Введение к работе
Актуальность темы. В век высоких технологий человечество стремится заменить энергоёмкие и вредные для окружающей среды производства процессами, использующими потенциал природы. В то время как человечество делает свои первые шаги, создавая наноматериалы, живая клетка уже давно имеет их в ассортименте. Белки -природные молекулы нанометровой величины, которые выполняют в клетке все необходимые функции, начиная от структурной и заканчивая транспортной и каталитической.
Всё большее число современных производителей переходит на использование ферментов в качестве катализаторов, имеющих ряд преимуществ по сравнению с химическим синтезом. Ферментативные реакции отличаются стереоспецифичностью, не требуют высоких температур, и, что более важно, не образуют не встречающихся в природе вредных побочных продуктов -ксенобиотиков.
Однако производство ферментных препаратов представляет собой сложный
процесс, включающий дорогостоящий этап очистки. Для возможности
оптимизации свойств и повторного использования ферменты часто наносят на специальные носители (иммобилизация ферментов), что является одним из вариантов использования иммобилизованных на носителях белков.
В научной и прикладной литературе в последнее время все большее внимание привлекает к себе перспектива закрепления белков на поверхности клеток микроорганизмов. Иммобилизация ферментов in vivo имеет ряд преимуществ по сравнению с иммобилизацией на сорбентах. Фермент, продуцируемый клеткой, оказывается связанным с ней сразу после транспортировки его наружу, что сводит трудоемкий процесс очистки белка к простому отделению клеток фильтрацией. Более того, отпадает необходимость как в связывании фермента с сорбентом, так и в сорбенте как таковом. Таким образом, получение клеток-биокатализаторов с экспонированными на поверхности клеток ферментами открывает перспективу новых технологических решений для производственных нужд.
Помимо этого, необходимо отметить, что иммобилизация in vivo представляет собой интерес не только для создания клеточных биокатализаторов с закреплёнными на поверхности ферментами. Во-первых, на поверхности клетки рационально вести процессы биотрансформации, особенно если субстрат или продукт реакции являются токсичными для клетки. Во-вторых, можно моделировать проведение нескольких последовательных реакций, закрепив на клетке катализирующие их ферменты. В-третьих, взаимодействие белков на поверхности клеточной стенки происходит в пределах тонкого слоя, что предоставляет возможность сборки полимерных белковых структур образующих мономолекулярный слой. Так как, полифункциональность белковых молекул
позволяет им взаимодействовать с молекулами как биологического, так и синтетического происхождения, разумно предположить, что дальнейшее развитие данного направления исследований позволит использовать клеточную стенку в качестве платформы для сборки надмолекулярных полимерных структур разнообразной химической природы.
Исходя из этого, перед нами была поставлена задача, заключающаяся в поиске подходов для эффективного экспонирования белков на поверхности клеточной стенки микроорганизмов. В качестве перспективного объекта нами были выбраны дрожжи Yarrowia lipolylica, как реципиент с высоким потенциалом экспрессии и секреции рекомбинантных белков, в качестве модельного белка липаза Y. lipolylica Lip2.
Цели и задачи работы. Данная работа посвящена разработке систем для эффективного экспонирования белков на поверхности клеточной стенки дрожжей Y. lipolylica.
В связи с этим ставились следующие задачи:
1. Анализ генома дрожжей Y. lipolylica для выявления ранее не
охарактеризованных предполагаемых белков клеточной стенки, пригодных для
экспонирования белков на поверхности клетки.
2. ' Изучение способности ранее охарактеризованного белка клеточной стенки
Y. lipolylica YIPirl закреплять белки на поверхности клетки на примере красного
флуоресцентного белка.
-
Изучение основных способов экспонирования белков на поверхности клеточной стенки для in vivo иммобилизации липазы Y. lipolylica Lip2. Сравнение способности раннее охарактеризованных и найденных предполагаемых белков клеточной стенки закреплять липазу на поверхности клеток дрожжей.
-
Изучение свойств клеточно-связанной липазы.
-
Получение штаммов-продуцентов клеточно-связанной липазы.
Научная новизна. В работе разработаны подходы для экспонирования белков на поверхности клеточной стенки дрожжей Y. lipolylica. Посредством анализа генома найден ряд новых предполагаемых белков клеточной стенки. Было показано, что добавление их аминокислотной последовательности к аминокислотной последовательности фермента липазы приводит к эффективному закреплению полученного рекомбинантного комплекса на поверхности клеток.
В представленной работе впервые в дрожжах Y. lipolylica были изучены два способа экспонирования липазы. В первом случае закрепление осуществлялось с помощью С-концевых участков (доменов) белков клеточной стенки, обладающих сигналом прикрепления гликозилфосфатидилинозитола (GPI), что обусловливает ковалентное связывание с р-1,6-гликанами клеточной стенки. Были проанализированы С-домекы шести новых предполагаемых белков клеточкой
стенки, а также ранее охарактеризованного белка Ylcwpl на способность экспонировать липазу Lip2 на поверхности клетки. Второй способ - присоединение белка клеточной стенки или его N-домена к N-концу фермента. Белок YIPirl, который связывается через дисульфидные мостики с гликопротеинами клеточной стенки, а также N-домен выявленного предполагаемого гликопротеина YALI0C09031p, участвующего в адгезии, впервые были использованы для изучения второго способа экспонирования липазы. Следует отметить, что проведённое исследование позволило среди проанализированных вариантов выбрать лучшую систему для in vivo иммобилизации. Полученные штаммы обладают высокой активностью клеточно-связанной липазы, варьирующей от 3200 до 18800 ед/г сух веса, в зависимости от используемой для иммобилизации аминокислотной последовательности белков клеточной стенки.
Практическая значимость. Липаза - фермент, относящийся к классу гидролаз, катализирует расщепление сложноэфирных связей в липидах. Липазы используются для гидролиза молекулы триацилглицеридов с образованием диглицеридов, моноглицеридов, жирных кислот и глицерина. Помимо этого, липаза способна катализировать этерификацию и переэтерификацию. Эта многофункциональность делает липазу весьма привлекательной для практического использования в пищевой, фармацевтической, кожевенной, текстильной, косметической промышленностях, в производстве ПАВ и бумаги и других отраслях промышленности.
Закрепление такого промышленно-важного фермента как липаза на поверхности клеточной стенки дрожжей является актуальным направлением в современной биотехнологии. Однако, несмотря на большой интерес получения подобных клеток-биокатализаторов, достигаемые до настоящего времени уровни активности клеточно-связанной липазы были недостаточно высоки для их промышленного применения.
В представленной работе получены штаммы, наибольшая активность клеточно-связанной липазы у которых составляет 18800 ед/г сух веса, что соответствует экспонированию 1,2х 10G молекул на поверхности каждой клетки. Достигнутые уровни сопоставимы с уровнем продукции секретируемого фермента штаммом-продуцентом липазы (примерно 0,1 г/л при ферментации в пробирках) и в 70 раз превышают лучшие ранее опубликованные результаты. Клеточно-связанная липаза обладает значительно более высокой термостабильностью, чем свободная форма фермента, сохраняя 57% активности при инкубации на протяжении 6 часов при 45С, тогда как свободная липаза полностью теряет каталитическую активность в этих условиях. Полученные клетки-биокатализаторы с экспонированной на поверхности липазой сохраняют 86-98% активности после трёх повторных раундов использования, что в разы превосходит уровень остаточной активности фермента, иммобилизованного на сорбентах.
Структура работы. Диссертация изложена на .^листах машинописного текста, включая & рисунка и >Р таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения и обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы. Список литературы включает с^работ отечественных и зарубежных авторов.
Апробация работы. Материалы исследования по теме диссертации опубликованы в четырёх печатных работах, в том числе одной статье и одном патенте. Диссертационная работа была изложена на международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» и семинаре секции «Генетика микроорганизмов» Учёного Совета ФГУП «ГосНИИгенетика».
