Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. Общие сведения о лектинах 10
1.2. Роль лектинов в метаболизме живых организмов 13
1.3. Стресс и его действие на организм 29
2. Экспериментальная часть 35
2.1. Объект, материалы и методы исследования 35
2.1.1. Выделение, очистка лектинов ЛІ и ЛІТ Paenibacillus polymyxa 1460 36
2.1.2. Моделирование различных стрессовых воздействий 36
2.1.3. Определение активности глутатион-8-трансферазы in vivo 37
2.1.4. Определение активности аминотрансфераз 38
2.1.5. Определение содержания мочевины в сыворотке крови 40
2.1.6. Определение содержания холестерина в сыворотке крови 41
2.1.7. Определение содержания церулоплазмина в сыворотке крови 42
2.1.8. Определение количества молочнокислых микроорганизмов в кишечнике животных 43
2.1.9. Методы статистической обработки 43
2.2. Результаты исследований и их обсуждение 44
2.2.1. Изучение влияния бактериальных лектинов ЛІ и ЛИ P.polymyxa 1460 на активность глутатион-8-трансферазы при различных видах стресса 44
2.2.2 Изучение специфичного взаимодействия лектина ЛИ P.polymyxa 1460
с глутатион-8-трансферазой при различных видах стресса 51
2.2.3. Влияние лектинов бацилл на активность аминотрансфераз в сыворотке крови при стрессе 52
2.2.4. Исследование влияния лектинов бацилл ЛІ и ЛИ на содержание мочевины и холестерина в сыворотке крови при различных видах стресса 62
2.2.5. Влияние лектинов ЛІ и ЛИ на содержание церулоплазмина в сыворотке крови животных при различных видах стресса 71
2.2.6. Влияние лектина ЛИ на содержание молочнокислых микроорганизмов кишечника крыс при стрессах 77
Заключение 81
Выводы 87
Список используемых литературных источников 88
- Общие сведения о лектинах
- Роль лектинов в метаболизме живых организмов
- Выделение, очистка лектинов ЛІ и ЛІТ Paenibacillus polymyxa 1460
- Определение количества молочнокислых микроорганизмов в кишечнике животных
Введение к работе
Лектины представляют собой углеводсвязывающие белки неиммунной природы. Специфически связываясь с углеводными рецепторами, они способны участвовать во многих внутриклеточных метаболических процессах растений, животных, микроорганизмов. Среди лектинов различного происхождения в этом плане менее изученными являются лектины бактерий. К настоящему времени имеется довольно широкий набор бактерий, синтезирующих лектины разнообразной углеводной специфичности (Карпунина, 1989, 2002; Никитина и др., 1989; Коваленко, 1990; Лахтин, 1992). Благодаря высокой биологической активности, они могут обладать иммуномодулирующими свойствами (Никитина и др., 2002; Тихомирова и др., 2003), изменять адгезивную функцию фагоцитирующих клеток, цитокиновую активность (Абросимова и др., 2002; Горельникова, 2006). Работ по влиянию лектинов непатогенных бактерий на метаболизм животного организма, судя по имеющимся публикациям, не так много. В последнее время установлено, что одним из наиболее эффективных способов повышения резистентности организма при патологиях, в том числе и к различным видам стрессов, является применение разнообразных биологически активных веществ, в том числе и лектинов бактерий (Мосейнюк, 1982; Коваленко, 1997; Мухачева, 2001). Изучение влияния лектинов бактериального происхождения на внутриклеточные процессы организма животных, как в норме, так и при некоторых нарушениях, являются интересной и актуальной задачей, поскольку это открывает новые возможности коррекции нарушенного обмена веществ.
Цель работы состояла в изучении роли лектинов JTI и ЛИ Paenibacillus polymyxa 1460 в регуляции некоторых метаболических процессов в организме экспериментальных животных в норме и при стрессовых воздействиях различной природы.
Задачи исследования:
Изучить влияние лектинов ЛІ и ЛІТ P.polymyxa 1460 на активность глутатион-8-трансферазы экспериментальных животных (крыс) in vivo в норме и в условиях холодового, иммобилиза-ционного и этанолового стрессов.
Определить специфичное взаимодействие лектина ЛІІ P.polymyxa 1460 с глутатион-Б-трансферазой эритроцитов крови /v vitro.
Определить влияние лектинов ЛІ и ЛИ на активность аланин-аминотрансферазы (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (ACT) крыс в условиях холодового и этанолового стресса.
А. Исследовать влияние лектинов ЛІ и ЛИ на содержание моче-
вины и холестерина в организме крыс в норме, а также при хо-лодовом и этаноловом стрессах.
Изучить действие лектинов бацилл ЛІ и ЛИ на содержание це-рулоплазмина в крови крыс при стрессах.
Исследовать влияние лектина бацилл ЛИ на микрофлору кишечника крыс в норме и в стрессовых условиях.
Научная новизна
Впервые выявлена регуляторная роль лектина ЛИ, выделенного с поверхности почвенных азотфиксирующих P.polymyxa 1460, в условиях патологических нарушений организма, вызванных Холодовым и этаноловым стрессами в отношении фермента глутатион-8-трансферазы и церулоплазми-на in vivo. Обнаружена способность лектина специфически связываться с рецепторами глутатион-Б-трансферазы in vitro.
Показано, что лектин ЛИ нормализует активность аланинаминотранс-
7 феразы и аспартатаминотрансферазы, нарушение в активности которых было вызвано Холодовым и этаноловым стрессом. Обнаружено влияние лектина бацилл ЛИ на азотистый обмен веществ в организме животных. Показано, что ЛП способствует нормализации мочевины в сыворотке крови при этано-ловом стрессе.
Установлено, что лектин Л1Ь способен оказывать влияние на микрофлору кишечника, регулируя количество молочнокислых бактерий в условиях иммобилизационного, холодового и этанолового стрессов.
Практическая значимость
Способность лектина бацилл регулировать активность некоторых ферментов, а также коррекция важных показателей разнообразных обменных процессов при патологических состояниях организма на фоне различных видов стресса открывает перспективы их возможного использования в практике медицинских и биологических исследований. По материалам диссертационной работы опубликованы методические рекомендации «Изучение влияния лектина бацилл на активность глутатион-8-трансферазы эритроцитов крови крыс при стрессе» (в соавторстве с Т.П. Кикаловой, Л.В. Карпуниной и М.Д. Сметаниной, 2008) для практических занятий студентов старших курсов, а также для работы аспирантов и научных работников, специализирующихся в области микробиологии, биохимии, физиологии человека и животных, рекомендованные Учебно-методической комиссией и одобренные Ученым советом ветеринарного факультета Саратовского государственного аграрного университета им. Н.И. Вавилова (протокол № 42 от 3 апреля 2008 г.). Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций и написании дипломных работ в Саратовском государственном университете им. Н.Г. Чернышевского при написании и в Саратовском государственном аграрном университете им. Н.И. Вавилова.
На защиту выносятся следующие положения: 1. Лектин ЛИ P.polymyxa 1460 способен регулировать активность глута-тион-8-трансферазы эритроцитов крови крыс в условиях стресса: понижая
8 активность фермента при этаноловом и повышая при холодовом стрессе in vivo. Лектин ЛІ не изменяет активность фермента в организме крыс при данных видах стресса.
2. Лектин ЛИ специфически взаимодействует с глутатион-8-трансферазой
эритроцитов крови животных in vitro.
Введение лектина бацилл ЛИ в организм крыс влияет на аминотрансфераз-ную активность сыворотки крови, регулируя активность ACT при холодовом стрессе и активность АЛТ при этаноловом стрессе.
Лектин ЛИ оказывает влияние на уровень мочевины и холестерина в организме интактных и подвергшихся холодовому и этаноловому стрессам животных; приводит к норме содержание мочевины в организме экспериментальных животных при этаноловом стрессе.
Лектин бацилл ЛИ способствует нормализации содержания церулоплазми-на in vivo при стрессовых воздействиях (холодового, этанолового).
Лектин бацилл ЛИ нормализует содержание молочнокислых бактерий в организме экспериментальных животных, подвергнутых иммобилизацион-ному, холодовому и этаноловому стрессу, приводя количество бактерий к норме, а в случае холодового стресса - к увеличению.
Работа выполнена на кафедре микробиологии и ветсанэкспертизы, переименованной впоследствии (20.09.2006) в кафедру микробиологии, вирусологии и иммунологии факультета ветеринарной медицины ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова» в рамках научно-исследовательской темы: «Изучение биологически активных веществ (лектинов) в регуляции метаболизма растений и животных» и при частичной поддержке грантом CRDF (CR-006-xl).
Апробация работы
Материалы диссертации были представлены на: конференциях профессорско-преподавательского состава и аспирантов ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова» по итогам научно-исследовательской и учебно-методической работы (Саратов, 2005; 2006;
9 2007); региональных конференциях молодых ученых «Вавиловские чтения -2005, 2006, 2007» (Саратов, 2005; 2006; 2007); десятой Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века» (Россия, Пущи-но, 2006); третьей межрегиональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, ИБФРМ РАН, 2006), III Международной школе-конференции «Актуальные аспекты микробиологии» (Москва, 2007).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 12 работ, из них 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, двух глав: обзора литературы и экспериментальной части, включающей материалы и методы исследования, результаты исследований и их обсуждение, а также заключения, выводов и списка используемых литературных источников. Работа изложена на 104 страницах, содержит 22 таблицы. Список использованных литературных источников включает 174 наименования, в том числе 71 зарубежное. ,
Общие сведения о лектинах
Термин «лектин» впервые был предложен С. Бойдом (1963), который определил его как: «белок, обладающий свойством обратимо и избирательно связывать углеводы, не вызывая их химического превращения». С течением лет определение, данное С. Бойдом, претерпевало некоторые изменения. В настоящее время общепризнанным является определение, данное профессорами J. Kocourek и V. Horejsi, согласно которому лектины — это белки неим-муноглобулиновой природы, способные к специфическому узнаванию углеводов (гликозильных групп) и обратимому связыванию с ними без нарушения ковалентной структуры узнаваемых гликозильных лигандов (Kocourek, Horejsi, 1983). Согласно этому определению, к лектинам относятся не только поливалентные белки, способные агглютинировать или преципитировать гликоконъюгаты, но также некоторые моновалентные белки растительных, бактериальных токсинов и другие.
Поскольку первоначально были обнаружены лектины растительного происхождения, то они получили название фитогемагглютининов. В 1902 году R. Kraus и S. Ludwig впервые описали бактериальные лектины. При дальнейшем изучении оказалось, что молекулы лектинов обладают двумя и более центрами связывания углеводов, вследствие этого при взаимодействии с поверхностными рецепторами двух клеток лектин формирует между ними молекулярные мостики, образуя многоклеточные агрегаты (Лахтин, 1987). Специфическое связывание лектинов с углеводными рецепторами клеточных поверхностей является одним из видов углевод-белкового узнавания, которое приводит к изменению сигналов в данной биологической системе. Способ передачи биологической информации посредством углевод-белкового узнавания является одним из основных на уровне клетки. В этой связи, лектины играют ключевую роль в таких процессах как оплодотворение, эмбриогенез, защита многоклеточного организма от инфекции, клеточная дифференциров-ка и миграция (Belogortseva et al., 2005).
За последние годы в лектинологии наметилась тенденция перехода от изучения лектинов растительного и животного происхождения к лектинам, продуцируемыми микроорганизмами и, в частности, бактериальным (Лахтин, 1992; Карпунина и др., 1997; Никитина и др., 2001). Это связано с тем, что бактерии быстро растут и идеально подходят для технологии интенсивного культивирования; компоненты питательной среды, как правило, доступны и недороги; имеется широкий выбор микроорганизмов, синтезирующих лектины; микробные лектины характеризуются высокой удельной активностью и большим разнообразием по углеводной специфичности.
В тканях человека и животных различают следующие основные типы гликоконьюгатов, которые могут выполнять функцию рецепторов лектинов: гликопротеины, гликолипиды, протеогликаны. Лектины проявляют выраженное сродство к макромолекулярным соединениям чисто углеводной природы — гликозаминогликанам и гомогликанам.
Лектины классифицируют в зависимости от источника их выделения, соотношения белковой и углеводной частей, фиксированности на мембранах, специфичности к углеводам, в частности к моносахаридам, олигосахаридам и антигенным структурам. Однако наиболее важными являются классификации по углеводной специфичности, так как взаимодействие лектинов с молекулами определяется характерной углеводной группой, например, терминальным остатком галактозы, маннозы и других моносахаридов. В связи с этим, один и тот же лектин может взаимодействовать с различными глико-протеидами, содержащими данную углеводную группу (Луцик, Детюк, Лу-цик, 1989).
Углеводы в лектинах представлены широко распространенными моносахаридами (манноза, галактоза, фруктоза и N-ацетилгалактозамин). Лектины относительно бедны серосодержащими аминокислотами, цистином, метио нином и богаты серином и треонином (Косенко, Ковалевская, 1989; Никитина и др., 1989; Карпунина и др., 1997).
По функциональной активности все лектины можно разделить на следующие группы (Королев, Выскребенцева, 1989): 1. Простые лектины (агглютинирующие, неагглютинирующие, фрагменты полных лектинов, изоформы лектинов). 2. Митогенные лектины. 3. Токсические лектины. 4. Мембранные лектины (детализируются по организму, органам и клеткам частных организмов).
Для решения ряда проблем современной биологии и медицины необходимы лектины с самыми разнообразными свойствами. Поэтому поиск лектинов, и изучение их свойств очень актуально.
Основные направления поиска: - поиск лектинов, агглютинирующих или реагирующих с клетками живых организмов; - поиск лектинов, влияющих на метаболизм клетки.
Первое из направлений включает задачи поиска лектинов, специфичных к групповым антигенам крови человека и животных, избирательно агглютинирующие клетки крови, микроорганизмы, вирусы, простейшие, микроскопические грибы.
Второе направление включает поиск лектинов с митогенными и анти-митогенными свойствами; цитотоксических (в том числе и противоопухолевых) лектинов; лектинов, стимулирующих продукцию интерферона; обладающих гормономиметическими свойствами (Антонюк, 1981).
Роль лектинов в метаболизме живых организмов
Наличие лектинов в самых разнообразных живых объектах свидетельствует о важной роли этих белков в процессах жизнедеятельности. Изучено достаточное количество лектинов растительного, животного, микробного происхождения, описано многообразие их свойств и функций. Важное место отводится лектинам бактерий. Имеются сведения, что некоторые формы Mycoplasma pneumoniae могут прикрепляться к эритроцитам посредством мембранных сайтов, отличных от концевых структур (Barondes, 1984; Timothy, 1988). Гемагглютинины Yersinia pseudotuberculosis и Fusobactevium nucleatum, связанные с мембраной, также способны обеспечивать адгезию бактерий к клеткам хозяина на первой стадии инфекционного процесса (Brinins, 1983;Капое, 1985).
К настоящему времени известно, что бактериальные лектины могут присутствовать или в виде пилей, например, у многих быстро- и медленно растущих ризобий (Rhizobium trifolii, R.japonicum, R.phaseoli, R.melilotii), или иметь поверхностную локализацию как у азоспирилл, бацилл, некоторых ризобий (De Ley, 1965; Никитин, Васильева, Лохмачева, 1966; Никитина, Итальянская, Карпунина, 1989; Карпунина и др., 1993; Карпунина, 2002). Специфическая адгезия бактерий на клетках различных тканей хозяина является первой ступенью инфекционного процесса. Поверхностные факторы адгезии бактерий участвуют в прикреплении к клеткам-мишеням, связываясь с гликоконъюгатами клеток. Первоначально было показано, что прикрепление бактерий к животным клеткам специфически ингибируется маннозой (Collier, de Miranda, 1955). Впоследствии было обнаружено, что и другие сахара мог ли ингибировать процесс прикрепления различных бактерий к клеткам-хозяевам. Из-за широкого распространения маннозоспецифичной адгезии среди грамотрицательных бактерий их стали разделять на маннозоспецифич-ные (МС) и маннозорезистентные (MP) бактерии (Mirelman, Altaian, Eshdat, 1980).
Группой исследователей во главе с S. Haataja (1996) был идентифицирован адгезии из культуры клеток Streptococcus suis. Очищенный адгезии молекулярной массой 18 kD адсорбировался частицами латекса и вызывал ге-магглютинацию, которая ингибировалась N-ацетилгалактозамином или галактозой. По сведениям A. Denson и R. Doyle (1998) клеточная суспензия Streptococcus sorbinus агрегировала с а-1,6 глюканом, образуя высокомолекулярные кластеры. Эта способность определялась присутствием глюкан-связывающего лектина (GBL), находящегося на поверхности клеток. Авторы отводили этому лектину определяющую роль в прикреплении S.sorbinus к дентальным поверхностям. Лектиновая активность GBL уменьшалась при воздействии анионного детергента додецил-сульфат натрия (SDS), однако предварительная инкубация лектина с а-1,6 глюканом защищала лектин от денатурации. По всей видимости, этот углевод стабилизировал лектин S.sorbinus.
Имеются исследования о так называемых «внеклеточных» лектинах, которые выделяются в питательную среду в процессе жизнедеятельности бактерий. К лектинам этой группы относятся бактериальные токсины, которые связывают сложные углеводы на клетках. S. Goswami с соавт. (1997) впервые дали характеристику внеклеточного маннанспецифичного лектина Mycoplasma smegmatis. Его молекулярная масса оказалась равной 12—14 кД. По всей вероятности, лектин обеспечивал адгезивную способность микобак-терий, что являлось первым шагом инфекционного процесса к макрофагам. Лектин, названный микотином, имеется и на поверхностных структурах M.tuberculosis, M.Jeprae, M.kansasii, М.avium. Микотин связывал макрофаги в зависимости от дозы и ингибировался маннаном и антимикотиновыми анти телами. При исследовании взаимодействия микотинсвязанных молекул с маннозоспецифичными рецепторами макрофагов на поверхности микобакте-рий был обнаружен активный фрагмент с молекулярной массой 2,2 кД, который взаимодействовал с микотином. Активность лектинов зависела от синтеза этих фрагментов (Goswarai et al., 1997).
Как и у многих других патогенных бактерий, лектин был обнаружен у холерного вибриона. Холерный лектин, выделенный из классического биовара Inaba обладал гемагглютинирующей активностью и способностью инги-бировать адгезию холерных вибрионов к клеткам кишечного эпителия кролика (Наппе, 1982; Booth, 1986). Лектин представлял собой белок с молекулярной массой 32 kD. Было выделено три изоформы этого белка с изоэлек-трическими точками 6.3, 5.3, 4.7. Белок не образовывал фимбриальных структур на поверхности клетки и отличался хорошей растворимостью. Холерный лектин продуцируют все штаммы холерного вибриона. Хотя до сих пор нет фактически данных о специфическом рецепторе на эукариотических клетках для адгезии холерного вибриона, опыты по ингибированию этого процесса некоторыми моносахаридами свидетельствуют в пользу того, что данный рецептор имеет гликопротеиновую природу. Холерный энтеротоксин также проявлял сродство к ганглиозиду клеточной мембраны GM1 (Griffiths, 1986; Sugii, 1987). Было показано, что холерный токсин состоит из двух субъединиц, одна из которых содержит токсический полипептид, а другая обладает лектиновой активностью, и именно она и проявляет специфичность к ганглиозиду GMI (Keush, 1986).
Выделение, очистка лектинов ЛІ и ЛІТ Paenibacillus polymyxa 1460
Объектом исследования явились лектины ЛІ и ЛИ, выделенные с поверхности почвенных азотфиксирующих бактерий Paenibacillus polymyxa 1460 (Карпунина и др., 1993). Культура P.polymyxa 1460 была получена из Чешской коллекции микроорганизмов (СММ).
Бактерии рода Paenibacillus принадлежат к семейству Paenibacillaceae (Bergey, 2001) и обладают способностью фиксировать азот в почве. Клетки Ppolymyxa короткие, как правило, не образующие цепочек, эллиптической формы, палочки шириной 0,6-0,8 мкм, длиной 2-5 мкм, грамвариабельны, образуют эндоспоры, факультативные анаэробы. Потребность в кислороде меняется в зависимости от источника азота. При питании атмосферным азотом кислорода не требуется, напротив, его присутствие подавляет процесс азото-фиксации. На средах с нитратами кислород стимулирует развитие культуры Ppolymyxa, в отсутствии их лаг-фаза значительно затягивается. Бактерии Ppolymyxa широко распространены в почвах; они встречаются в черноземных, каштановых, сероземных, красноземных, дерново-подзолистых почвах. В большом количестве эти бактерии найдены в зоне корня пшеницы, сорго (Мальцева, 1992; Rennie, 1972). По данным J. Dobereiner (1977) культура Ppolymyxa вносит значительный вклад в накопление азота в почвах.
С поверхности клеток P. polymyxa 1460 были выделены два лектина — ЛІ и ЛИ, с молекулярной массой 72 и 69 кДа соответственно. По данным Л.В. Карпуниной с соавт. (1993) лектины являются гликопротеидами; ЛІ обладает специфичностью к глюкуроновой кислоте и фруктозе-1,6-дифосфату, а ЛІІ специфичен к Д-галактозамину, глюкуроновой кислоте, фруктозе-1,6-дифосфату, глюкозамину. Одной из важнейших их функций является адгезия. Кроме того, лектины способны оказывать влияние на активность ряда гидролитических ферментов в растительной клетке, а ЛТІ так же способен влиять на метаболизм животной клетки: на белковый состав плазмы крови, активность кислых гидролаз (Мухачева, 2004); увеличивать адгезивную способность макрофагов (Абросимова, 2006), влиять на цитокиновую активность фагоцитов (Горельникова, 2006).
Для выделения ЛІ и ЛИ с поверхности. P.polymyxa 1460 клетки выращивали в течение 72 часов при температуре 28 С на синтетической среде Moore (1963) (на 1000 мл дистиллированной воды брали 20 г глюкозы; 1 г К2НРО4; 0,5 г MgS04x7 Н20; 0,1 г FeCl3x6 Н20; 0,02 г Na2Mo04x2 Н20; 0,01 % дрожжевого экстракта).
Биомассу клеток P.polymyxa 1460 осаждали центрифугированием (6000g, 10 мин), многократно пропускали через иглу шприца диаметром 0,1 мм в 1 % растворе NaCl. Неочищенный агглютинин получали путем осаждения белка 2,5 объемами ацетона, диализировали против дистиллированной воды в течение 15-20 часов и очищали методом гель-фильтрации на колонке размером 25x1,5 см, используя в качестве носителя Toyopearl HW-55. Белок с колонки элюировали 0,05 н глицин-HCl буфером (рН 3,0). Выход белковых фракций регистрировали на приборе Uvicord SII (LKB) при 280 нм, спектрофотометре СФ-26, спектрофлюориметре «Флюорат-02 Панорама» в диапазоне длин волн 265-280 нм (Карпунина, 2002). Количественное содержание белка определяли по методу М.А. Bradford (1976).
Холодовой стресс моделировали путем помещения крыс средней массой 210 г на лед на 10 и 60 минут; иммобилизационный стресс — фиксацией животных на спине (с использованием мягкой лигатуры) в течение 10 минут; этаноловый стресс - путем введения этилового спирта (12,5 % и 25 %) через зонд в желудок крыс на 10 и 60 минут. Объем вводимого препарата составлял 1 мл на животное (Анищенко, 1991).
Крыс содержали в стандартных условиях вивария. Для животных использовали концентрацию лектина, которая являлась предгемагглютини-рующей, и подбирались для крыс методом агглютинации с трипсинизиро-ванными эритроцитами. У крыс предгемагглютинирующая концентрация лектина составила — 4 мкг/мл.
По характеру воздействия животные были поделены на 9 групп: 1 группа - контрольные животные; 2 группа — животные, которые получали раствор лектина ЛІ; 3 группа — животные, которым вводили раствор лектина ЛИ; 4 и 5 группы - животные, которых подвергали воздействию холодового стресса в течение 10 и 60 минут соответственно; 6 группа — животные, подвергавшиеся иммобилизационному стрессу в течение 10 минут; 7 группа -животные, которые получали раствор лектина ЛП за сутки перед Холодовым стрессом (10 минут); 8 группа - животные, подвергавшиеся иммобилизационному стрессу в течение 10 минут через сутки после введения ЛП; 9 группа — животные, подвергавшиеся влиянию этанолового стресса в течение 10 и 60 минут. Лектины (ЛІ или ЛИ) вводили интраперитонеально в дозе 2 мкг/животное. Кровь отбирали через 24 часа после введения лектина и сразу после стресса.
Определение количества молочнокислых микроорганизмов в кишечнике животных
Реакции на различные стрессы играют немалую роль в формировании метаболического статуса при различных состояниях организма. Известно, что при действии стресса нарушаются различные физиологические функции организма: щитовидной железы, половых желез, кровообращения, иммунитета и т.д. Стрессорные воздействия поражают в первую очередь ту функциональную систему, которая работала с наибольшим напряжением во время удара. В тоже время, едва ли найдется в организме хотя бы один орган, который стресс обходит стороной. Основой развития болезней при длительном стрессировании организма является продолжительное влияние гормонов, участвующих в формировании реакции стресса и вызывающих серьезные нарушения в обмене липидов, углеводов, электролитов (Эверли, 1981; Кощеев, 1981).
В естественной профилактике стрессорных повреждений большое значение имеет антиоксидантная система организма. Ее представляют низкомолекулярные соединения — ловушки радикалов, к которым относятся витамины (А, С, Е, Д и К), биофлавоноиды, низкомолекулярные тиолы (глутатион и эрготионеин), а также антиперекисные ферменты: супероксиддисмутаза, глу-татионпероксидаза, глутатионредуктаза, каталаза и пр. (Соколовский, 1984; Губский, Левицкий, Примак, 1992; Левицкий, Холодова, Губский, 1993; Капралов, Петрова, Левицкий, 1997).
Конечный результат процесса адаптации — приспособление организма к новым условиям окружающей среды или срыв адаптивных механизмов. Следствием этого является развитие патологического состояния, определяемое в итоге одним из главных факторов регуляции метаболизма — взаимоотношением антиоксидантных и прооксидантных механизмов, иными словами, способностью антиоксидантной системой организма (АОС) защитить клетку от свободных радикалов и перекисей (Левицкий, Губский, 1994; Соколовский, 1998).
В формировании устойчивости организма к различным стрессорным (химическим и физическим) воздействиям уникальную роль играет система глутатиона, важным компонентом которой являются мультифункциональные белки глутатион-8-трансфераз (GST), которые сосредоточены, главным образом, в цитозоле клеток всех тканей, а некоторые из них - в микросомах и внешней мембране митохондрий. Являясь универсальным дезинтоксикаци-онным ферментом, GST осуществляет метаболическую защиту организма, как от экзогенных, так и от эндогенных токсических метаболитов (Habig, 1981).
Большой интерес среди исследователей, вызывает изучение влияния стресса на живые организмы (Афанасьев и др. 1994; Подсеваткин и др., 2001). Литературные данные также свидетельствуют о том, что стресс вызывает нарушения в иммунной системе организма. При этом следует отметить, что степень изменения отдельных показателей существенно зависит от вида стресса (Подсеваткин и др., 2001). Хронический иммобилизационный стресс вызывает у всех крыс снижение показателей иммунной системы: общего содержания лейкоцитов, лимфоцитов в крови и уменьшение массы тимуса (Mibu, Tochigi, 2001).
Установлено, что одним из наиболее эффективных способов повышения резистентности организма к различным видам стрессов является применение биологически активных веществ (Душкин и др. 1993).
В связи с этим интересно было посмотреть действие лектинов Р. ро-lymyxa 1460 ЛІ и ЛИ, являющиеся биологически активными веществами, на активность GST в организме на фоне различных видов стресса (иммобилизационный, холодовой, этаноловый).
Первоначально проводили исследования по изучению влияния лектинов бацилл на активность GST не стрессированных животных. Было обнаружено (табл. 1), что лектин ЛІ не вызывал изменений в активности глутатион S-трансферазы эритроцитов крыс по сравнению с контролем. При введении же бактериального лектина ЛИ в организм крыс активность GST эритроцитов крыс понижалась на 24 % и составляла 15,1 мкмоль/мин-л против 19,9 мкмоль/мин-л у интактных животных (Р 0,05). Изменение активности глутатион-Э-трансферазы на фоне действия этого лектина ЛИ свидетельствовало о его благоприятном воздействии на организм. В связи с этим для дальнейшей работы был выбран лектин ЛИ.
Исследования были связаны с изучением влияния лектина бацилл ЛИ на активность GST крыс, находящихся в условиях стресса.
Иммобилизация, как один из видов стресса животных, является удобной моделью для изучения изменения активности ферментов. При иммобилизации происходят изменения клеточных и гуморальных показателей достаточно быстро. Как показали результаты наших исследований, иммобилизация в течение 10 минут не вызвала существенных изменений в активности GST (табл. 2). В связи с этим мы попытались найти модель стресса, при которой активность GST эритроцитов крови самцов крыс изменялась бы уже при 10 минутном воздействии стрессора.
Известно, что действие холода на организм животных и человека проявляется в нарушении работы его функциональных систем самого организма (Кощеев, 1981). Во многих случаях заметно изменяются показатели обмена веществ, характеризующих энергетическую и пластическую их функции, и участие в адаптивных реакциях. Изменения отдельных показателей могут отражать развитие неспецифических сдвигов в гомеостазе, что связано со свойствами действующего фактора. Развитие стресса в организме сопряжено с увеличением энергетических затрат, что необходимо для обеспечения функций отдельных органов и систем на разных стадиях стресса и, в конечном счете, для сохранения жизнеспособности (Гурин, 1980).
