалий. На одном листе хроматографической бумаги можно разделить до 50 образцов мочи или крови. За один раз можно вложить в одну хроматографическую камеру до 6 листов в зависимости от размеров камеры. Образцы мочи и крови, нанесённые и фиксированные на полосках специальной фильтровальной бумаги, не требуют сложной дополнительной обработки. Диски, наносимые на листы хроматографической бумаги, вырезываются прямо из полосок фильтровальной бумаги, с фиксированными образцами.
Метод одномерной нисходящей бумажной хроматографии является весьма подходящим методом для скринингового анализа больших количеств образцов. На бумажной хроматограмме здоровых лиц можно идентифицировать следующие аминокислоты: аланин, аспарагин, аспарагиновая кислота, Р-аминоизомасляная кислота, валин, гистидин, глицин, глутамин, глутаминовая кислота, лизин, лейцин, метионин, пролин, серии, тирозин, триптофан, треонин, фенилаланин и цистин. Отчётливо можно видеть пятна аминокислот между цистином и триптофаном. Доминирующими из них являются гистидин, аланин, глутамин и глицин. Аминокислоты метоинин, валин, фенилаланин и лейцин находятся в образцах в меньшем количестве.
Этот спектр свободных аминокислот, идентифицированных с помощью бумажной хроматграфии, является сравнительно постоянным для индивидуума. Исключение составляет 3-аминоизомасляная кислота, уровень которой весьма колеблется у разных лиц: тогда как в моче у одних здоровых она вообще отсутствует, другие же выделяют эту аминокислоту в в таком большом количестве, что она представляет доминирующий компонент на хроматограмме (Рис. З в Приложении).
Результаты исследования свободных аминокислот в моче с помощью бумажной хроматографии, проведённого Ягенбургом [3], а также Хиянеком [82], свидетельствуют, что среди аминокислот у европейцев доминируют глицин, аланин и глутамин. Также цистин, глутаминовая кислота, гистидин, серии и лизин встречаются весьма часто, хотя не в таком количестве, как предыдущие три аминокислоты. Доминирующие аминокислоты, идентифицированные в данных исследованиях, соответствуют нашим результатам за исключением гистидина, который является одним из четырёх аминокислот, встречающихся на бумажной хроматограмме монгольских образцов в наибольшем количестве.
Нетипичные результаты, обнаруженные скрининговым анализом в моче у группы из специальных школ и детских садов для умственно отсталых детей, показаны в табл. 3. В этом контингенте чаще всего обнаруженным отклонением в выделении свободных аминокислот оказалась гиперэкскреция Р-аминоизомасляной кислоты, идентифицированная у 54,7% детей с ментальной ретардацией. Следующим по частоте нарушением являлась вторичная гипераминоацидурия (Рис. 2 в Приложении) -повышенное выделение одновременно всех или некоторых групп аминокислот. Это отклонение может быть выражением расстройства обмена веществ или истощения организма, вызванного катаболизмом белков, но не является типичным для определённого нарушения метаболизма аминокислот. Далее в этой группе относительно часто было идентифицировано повышение уровня тирозина в моче, и также повышенное выделение лейцина и валина одновременно. В последнем случае главным компонентом рациона были молоко и молочные продукты. Повышенное потребление молочных белков могло быть причиной данной гиперэкскреции лейцина и валина. Случаи высокого уровня аланина, глицина, а также глутаминовой кислоты не являются значительными для диагноза.
Также в группе детей с нарушениями слуха и речи самым частым отклонением было повышенное выделение Р-аминоизомасляной кислоты, а затем вторичная гипераминоацидурия (Табл. 4). В этой группе были идентифицированы два случая повышенного цистина и лизина одновременно и один случай высокой концентрации цистина в моче.
Аминокислоты, определённые методом тонкослойной хроматографии
Типичная хроматограмма свободных аминокислот в элюированном образце мочи показана на рис. 4 в Приложении. Среди аминокислот, разделённых методом тонкослойной хроматографии, доминируют следующие пять из них: глутамин, глицин, серии, аланин и гистидин. В каждом элюате нормальной мочи присутствуют в меньшем количестве лизин, 1-мети л-гистидин, 3-метил-гистидин, глутаминовая кислота, треонин, тирозин, аспарагиновая кислота, лейцин и валин. Относительно часто можно видеть и слабые пятна, соответствующие аспарагину, метионину, фенилаланину, этаноламину и пролину.
Данный спектр аминокислот в элюате мочи является относительно постоянным. Только р-аминоизомасляная кислота составляет исключение: на некоторых хром ато граммах совсем отсутствует, а на некоторых является доминирующим компонентом.
Саркозин, карнозин, цитруллин и фосфоэтаноламин не были обнаружены в элюате нормальной мочи, но методом тонкослойной хроматографии их можно весьма удовлетворительно идентифицировать.
Результаты разделения свободных аминокислот в монгольских образцах с помощью тонкослойной хроматографии сходятся с данными других исследователей [3, 11], которые установили, что на тонкослойной хроматограмме доминируют глицин, гистидин, глутамин и аланин.
Привлекает внимание тот факт, что, хотя 3-метил-гистидин является типичным компонентом элюата мочи монгольских образцов, в большинстве случаев отсутствует в моче чешских пациентов. Выделение гистидина и его метилдериватов зависит от количества белков в пище. Особенно метилдериваты гистидина являются характерными для мочи лиц, потребляющих мясо. Данное различие в частоте встречаемости 3-метил-гистидина в монгольских и чешских образцах является, очевидно, результатом различия в главных продуктах питания, потребляемых этими популяциями.
Положительные случаи, обнаруженные скрининговым анализом, были проверены с помощью метода тонокослойной хроматографии. Результаты подтверждающего анализа в группах детей риска отражены в табл. 11, а в табл. 12 суммированы подтверждённые положительные случаи в группе здоровых и выборках пациентов психиатрических больниц, а также амбулаторных и стационарных отделений больниц общего профиля. Хроматограммы некоторых отклонений показаны на рис. 5 - рис. 7 в Приложении.
Большинство положительных результатов, обнаруженных методом бумажной хроматографии, были подтверждены анализом на тонком слое. Исключение составляют некоторые случаи вторичной гипераминоацидурии, когда образцы, нанесённые на тонкий слой микроцеллюлозы на основе уровня креатинина в данном образце, давали нормальную хроматограмму. Очевидно, в этих случаях причиной картины повышенного количества всех аминокислот одновременно была высокая концентрация мочи.
Наибольшее количество подтверждённых положительных случаев отклонения в выделении аминокислот было обнаружено, так же как и при скрининговом анализе бумажной хроматографией, в выборке пациентов из психиатрических больниц и группе пациентов амбулаторных и стационарных отделений. Среди последних 7 из 25 положительных результатов были идентифицированы у беременных женщин: три тирозинурии, три случая повышенного выделения аминокислот с низким значением Rf и один случай одновременного повышения уровня глутаминой кислоты и глутамина. Данные положительные случаи объясняются тем фактом, что при беременности происходят изменения в транспортном механизме аминокислот в почках, вследствие чего наблюдается повышение выделения большинства аминокислот, в особенности тирозина и гистидина [94].
Наименее частые, но зато наиболее разнообразные отклонения были обнаружены, как и ожидалось, в группе здоровых лиц.
Большинство подтверждённых положительных случаев не являлись типичными для некоторого определённого известного наследственного нарушения метаболизма аминокислот. Были в основном вторичного характера - причинами являлись особенности питания, принимаемые лекарства или же высокая концентрированность мочи.
Наиболее часто идентифицированным положительным результатом было повышенное выделение (3-аминоизомасляной кислоты. У каждого второго образца с потенциональным нарушением метаболизма аминокислот был определён повышенный уровень (3-АИМК. Как было подтверждено и методом бумажной хроматографии, повышенное выделение (3-аминоизомасляной кислоты не связано с повышенным выделением остальных аминокислот или с высокой концентрированностью мочи. Тогда как случаи гипераминоацидурии не были подтверждены анализом с помощью метода тонкослойной хроматографии, когда количество наносимого на тонкий слой образца вычислялось на основе уровня концентрированности данного образца, случаи же повышенного выделения (3-аминоизо масля ной кислоты, идентифицированные скрининговым анализом, были все подтверждены на тонком слое.
Наиболее изученным и наиболее часто встречающимся метаболическим отклонением в области аминокислот является фенилкетонурия. Однако ни скрининг бумажной хроматографией, ни подтверждающий анализ с помощью хроматографии на тонком слое не обнаружили случай повышенного выделения фениаланина, Этот результат противоречит с данными исследования Раднаабазар и Алтанцэцэг [67], которые обнаружили повышенный уровень фенилаланина у 2,5% детей с ментальной ретардацией и 0,4% исследованных новорожденных. Образцы крови 350 умственно отсталых детей и 582 новорожденных были анализированы с помощью экспресс -метода на фенилаланин с применением индикаторной бумажки Фенистикс. Этим методом идентифицируют феноловые соединения в общем, а не конкретно фенилпировиноградную кислоту, которая является характерной для фенилкетонурии. Тот факт, что экспресс-метод, использованный выше упомянутыми авторами, не является специфичным для фенилкетонурии и часто даёт ложно положительный результат, вероятно, объясняет данное противоречие.
