Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор Литературы 16
1.1. Генетические маркеры - общая характеристика. 16
1.2. Систематика и организация генома видов рода Triticum L. 21
1.3. Генетические маркеры пшеницы 23
1.3.1. Биохимические маркеры пшеницы 23
1.3.1.1. Биохимическая характеристика запасных белков 23
1.3.1.2. Структура белка глиадина и глютенина 25
1.3.1.3. Хромосомная локализация глиадин и глютенин кодирующих генов; полиморфизм и характер наследования запасных белков 27
1.3.1.4. Эволюция глиадинкодирующих генов 35
1.3.1.5 Амилаза зерна пшеницы 39
1.3.2. Молекулярные маркеры пшеницы 42
1.4. Применение генетических маркеров в исследованиях выполненных на пшенице 45
1.4.1. Использование генетических маркеров для идентификации сортов пшеницы 45
1.4.2. Генетическое разнообразие и динамики его изменения, генетической эрозия 49
1.4.2.1. Генетическое разнообразие 49
1.4.2.2. Динамика изменения генетического разнообразия пшеницы 56
1.4.3. Использование генетических маркеров при сохранении материала пшеницы в коллекциях ex situ и on farm 60
1.4.4. Использование генетических маркеров при изучении происхождения, эволюции и филогении пшеницы. 66
1.4.4.1. Применение изоферментных маркеров в филогенетических исследованиях 67
1.4.4.2. Применение запасных белков, как генетических маркеров в филогенетических исследованиях 68
1.4.4.3. Применение молекулярных маркеров в филогенетических исследованиях 71
1.4.5. Использование генетических маркеров в селекционной практике 75
Глава 2. Материалы и методы 86
2.1. Растительный материал 86
2.2. Лабораторные методы 88
2.2.1. Приготовление образцов 88
2.2.1.1. Экстракция глиадина 88
2.2.1.2. Экстракция глютенина 89
2.2.1.3. Экстракция а-амилаз 89
2.2.1.4. Выделение ДНК 89
2.2.1.5. Приготовление образцов ампликонов микросателлитной ДНК для нанесения на денатурирующий полиакриламидный гель . 90
2.2.2. Проведение полимеразной цепной реакции 91
2.2.2.1 Проведение полимеразной цепной реакции при RAPD анализе 91
2.2.2.2. Поведение полимеразной цепной реакции при анализе полиморфизма микросателлитных локусов 91
2.2.3. Электрофорез 91
2.2.3.1. Нативный одномерный Электрофорез глиадина в кислом (рН 3,1) полиакриламидном геле 92
2.2.3.2. SDS-Электрофорез глютенина в полиакриламидном геле 92
2.2.3.3 Двумерный электрофорез глиадина в полиакриламидном геле 93
2.2.3.4. Электрофорез а-амилаз в полиакриламидном геле 93
2.2.3.5. Электрофорез RAPD - фрагментов ДНК в агарозном геле .94
2.2.3.6. Электрофорез фрагментов микросателлитной ДНК в денатурирующем полиакриламидном геле 95
2.2.4. Оценка признаков линий сорта Харьковская 7 95
2.2.5. Математические методы обработки полученных данных: 91
2.2.5.1. Оценка соответствия фактического расщепления в гибридах F2 теоретически ожидаемому. 97
2.2.5.2. Определение величины сцепления между локусами генов 97
2.2.5.3. Статистическая обработка данных количественных признаков линий сорта Харьковская 7 98
2.2.5.4. Оценка генетического разнообразия сортов и образцов твердой пшеницы 98
Глава 3. Генетические маркеры твердой пшеницы, хромосомная локализация, наследование и полиморфизм ... 101
3.1. Глиадины t ...101
3.1.1. Хромосомная локализация глиадинкодирующих генов твердой пшеницы ...102
3.1.2. Характер наследования глиадинкодирующих генов твердой пшеницы ... 103
3.1.3. Полиморфизм по локусам глиадинкодирующих генов твердой пшеницы и генетическая номенклатура для их обозначения ... 108
3.1.3.1. Полиморфизм по локусам глиадинкодирующих генов отечественных сортов твердой пшеницы (сортов, созданных в бывшем СССР и России) ...ПО
3.1.3.2. Полиморфизм по локусам глиадинкодирующих генов в сортах твердой пшеницы Италии ... 115
3.1.3.3. Полиморфизм по локусам глиадинкодирующих генов в сортах и образцах твердой пшеницы Эфиопии ... 121
3.1.3.4. Полиморфизм по локусам глиадинкодирующих генов в сортах твердой пшеницы из коллекции ICARDA ... 122
3.1.4. Сводный каталог аллельных вариантов блоков компонентов глиадина твердой пшеницы и его использование при идентификации аллелей в ранее не изученных сортах. Маркерные сорта ... 125
3.1.5. Семейства блоков компонентов глиадина у твердой пшеницы ... 135
3.2. Глютенины твердой пшеницы; Хромосомный контроль и полиморфизм по локусам глютенинкодирующих генов ... 13 8
3.3. Полиморфизм а - амилазы твердой пшеницы 141
3.4. Гены, контролирующие морфологические признаки колоса твердой пшеницы - опушение (Hg) и окраску (Rgl) ... 142
3.5. Полиморфизм твердой пшеницы по ДНК маркерам ...148
3.5.1. Полиморфизм твердой пшеницы по RAPD маркерам ... 148
3.5.2. Полиморфизм твердой пшеницы по SSR маркерам ...151
3.6. Обсуждение результатов ... 15 5
Глава 4. Идентификация сортов твердой пшеницы, их гомогенность и гетерогенность. Разнородность биотипов гетерогенных сортов в отношении хозяйственно-значимых признаков ... 162
4.1. Использование генетических маркеров при определении сортовой чистоты и сортового соответствия коммерческих партий семян сортов твердой пшеницы ... 162
4.1.1. Идентификация сортов твердой пшеницы на основании полиморфизма по глиадину ... 162
4.1.2. Использование молекулярных маркеров для идентификации сортов твердой пшеницы ... 163
4.1.3. Анализ сортового соответствия и наличия чужеродных примесей по глиадиновым маркерам. Автоматизация метода ... 164
4.2. Гетерогенности сортов твердой пшеницы ... 171
4.3. Разнородность биотипов в отношении хозяйственно - значимых признаков. Использование блоков компонентов глиадина в качестве . маркеров показателей качества продуктов переработки твердой пшеницы ...175
4.3.1. Сравнение биотипов сорта Харьковская 7 по количественным признакам, характеризующим структуру колоса и по урожайности 177
4.3.2. Сравнение биотипов сорта Харьковская 7 по показателям, характеризующим качество клейковины ... 180
4.4. Обсуждение результатов ... 182
Глава 5. Биоразнообразие твердой пшеницы и динамика его изменения ...189
5.1. Анализ биоразнообразия твердой пшеницы с использованием белковых маркеров ... 189 5.1.2. Изучение генетических расстояний в коллекциях сортов твердой пшеницы с использованием глиадиновых маркеров. Связь полиморфизма по глиадину с родословными сортов ... 195
5.2. Анализ биоразнообразия твердой пшеницы с использованием SSR и RAPD маркеров ...198
5.2.1. RAPD анализ ...200
5.2.2. SSR анализ ...209
5.3. Обсуждение результатов .. 216
Глава 6. Использование генетических маркеров в филогенетических исследованиях рода Triticum L. .. 223
6.1. Сравнение блоков компонентов глиадина, контролируемых у пшениц хромосомой 1А ...223
6.2. Сравнение блоков компонентов глиадина, контролируемых хромосомой 6А .. 225
6.3. Сравнение блоков компонентов глиадина, контролируемых у мягкой и твердой пшеницы гомологичными хромосомами В генома .. 228
6.4. Сравнение а-амилазы мягкой и твердой пшеницы ...230
6.5. Обсуждение результатов 231
Выводы ...237
Заключение ...243
Список литературы
- Хромосомная локализация глиадин и глютенин кодирующих генов; полиморфизм и характер наследования запасных белков
- Приготовление образцов ампликонов микросателлитной ДНК для нанесения на денатурирующий полиакриламидный гель
- Характер наследования глиадинкодирующих генов твердой пшеницы
- Идентификация сортов твердой пшеницы на основании полиморфизма по глиадину
Введение к работе
з
Актуальность темы диссертационной работы
Твердая пшеница Т. durum Desf. является важнейшей сельскохозяйственной культурой занимающей по посевным площадям среди пшениц второй место в мире после мягкой пшеницы. Однако этот вид остается относительно неисследованным с точки зрения генетики. Только в последнее время появились работы, касающиеся вопросов генетического маркирования сортов твердой пшеницы (с использованием ДНК маркеров), вопросов ее происхождения и биоразнообразия. Создание системы генетических маркеров для твердой пшеницы, адекватно отражающей и описывающей биологическое разнообразие вида, позволяет быстрее и проще решать ряд задач чисто научного и прикладного характера, встающих перед исследователями, работающими с этой культурой. К таким задачам можно отнести:
Идентификацию генотипа (сортовая идентификация);
Изучение биотипного состава гетерогенных сортов и популяций;
Оптимизацию сохранения коллекций пшениц ex situ в семенных банках;
Генетический мониторинг популяций при сохранении on farm;
Описание биоразнообразия и динамики его изменения;
Сравнение географически разделенных популяций;
Изучение филогении пшениц и родословных сортов;
Маркирование генов хозяйственно-значимых признаков и маркер-ассошшрованный отбор в селекционной практике;
Идентификацию чужеродных примесей и очистку от них сортов в процессе семеноводства.
Адекватная система генетических маркеров может быть использована также для решения многих других задач генетики и селекции твердой пшеницы, в частности, для быстрого анализа коллекций, на предмет поиска доноров новых генов интересных в хозяйственном отношении. Важным вопросом практического использования систем генетических маркеров остается вопрос "квалификации персонала" - исследователей, обладающих достаточным опытом работы и конкретным знанием всего разнообразия маркеров, составляющих систему. В связи с этим актуальным остается вопрос создания компьютеризированных систем и программ, позволяющих автоматизировать процесс распознания аллсльных вариантов генетических маркеров в генотипах сортов.
\
Цель и задачи исследования
Основной целью диссертационной работы являлось создание системы генетических маркеров яровой твердой пшеницы (Г. durum Desf.), объединяющей взаимодополняющие маркеры разной природы (гены, белки, ДНК) и пригодной для решения разнообразных задач при проведении научных исследований или реализации практических разработок, выполняемых па этой культуре. Исходя из цели работы, были поставлены следующие задачи:
Определить хромосомный контроль и характер наследования генов запасных белков зерновки - глиадинов и глютенинов. Описать полиморфизм по локусам глиадин и глютенинкодирующих генов у сортов и форм яровой твердой пшеницы.
Описать полиморфизм яровой твердой пшеницы по изоформам фермента а-амилазы.
3. Провести анализ генетического сцепления между биохимическими маркерами
(глиадинами) и морфологическими маркерами (генами, определяющими окраску и
опушение колоса).
Провести анализ и описание полиморфизма твердой пшеницы по RAPD маркерам и определить праймеры, максимально выявляющие межсортовое разнообразие у этой культуры.
Провести анализ и описание полиморфизма сортов яровой твердой пшеницы по микросателлитным (SSR) локусам и определить наиболее полиморфные из них.
Показать возможность применения выявленных маркеров в качестве удобного инструмента при проведении научных исследований в области описания и сохранения бпоразнообразия твердой пшеницы, а также в филогенетических исследованиях.
Показать применимость данных маркеров при решении практических задач народного хозяйства и их использование в селекции и семеноводстве.
Разработать подходы к автоматизации методов распознавания генетических маркеров белковой природы по их электрофоретическим спектрам.
Научная новизна
Впервые проведено изучение генетического контроля и характера наследования глиадина (запасного белка зерновки) у твердой пшеницы Т. durum Desf. Выявлено четыре глиадинкодирующих локуса, расположенных на хромосомах первой и шестой гомеологических групп. Показан сцепленный характер наследования компонентов глиадина, контролируемых генами, входящими в один локус. Описан полиморфизм глиадина и составлен каталог аллельных вариантов блоков компонентов глиадина. Выявлены семейства блоков компонентов глиадина твердой пшеницы. Показано, что
5 аллели глиадинкодирующих генов могут быть использованы в селекционном процессе в качестве генетических маркеров ряда хозяйственно значимых признаков (качества продуктов переработки твердой пшеницы). Эти же маркеры могут быть использованы при идентификации сортов и определения их чистоты в семеноводстве - созданы каталоги эталонных спектров сортов твердой пшеницы, районированных в России.
Впервые описан полиморфизм твердых пшениц по изоферменту а-амилаза.
Впервые установлена величина генетического сцепления между генами, контролирующими морфологические признаки колоса (его окраску и опушение) и локусами глиадинкодирующих генов. Показана возможность использования морфологических генов в качестве маркерных в селекционном процессе при селекции на качество.
Впервые изучен полиморфизм российских твердых пшениц с использованием ДНК маркеров - SSR и RAPD и проведено сравнение кластеризации по генетическому родству, вычисленному на основании этих маркеров, с кластеризацнями, проведенными на основании коэффициентов родства по родословным. Показана "условная" возможность использования RAPD и невозможность использования SSR маркеров при анализе родословных сортов твердых пшениц.
Впервые с помощью глиадиновых маркеров показаны высокая степень родства А геномов у твердой пшеницы и других представителей рода и менее близкое родство их В геномов. Высказана и подтверждена экспериментально гипотеза о полифилстическом происхождении А генома полиплоидных пшениц.
Впервые применен метод использования искусственных нейронных сетей при анализе электрофоретических спектров глиадина. Доказана принципиальная возможность автоматизации процесса расшифровки электрофоретических спектров глиадина, что открывает путь к автоматизации процесса идентификации сортов пшеницы и их сортовой чистоты в системе семенного контроля.
Практическая ценность работы
Генетические маркеры, выявленные и описанные в работе, могут быть успешно применены в различных областях научной и хозяйственной деятельности, так или иначе связанных с использованием или изучением твердой пшеницы:
В области частной и популяиионной генетики твердой пшеницы данная система перспективна при картировании различных генов, для маркирования участков хромосом, при изучении популяционной структуры и динамики ее изменения в
пространстве и времени у групп сортов и местных форм, при изучении родословных сортов и филогении рода Triticum L. в целом, а также в ряде других областей.
В области сохранения биоразнообразия твердой пшеницы данная система позволяет оптимизировать методы сохранения коллекций ex situ и on farm, снизить затраты труда и контролировать динамические популяционные процессы, происходяшие в этих коллекциях.
В области селекции использование данной системы позволяет проводить предварительный скрининг коллекций сортов и образцов для поиска доноров новых аллелей генов хозяйственно-цепных признаков, при селекции твердой пшеницы на качество п при создании гепетически выровненных, однородных сортов.
В области семеноводства предложенные генетические маркеры могут быть полезны при отборе типичных растений (для гетерогенных сортов - в заданных пропорциях биотипов), при закладке первичного питомника размножения, а также для контроля чистоты ведения семеноводческого процесса на всех его стадиях, начиная от суперэлиты и кончая последними репродукциями.
В области торговли семенами и товарным зерном наиболее очевидное применение данной системы и, в первую очередь, глиадиновых маркеров, связано с определением сортовой чистоты и сортового соответствия коммерческих партий семян (зерна). Разработка основ автоматизации анализа электрофорстических спектров глиадина с применением искусственных нейронных сетей позволяет вплотную подойти к созданию приборного комплекса и программного обеспечения, пригодного для использования в региональных лабораториях семенного контроля персоналом, не обладающим специальными знаниями в области генетики запасных белков.
Основные положения, выносимые на защиту
Создана система генетических маркеров твердой пшеницы (Г. durum Desf.), объединяющая взаимодополняющие маркеры разной природы: биохимические (белки -запасные белки глиадин и глютешш, изофермент а-амнлаза), морфологические (гены, определяющие морфологические признаки колоса окраску и опушение) и молекулярные (фрагменты ДНК - RAPD маркеры и микросателлитные маркеры (SSR)), которая позволяет успешно решать ряд научных и практических задач, связанных с изучением и использованием этого вида.
Полиморфные запасные белки зерна - і л падины являются наиболее удобными генетическими маркерами для идентификации сортов твердой пшеницы и оценки сортовой чистоты партий коммерческих семян этой культуры.
Генетическая гетерогенность сортов и популяций твердой пшеницы является важным компонентом биоразнообразия этого вида, сохранение которого, в настоящее время, практически невозможно без постоянного мониторинга, проводимого с использованием системы генетических маркеров.
Применение искусственных нейронных сетей на настоящий момент является наиболее приемлемым подходом к автоматизации распознания аллельных вариантов блоков компонентов глнадина в электрофоретических спектрах сортов твердой пшеницы, что, в свою очередь, открывает возможности автоматизации методов оценки сортового соответствия и сортовой чистоты в партиях семян этой культуры.
В современных сортах твердой пшеницы наблюдается снижение генетического разнообразия но сравнению с разнообразием, наблюдаемым в популяциях местных сортов этого вида и у мягкой пшеницы. Это, с одной стороны, вызвано жесткими технологическими требованиями, предъявляемыми к этой культуре, с другой стороны -активной политикой международных селекционных центров, продвигающих в производство свои перспективные линии.
При выборе генетических маркеров, адекватно описывающих биоразнообразие сортов твердой пшеницы и, особенно, генетические расстояния между сортами, необходимо проводить дополнительные исследования, поскольку разные типы маркеров могут дать разные, порой противоречивые результаты. Данное явление, по видимому, отражает мозаичность структуры генома и относительную независимость путей эволюции признаков, контролируемых его не сцепленными участками.
Филогенетически А геномы твердой и мягкой пшениц близки. Они полифилитичны по своему происхождению, то есть происходят от нескольких диплоидных доноров (сходных у этих видов) и попали в полиплоидные пшеницы в результате нескольких актов аллополиплоидизации.
Апробация работы Результаты работы были доложены: а) В устных докладах на конференциях:
4-6 октября 2001г. (С. Петербург) PENGIB 2 (Pan European Network on Genetic Indicators of Biodiversity (second workshop)) - лекция "A comparison of the genetic distances between Russian durum wheat varieties calculated using RAPD method and the pedigree analysis"
Man 2002 г. (Москва) копф. "Информационно-вычислительные техпологии в решении фундаментальных научных проблем и прикладных задач химии, биологии, фармацевтики и медицины" (ИВТН-2002) - доклад «Создание генетических баз
8 данныхи экспертных систем для решения прикладных задач генетики и селекции сиспользованием нейросетевых технологий». Москва Май 2002) (совместно с Руанетом В.В. и Дадашевым С.Я.)
9 декабрь 2005 г. (Москва) Седьмое Вавиловское чтение - лекция «Экспедиция Н.И. Вавилова в 1929 г. и современность:"Эфиопия 80 лет спустя"».
8-10 ноября 2006 г. (С.-Петербург) II Международный конгресс «Зерно и хлеб России» - доклад: «Перспективы использования метода электрофореза глиадина в системе контроля сортовой чистоты семян пшеницы» (совместно с Драгович А.Ю. и Упелниеком В.П.)
4 - 5 декабря 2006г. (Москва) Третья международная научно-практическая конф. «Актуальные вопросы инновационной деятельности в биологии и медицине»- доклад «Анализ сортового соответствия зерна» (совместно с Янковским Н.К.)
В виде постерных сообщений на следующих симпозиумах, конференциях и съездах: АН-Union cereal crops biotechnology conference (Alma-Ata, USSR,1988); Седьмой всесоюзный симпозиум «Молекулярные механизмы генетических процессов» (Москва, СССР, 1990); Seminar on Durum Wheat Quality in the Mediterranean Region, Zaragoza (Spain), 17-19 November 1993; Convegno annuale Societa' Italiana di Genetica Agraria Italy (1995, 1996, 2006); The International Conference on Science and Technology for Managing Plant Genetic Diversity in the 21st Century" (SAT 21), 12-16 June 2000, Kuala Lumpur, Malaysia; VIII Съезд генетиков и селекционеров республики Беларусь, 23-25 июля 2002 г., г. Минск; 2-я конференция Московского общества генетиков и селекционеров им. Н.И. Вавилова «Актуальные проблемы генетики», посвященная 115 - летаю со дня рождения академика Н.И. Вавилова, Москва 20-21 февраля 2003 г, 10th International Wheat Genetic Symposium, Paestum, Italy 1-6 September 2003.
в) В лекциях, прочитанных по приглашениям зарубежных коллег (с оплатой за счет принимающей стороны):
Июль 1993 год, Италия, Университет г. Палермо и Институт зерновых культур -секция Сант-Анджело Лодиджиапо (Милан) - лекция "The blocks of durum wheat gliadin components and their use as genetic markers".
Сентябрь 1995 г. Италия, Институт Агрономии заморских стран лекция: "The genetic markers of wheat and their use in breeding process: I - Gliadin and Glutenin genes"
Июль 1998 г., Италия, Университет Флоренции, факультет сельского хозяйства лекция The study of lethal and gliadin-coding genes in connection with use and conservation of wheat biodiversity (совместно с В. А. Пухальским)
9 4. Октябрь 2004 г., Китай, Пекинский сельскохозяйственный колледж - лекция "Genetic Markers of Wheat and their use in breeding practice and genetic researches" г) На межлабораторных семинарах ИОГен РАН
Личный вклад автора
Все результаты представленные в работе получены при непосредственном личном участии автора в период с 1985 по 2006 год в результате научных исследований, проведенных им в Инстіггуте общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, в Институте агрономии заморских стран (Флоренция, Италия), а также на базе лабораторий, участвовавших в международных научных проектах. Автор приносит глубокую благодарность С.Я. Дадашеву, Н.Н. Илличевскому, СП. Мартынову, В.В. Руанету и В.П. Упелниеку, в тесном сотрудничестве с которыми были выполнены некоторые разделы работы. Особую признательность автор выражает д.б.н., профессору В.А. Пухальскому за его многолетнюю поддержку всех исследований, выполненных по теме работы, а также за критические замечания и полезные советы, высказанные в процессе написания данного труда.
Структура и объем диссертации
Хромосомная локализация глиадин и глютенин кодирующих генов; полиморфизм и характер наследования запасных белков
Для глиадина пшеницы свойствен высокий уровень межсортового полиморфизма, выражающийся в том, что практически каждый сорт пшеницы имеет свой собственный и уникальный электрофоретический спектр (Созинов, Попереля, 1979; Wrigley et al, 1982). Анализ анеуплоидных линий сорта Chinese Spring (Sears, 1954, 1966) позволил установить хромосомную локализацию глиадинкодирующих генов у мягкой пшеницы. При этом использовался следующий принцип: если отсутствие некоторой пары гомологичных хромосом (плеч) у анеуплоидной линии сопровождается удалением из электрофоретического спектра глиадина эуплоидной Chinese Spring каких-то компонентов, то, следовательно, гены, контролирующие синтез этих компонентов, расположены в отсутствующих у данной линии хромосомах или их плечах. Первое исследование 33 нулли-тетрасомных, 21 дителосомных линий и 7 замещенных линий сорта Chinese Spring показало, что 7 из 15 электрофоретических компонентов глиадина (электрофорез в 12%-ном крахмальном геле в алюминий-лактатном буфере, рН 3,2) контролируются индивидуальными генами, расположенными в коротких плечах хромосом первой и шестой гомеологических групп (Shepherd, 1968). Позднее для подобного анализа был использован метод двумерного электрофореза (изоэлектрофокусирование + электрофорез в алюминий-лактатном буфере, рН 3,2), который позволил разделить суммарный глиадин сорта Chinese Spirng на 45 индивидуальных компонентов и установить хромосомную локализацию 33 из них (Wrigley, Shepherd, 1973). Анализ 399 гибридов F2 от скрещивания эуплоидных и дителоцентрических линий сорта Chinese Spirng показал, что рекомбинация между глиадинкодирующим локусом хромосомы 1В и ее центромерой составляет 42%. Это свидетельствует о том, что данный локус расположен в дистальном участке короткого плеча хромосомы 1В (Рыбалка, Созинов, 1979). Данный результат был подтвержден позднее. Анализ гибридов от скрещиваний, в которых в качестве одного из родителей участвовали либо дителоцентрик сорта Chinese Spring, либо линии с транслокациями плеч ржаных хромосом, показал, что расстояние между глиадинкодирующим локуссм хромосомы 1В и центромерой составило 41,6% рекомбинации (59,7 сМ) (транслокационное картирование) или 40,4% рекомбинации (56,1 сМ) (телоцентрическое картирование) (Singh, Shepherd, 1988). В другой работе, из сорта мягкой пшеницы Норе был выделен мутантный генотип, в электрофоретическом спектре глиадина которого отсутствуют компоненты, контролируемые хромосомой 1В. Было показано, что у мутанта произошла делеция части хромосомы 1В, причем разрыв образовался в зоне вторичной перетяжки ядрышкового организатора, что свидетельствует о расположении локуса GU В1 на сателлите короткого плеча хромосомы 1В. Расстояние между локусом глиадинкодирующих генов GU-B2 и центромерой было определено в 55 сМ (Payne etal., 1984с).
Генетический контроль глиадина у сорта Chinese Spring изучался также с помощью метода высокоразрешающей жидкостной хроматографии. Было получено разделение общего глиадина на 35 пиков. Сравнение профилей различных анеуплоидных линий показало, что все со-глиадины, большинство у глиаДИН0В и некоторые Р-глиадины контролируются первой гомеологическои группой хромосом, а все а-глиадины, большинство (3-глиадинов и некоторые из у-глиадинов контролируются шестой гомеологическои группой (Bietz, Burnof, 1985). Эти результаты соответствуют результатам, полученным с помощью электрофоретических методов разделения глиадина (Shepherd, 1968; Wrigley, Shepherd, 1973).
Для установления хромосомной локализации глиадинкодирующих генов пшеницы были использованы также замещенные линии, у которых одна хромосома изучаемого сорта замещена на хромосому другого сорта. Показано, что у мягкой пшеницы замещение хромосом первой и шестой гомеологических групп приводит к исчезновению в электрофоретическом спектре изучаемого сорта присущих ему компонентов и появлению компонентов, характерных для сорта донора замещающих хромосом (Payne etal, 1982).
Приготовление образцов ампликонов микросателлитной ДНК для нанесения на денатурирующий полиакриламидный гель
Образцы пшеницы перед выделением из них ДНК предварительно оценивались на гомогенность по глиадину (исследовались половинки зерновок), после чего гетерогенные образцы разделялись на биотипы. Половинки зерен с зародышем выращивались в стерильных условиях 5-7 дней.
Выделение тотальной ДНК пшеницы производили микрометодом (Edwards et al., 1991; Дорохов и Клоке, 1997) из тканей молодых листьев или проростков - один образец от одного биотипа (3-5 растений), выявленного предварительно на основании анализа полиморфизма образца по глиадину.
Свежую растительную ткань гомогенизировали в пробирке типа Eppendorf объемом 1,5 мл в 400 мкл горячего (65 С) экстракционного буфера (200 мМ трис-HCl, рН 7,5; 250 мМ NaCl; 25 мМ EDTA; 0,5% SDS). Гомогенизацию заканчивали интенсивным встряхиванием на Vortex в течение 5 сек. Экстракция проводилась при 65С в течение 15 мин., после чего добавляли по 200 мкл 5М ацетата калия (предварительно охлажденного в морозильной камере), тщательно перемешивали и инкубировали на ледяной бане 10 мин. После центрифугирования в течение 20 мин. в настольной центрифуге типа Eppendorf (16000g) осторожно отбирали 500 мкл супернатанта и переносили в новую пробирку, к нему затем добавляли 500 мкл изопропанола и оставляли при комнатной температуре на 3-5 мин. Содержимое пробирки центрифугировали при комнатной температуре в течение 10 мин (16000g) . Осадок промывали 70% этанолом (охлажденным до -20С) и центрифугировали в течение 10 мин (16000g). Осадок просушивали и растворяли в 50 мкл стерильной дистиллированной воды. Определение концентрации ДНК в образце проводили методом спектрофотометрии на спектрофотометре BECKMAN К-100. Для работы использовалась ДНК с OD 260/280 1.5.
В PCR пробирку, содержащую продукты амплификации микросателлитной ДНК, добавляли равный объем краски, содержащей 98% Формамида; ЮтМ EDTA; 1 мг/мл красителя бромфенолового синего и 1 мг/мл красителя ксиленцианола. Перед нанесением на электрофорез образцы денатурировали в течение 5 минут при 100 С на водяной бане, а затем сразу же помещали в лед.
Реакцию RAPD-PCR проводили на амплификаторе PERKIN ELMER CETUS Gene Amp PCR System 9600. Объем реакционной смеси 15 мкл содержал 250 пМ каждого праймера, 0,2 тМ каждого дезоксинуклеотида, 1,5 mM MgC12, 1 единицу Taq полимеразы и 100 ng ДНК. Программа амплификации: 94 - 4 мин.; 40 циклов: [94 - 30 сек.; 36 - 45 сек.; 72 -2 мин.]; 72 - 10 мин. Для RAPD анализа использовали коммерческие 10-членные олигонуклеотидные праймеры фирмы Operon Technologies, Alameda (США) (серии ОРА, OPD, OPE, ОРН, OPN).
Реакцию SSR - PCR проводили на термоцикл ере PERKIN ELMER CETUS Gene Amp PCR System 9600. Объем реакционной смеси 20 цМ содержал 250 пМ каждого праймера, 0,2 тМ каждого дезоксинуклеотида, 1,5 mM MgCb, 1 единицу Taq полимеразы и 150 ng ДНК. Программа амплификации: 94 - 4 мин.; 40 циклов: 94 - 1 мин.; 60 (50 или 55 С в зависимости от типа праймера) - 1 мин.; 72 -1 мин.; 72 С - 10 мин. В качестве праймеров использовали предварительно отобранные наиболее информативные праймеры (26 пар праймеров) серии Xgwm (Roder et al., 1998).
Одномерный электрофорез глиадина в полиакриламидном геле (ПААГ) проводили согласно принятой методике (Bushuk, Zillman, 1978) с модификациями, принятыми в лаборатории (Metakovsky, Novoselskaya, 1991) для вертикальных пластин (1,8мм х 140мм х 150мм). Раствор геля содержал 8,3%) акриламида, 0,4% метиленбисакриламида, 0,1 % аскорбиновой кислоты и 0,001 % Fe2(S04)3- Полимеризацию осуществляли путем добавления в раствор геля перекиси водорода (9-15 мкл). Электрофорез проводили в 0,005М алюминий - лактатном буфере (рН 3,1), в течение 3 часов при постоянном напряжении 550 В. Температура буфера в начале электрофореза составляла 4-8С и затем повышалась до 25-30С. При этом сила тока увеличивалась от 50 до 200 мА. После окончания электрофореза гели фиксировали в 10% растворе трихлоруксусной кислоты (ТХУ) не менее 20 минут и затем окрашивали в течение ночи в растворе, содержащем 0,04% Кумасси R-250 и 10% ТХУ. После окраски гели промывали проточной водой и фотографировали в проходящем рассеянном свете на фотопленку Микрат-300, или сканировали в проходящем свете.
Характер наследования глиадинкодирующих генов твердой пшеницы
Характер наследования компонентов глиадина сорта Langdon был определен при анализе зерен F2, полученных от скрещивания сортов Langdon х Леукурум 1805. Сорт Леукурум 1805 (далее Л1805) был подобран в качестве пары в скрещивание к сорту Langdon, поскольку у этих сортов наблюдается наименьшее перекрывание компонентов электрофоретических спектров. Анализ 75 зерен F2 показал, что все компоненты, за которыми можно следить в расщепляющихся спектрах потомства, и которые контролируются у сорта Langdon генами, расположенными на одной хромосоме, всегда наследуются сцеплено, блоками, то есть всегда либо присутствуют вместе, либо отсутствуют в спектрах зерен F2. Так, например, на рис.2 видно, что компоненты 1, 2"(нижняя часть двойного компонента 2) и компонент 8 всегда вместе отсутствуют в электрофоретических спектрах гибридов (рис.2, дор. 1, 2, 6, 7) или же вместе присутствуют (в остальных случаях), т. е. представляют собой блок. Отсутствие этого блока в спектре зерен F2 всегда сопровождается интенсивным проявлением компонента 4 сорта Л1805. В том случае, когда в спектре присутствует и данный блок Langdon, и компонент 4 сорта Л1805, все эти компоненты проявляются несколько слабее, чем когда присутствует только либо группа компонентов Langdon, либо компонент 4 сорта Л1805. Это позволяет предположить, что указанная группа компонентов и компонент 4 контролируются аллельными генами. Фактическое распределение зерен F2 по фенотипическим классам (20 зерен, имеющих в спектре блок Langdon : 33 зерна, имеющих в спектре оба блока, т.е гетерозиготы, 22 зерна, имеющих в спектре только компонент 4, достаточно хорошо соответствовало теоретически ожидаемому соотношению 2 1:2:1 (/ =1,18; 7 0,50), что доказывает аллельность и кодоминантность генов, контролирующих группу компонентов 1, 2", 8 сорта Langdon и компонент 4 сорта Л1805. Следует отметить, что, ввиду триплоидности эндосперма пшеницы, наблюдается два типа гетерозигот: тип 1, когда в двойной дозе присутствуют компоненты 1, 2", 8 сорта Langdon, а компонент 4 от Л1805 - в одной дозе (рис.2, дор. 5, 12 и др.), и тип 2, когда в двойной дозе компонент 4, а группа компонентов Langdon в одной дозе (дор. 3, 11, 13). Наиболее интенсивная (тройная) доза присуща гомозиготам (дор. 15 и 2). В подразделе 1.1.1. было показано, что компоненты 1, 2", 8 кодируются генами, расположенными в хромосоме 1А. Поскольку эта группа компонентов наследуется аллельно с компонентом 4 сорта Л1805, постольку ген, кодирующий этот компонент, также расположен в хромосоме 1А. В спектре глиадина Л1805 не было найдено компонентов, наследующихся сцеплено с компонентом 4. Компонент 12 спектра Langdon, который кодируется у этого сорта геном, расположенным в хромосоме 1А (рис.16), не был включен в блок, поскольку в данном скрещивании следить за характером его наследования было невозможно (рис.2).
Подобным образом, как это было сделано с компонентами, кодируемыми генами хромосомы 1А, проведен анализ наследования компонентов 2 (верхняя часть двойного компонента 2), 3, 4, 6, 7, 15, 16, которые у Langdon контролируются генами, расположенными в хромосоме 1В. Установлено, что эти компоненты (за исключением компонента 6, идентификация которого на всех электрофореграммах оказалась затрудненной) наследуются сцеплено (блоком). Сцеплено с этой группой наследуется и компонент 5 (хромосомный контроль которого не был установлен при работе с дисомно-замещенными линиями так как на него накладывался компонент ID сорта Chinese Spring), что позволило локализовать кодирующий его ген в хромосоме 1В. Выделена также группа сцепленно наследующихся компонентов 1, 2, 3 сорта Л1805. Гены, контролирующие синтез этих компонентов и компонентов 2 , 3, 4, 5, 6, 7, 15 и 16 сорта Langdon, аллельны. Действительно, на рис. 2 можно видеть типы электрофоретических спектров, различающиеся по присутствию или отсутствию этих групп компонентов: гомозиготы по блоку Langdon (дор. 1, 13); гетерозиготы с двойной дозой блока Langdon (дор. 2, 3, 11 и др); гетерозиготы с двойной дозой блока Л1805 (дор. 5, 6, 15 и др.); гомозиготы по блоку Л1805 (дор. 10, 12, 14). Фактическое распределение зерен F2 по этим фенотипическим классам (разные гетерозиготы объединены в один класс) (15 : 41 : 19) хорошо соответствует теоретически ожидаемому 2 распределению 1:2:1 (/ =1,07; Р 0,50), что статистически подтверждает аллельность указанных групп компонентов.
В данном скрещивании возможно было проследить наследование только одного компонента (компонент 13) с установленной ранее хромосомной локализацией контролирующего его гена на хромосоме 6В. Однако этот компонент наследовался сцепленно с компонентами 9 и 11 спектра глиадина Langdon, определить хромосомный контроль которых было атруднительно при работе с дисомно-замещенными линиями, где они перекрывались компонентами 6D сорта Chinese Spring. Это позволило локализовать гены, определяющие биосинтез компонентов 9 и 11 на хромосоме 6В. Распределение зерен по двум фенотипическим классам (присутствие или отсутствие данной группы компонентов в спектре 59:16) 2 соответствовало теоретически ожидаемому расщеплению 3:1 (% = 0,53; Р 0,2). На рис. 2 видно, что компоненты 9, 11, 13 либо отсутствуют (дор. 9, 10. 12) либо присутствуют (все дорожки, кроме 2, 10, 12) вместе в электрофоретическом спектре. Выделить альтернативно наследующуюся группу компонентов, контролируемую хромосомой 6В у сорта Л1805, и определить гетерозиготы по данному глиадин-кодирующему локусу оказалось затруднительным.
Идентификация сортов твердой пшеницы на основании полиморфизма по глиадину
При сортовой идентификации и проверке чистоты сорта встают две задачи: первая - определить по электрофоретическому спектру глиадина название сорта (или соответствие названию, заявленному в документах, сопровождающих образец), вторая - определить чужеродные примеси и их долю в исходном сорте (а по возможности, название сортов, которыми загрязнен основной сорт). Под чужеродной примесью понимают часть популяции сорта, случайно попавшую в исходную популяцию в результате недоброкачественного ведения семеноводства (Поморцев, Лялина, 2000). Примесь следует отличать от биотипа.
Для того, чтобы проводить сортовую идентификацию и давать заключения по сортовой чистоте и сортовому соответствию коммерческих партий семян, заявленным в документах данным, в лаборатории, производящей такие оценки, необходимо иметь базу данных по эталонным сортам. Такая база должна содержать результаты анализов оригинальных семян каждого сорта (семян, полученных от автора сорта), информацию по исходной биотипной структуре сорта и генетические формулы по аллельным вариантам блоков компонентов глиадина для каждого биотипа. Кроме того, лаборатория должна быть укомплектована штатом высококвалифицированных сотрудников, умеющих не только технически выполнять электрофорез, но также расшифровывать электрофоретические спектры глиадинов и давать экспертные заключения по поступающим для анализа коммерческим образцам. Последнее условие особенно трудно выполнимо в условиях массового применения метода без автоматизации обработки электрофореграмм.
При анализе соответствия и чистоты сорта возможно применять два подхода: 1 - непосредственное сравнение электрофоретических спектров глиадина анализируемого сорта со спектрами эталонного сорта; 2 идентификация аллельных вариантов блоков компонентов глиадина по всем локусам у всех биотипов сорта и сравнение их с записями в базе данных по эталонным сортам. Второй способ более экономичен с точки зрения расхода материалов для проведения электрофореза и более информативен, поскольку позволяет идентифицировать сорт даже в том случае, когда в документах не указано его название (часто встречается в арбитражной практике), определять какими сортами загрязнен анализируемый сорт (бывает важно при определении источников примеси). Однако, как уже отмечалось выше, для реализации второго способа необходимо наличие высококвалифицированных экспертов. Попытки автоматизировать анализ электрофореграмм глиадина сортов пшеницы предпринимались неоднократно во всем мире и не завершались успехом. Это связано с тем, что многофакторное воздействие на биологический объект ведет к тому, что при формализации информации от объекта формируется некоторая функция, имеющая весьма сложный профиль, далекий от линейной зависимости. В результате традиционные методы обработки полученной информации не всегда дают желаемый эффект (Шноль и др., 1980; Россиев, 1998; Попов и др., 2000). Первые успехи в этой области были достигнуты в результате применения подхода, изложенного в настоящей работе.
Успешный подход был разработан автором работы совместно с В.В. Руанетом и С. Я. Дадашевым и основан на применении для расшифровки электрофоретических спектров глиадина компьютерных программ анализа результатов, предполагающих применение интеллектуальных систем (ИС), реализованных на базе искусственных нейронных сетей (ИНС) (Уотерман,1989; Рыбина, 2000). На наш взгляд, именно ИНС - наиболее подходящая система для широкого практического применения, так как основывается на принципе параллельного способа обработки информации и алгоритме, формирующемся путем обучения на примерах (Горбань, 1990). Все это позволяет с помощью ИНС решать задачи, недоступные программным продуктам, построенным по жесткой алгоритмической схеме.
Были денситометрированы и оцифрованы 805 электрофоретических спектров глиадина 43 отечественных сортов яровой твердой пшеницы, при этом 700 спектров составили обучающую базу, а 105 - тестирующую базу.
Данные оптической плотности служили входными полями для искусственных нейронных сетей (200 колонок, соответствующих 200 участкам электрофореграммы). Выходными полями служили: название сорта и данные о характерных для него аллельных состояниях локусов глиадинов (Gli-Al, GU-Bld, Gli-A2d, Gli-B2d и Gli-B5d). Подготовленные таким образом базы использовали для обучения и тестирования искусственных нейронных сетей.
Как уже отмечалось, алгоритм работы ИНС формируется путем обучения на примерах. Следовательно, логика работы с сетью выдвигает на первый план проблему формализации результатов экспериментов, которые являются одной из ключевых проблем при обучении ИНС. С этой целью при проведении электрофореза образцов твердой пшеницы был использован внутренний стандарт (электрофоретический спектр сорта Ісаго). Это значительно облегчило стандартизацию информации и положительно повлияло на процесс обучения сети, так как позволило нивелировать различия между разными сериями электрофорезов.
