Содержание к диссертации
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 4
ВВЕДЕНИЕ 5
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. 6
1. Клеточная поверхность Архей. 6
1. Клеточная поверхность археи Halobacterium salinanum 9
Мембранные белки Halobacterium salinanum. 11
Гликопротеин S-слоя клеточной поверхности Halobacterium salinanum . 13
Аминокислотный и карбогидратный анализ. 14
Гликозилирование. 17
Липидная модификация. 19 II. Клеточная поверхность микроорганизмов, относящихся к домену Эукариоты. 21
1. Клеточная стенка дрожжей. 22
1.1. Белки. 25
Белки, нековалентно связанные с клеточной стенкой дрожжей. 30
Белки, содержащие гликозилфосфоинозитольный якорь (GPI - белки). 31 І.І.З.Белки, содержащие внутренние повторы в
аминокислотной последовательности (PIR-белки). 34
1.2. Глюкан. 37
р-1,3-глюкан. 38
р1,6-глюкан. 39
1.3. Хитин. 41
ЗАКЛЮЧЕНИЕ. 44
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. 45
1. Используемые в работе штаммы микроорганизмов. 45
2. Состав сред для выращивания микроорганизмов и условия культивирования. 46
Среда для выращивания археи Halobacterium salinanum 46
Среда для выращивания дрожжей 46
Условия выращивания микроорганизмов. 46
3. Приготовление препаратов клеточных стенок 47
Приготовление препаратов клеточных стенок археи Halobacterium salinanum, используя постепенное понижение концентрации солей 47
Приготовление препаратов клеточных стенок археи Halobacterium salinanum
с использованием стеклянных шариков баллотини. 47
3.3. Приготовление препаратов клеточных стенок дрожжей с использованием
стеклянных шариков баллотини. 48
4. Микроскопические методы. 48
4.1. Метод фазового контраста 48
4.2 Метод флуоресцентной микроскопии. 49
4 3. Электронная микроскопия клеток (клеточных стенок) дрожжей. 49
4.4. Электронная микроскопия клетосных поверхностей Halobactermm salinarium. 50
5. Фракционирование белков клеточной стенки. 50
5 1. Получение фракции нековалентно связанных с клеточной стенкой белков. 50
5 2 Получение фракции ковалентно связанных с клеточной стенкой белков 50
6. Электрофоретические методы. 51
6.1. Электрофорез в денатурирующих условиях. 51
Окраска белков при помощи красителя Кумасси. 52
Окраска белков при помощи нитрата серебра. 52
6.2. Электроперенос белков на нитроцеллюлозную мембрану
(Вестерн-блот анализ). 53
Биотинилирование белков. 54
Получение очищенного препарата клостридиопептидазы. 54 8.1. Электрофорез коллагеназы в неденатурирующих условиях. 54 8 2. Подготовка субстрата коллагена для определения коллагенолитической активности клостридиопептидазы. 55
8.3. Определение коллагенолитической активности клостридиопептидазы
с помощью электрофореза в денатурирующих условиях 55
8 4. Определение протеолитической активности в препаратах коллагеназы
по гидролизу окрашенного казеина. 56
9. Обработка клеточных стенок микроорганизмов протеолитическими ферментами. 56
Обработка клеточных стенок микроорганизмов трипсином. 5 6
Обработка клеточных стенок микроорганизмов клостридиопептидазой. 56 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. 57
1. Идентификация коллагеноподобных последовательностей в белках клеточной поверхности археи Halobactermm salinarium и клеточной стенки некоторых видов
дрожжей. 57
1.1 Очистка коллагеназы Clostridium histolyticum с помощью электрофореза
в неденатурирующих условиях. 61
1.1.1. Проверка коллагенолитической активности полученного препарата
клостридиопептидазы. 63
Проверка присутствия в очищенном препарате клостридиопептидазы протеолитической активности. 65
Определение влияния присутствия NaCl в среде инкубации на активность коллагеназы. 67
1.2. Идентификация коллагеноподобных последовательностей в белках
клеточной поверхности археи Halobactenum salmarium. 67
Подбор оптимальных условий для выделения клеточных поверхностей археи Halobactenum salmarium. 69
Воздействие клостридиопептидазы на клеточные поверхности Halobactenum salmarium 73
1.3. Идентификация коллагеноподобных последовательностей в белках
клеточной стенки дрожжей. 79
Подбор оптимальных условий для вьщеления клеточных стенок дрожжей. 82
Воздействие клостридиопептидазы на клеточные стенки дрожжей. 86
Сравнение состава белковых фракций клеточных стенок дрожжей Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha и Candida utihs 87
Воздействие клостридиопептидазы на фракцию PIR-белков клеточных стенок дрожжей Ham enula polymorpha и Candida utihs 91
Проверка чувствительности клеточных стенок дрожжей Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha и Candida utihs к протеолитической деградации с использованием фермента трипсина. 96
Изучение роли О-гликозилирования белков в поддержание структурной целостности клеточной стенки дрожжей. 98
2. Изучение роли полисахаридных компонентов клеточной стенки дрожжей
в структурной организации этой органеллы клетки. 101
2.1. Сравнительный анализ уровня хитина в клеточной стенкие дрожжей
Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha и Candida utihs. 101
2.2 Изучение роли глюкантрансферазы Bgl2p в формировании
молекулярной структуры клеточной стенки дрожжей Hansenula polymorpha и
Saccharomyces cerevisiae. 104
Изучение структурной роли хитина в клеточной стенке дрожжей Saccharomyces cerevisiae 110
Исследование морфологии двойного мутанта дрожжей Saccharomyces cerevisiae с нарушенными генами BGL2 и CHS3 114
3. Заключение 119
ВЫВОДЫ. 120
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ. 121
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ГП - гликопротеиновый слой
КП - клеточная поверхность
КС - клеточная стенка
о.е. - оптические единицы
ПААГ - полиакриламидный гель
ПП - периплазматическое пространство
ПСА - персульфат аммония
т.н.п. - тысяч пар нуклеотидов
ЦПМ - цитоплазматическая мембрана
ЭДТА - этилендиаминтетраацетиловая кислота
BCIP- 5-бром-4-хлор-3-инолил фосфат
Ccw - белки, ковалентно связанные с КС
CFW - Calcofluor white
GlcN - глюкозамин
Endo Н - ендогликозидаза Н
GPI- белки, содержащие гликозил-фосфоинозитольный «якорь»
кБа - килодальтон
NBT- нитротетразолиум хлорид синий
PIR-белки - белки, характеризующиеся наличием внутренних повторов в
молекуле (protein with internal repeats)
PMSF - фенилметансульфонилфторид
Sew - белки, ковалентно не связанные с полисахаридами КС
SDS - додецил сульфат натрия
SDS-белки - белки, экстрагируемые из КС с помощью SDS и р-меркаптоэтанола
Sulfo-NHS-LC-биотин - сульфосукцинимидил-б-(биотинамидо) гексанат
Введение к работе
Одним и і важнейших компартментов клетки микроорганизмов является клеточная поверхность (КП), в состав которой входит клеточная стенка (КС), цитоилазматическая мембрана и, в некоторых случаях, периплазматическое пространство. КС представляет собой внешнюю часть КП Она играет роль наружного скелета клетки, выполняет защитную функцию и осуществляет комплекс взаимоотношений клетки с окружающей средой Таким образом, КС является важной и многофункциональной органеллой клетки, которая оіражает основные особенности микроорганизма, в зависимости от условии его обитания и принадлежности к той или иной филогенетической группе Это делает КС весьма интересным объектом для изучения.
Основными структурными компонентами КС микроорганизмов являются белки различной степени гликозилирования и полисахариды Следует отметить, однако, что компонентный состав КС микроорганизмов различной видовой и таксономической принадлежности можег существенно отличаться (Kandler, Komg, 1993, Klis, 1994, Калебина, Кулаев, 2001)
Белки выполняют двоякую функцию в КС: ферментативную, участвуя во встраивании структурных компонентов в КС и функцию структурного модуля Для исследователей белки КС, также, могут являїься важным маркером для изучения процессов эволюции Последнее можно отнести, например, к белкам, относящимся к семейству коллагенов Как известно, именно коллаїеньї являются важными структурными белками высших эукариот животного происхождения В связи с этим интересно было бы проследить, присуїствуют ли белки с коллагеноподобными последовательное І ями в белках КС микроорганизмов, находящихся на разных стадиях эволюционного развития Основанием для поиска таких белков в составе КП микроорганизмов явились работы М В Нурминской (Нурминская и др , 1994), выполненные в нашей лаборатории Помимо этого, сравнительное исследование белкового состава КС микроорганизмов, относящихся к разным филогенешческим группам, даст возможность проследить основные этапы эволюции КС у разных микроорганизмов
Другой струкіурньш компонент КС - полисахариды служат опорным материалом жесіких ктеточных стенок (хитин, глюкан, целлюлоза), выполняют защитные функции (капсульные полиахариды), а также служат в качестве энергешческого резерва клетки (Ваіабов, 1988) Гидрофильные полисахариды способствуют поддержанию водного баланса клеток Особенно важную роль играют полисахариды в образовании клеточных
поверхностей, характеризующихся набором различных типов молекул полисахаридов, входящих в их состав Так, например, КС грибов - оомицегов состоя і, в основном, и* целлюлозы и глюкана, а не хитина, как у большинства друї их мицелиальных грибов
Таким образом, сравнительное изучение роли основных структурных компонентов в молекулярной организации КП микрооріанизмов из разных филогенетических групп является важной и актуальной в настоящее время задачей Особенно актуальным является изучение КП архей, сравнительно недавно охарактеризованною домена живых существ, в первую очередь, в контексте сравнения присутствующих на их поверхностях белков и полисахаридов с компонентами КС дрожжей - представителей низших эукариот
