Содержание к диссертации
Стр.
ВВЕДЕНИЕ 5
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Ю
ГЛАВА I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БЕСЦВЕТНЫХ СЕРОБАКТЕРИЙ. . Ю
1.1. Одноклеточные бесцветные серобактерии 13
Систематика одноклеточных серобактерий . 13
Условия развития одноклеточных серобактерий в природе 18
Культивирование одноклеточных серобактерий 20
1.2. Нитчатые бесцветные серобактерии ....... 22
Систематика нитчатых серобактерий ... 22
Особенности морфологии и ультраструктурной организации нитчатых серобактерий. . 26
Вопрос о хемолитоавтотрофии бесцветных серобактерий 29
Углеродный метаболизм 31
Метаболизм неорганических соединений
серы 35
ГЛАВА 2. ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ МЕХАНИЗМЫ РЕАКЦИЙ СЕРНОГО
МЕТАБОЛИЗМА 39
Ассимиляционное восстановление сульфата .... 40
Диссимиляционная редукция соединений серы микроорганизмами 44
Процессы диссимиляционной редукции соединений серы у сульфатредуцирующих бактерий 44
Восстановление неполностью окисленных соединений серы 48
2.3. Ферменты окислительного метаболизма
неорганических соединений серы ... 51
Стр.
2.3.1. Ферменты окислительного метаболизма
тионовых бактерий 51
2. 3.2. Ферментные системы, участвующие
в окислении соединений серы у
гетеротрофных микроорганизмов 57
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ПО ЛИТЕРАТУРНОМУ ОБЗОРУ. Задачи работы ... 60
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 62
ГЛАВА 3. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 63
3.1. Источник и материал для выделения чистых
культур одноклеточных бесцветных серобактерий . 63
Состав сред, используемых для выделения и культивирования микроорганизмов 63
Физиолого-биохимические тесты 66
Методы изучения морфологии, цитологии и ультратонкого строения бактерий 67
Физико-химические методы анализа 69
Методы определения ферментативной активности. . 74
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 78
ГЛАВА 4. ВЫДЕЛЕНИЕ, КУЛЬТИВИРОВАНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА
ОДНОКЛЕТОЧНЫХ БЕСЦВЕТНЫХ СЕРОБАКТЕРИЙ 79
4.1. Выделение чистых культур и характеристика
бесцветных серных спирилл 79
Выделение чистых культур серных спирилл. 79
Морфология серных спирилл 81
Физиолого-биохимические свойства .... 90
Таксономическое положение серных спирилл
и описание новых видов рода Aquaspirillum 104
4.2. Выделение и характеристика бесцветных серобак
терий рода Macromonas Utermohl and Корре, 1924 114
Выделение чистых культур Macromonas . . 114
Морфология и ультраструктура клеток Macromonas 117
Культуральные и физиолого-биохимические свойства 118
Таксономическое положение выделенных штаммов Macromonas bipunc:tata .... 131
ГЛАВА 5. РОЛЬ НЕОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ СЕРЫ В ОБМЕНЕ
ВЕЩЕСТВ ОДНОКЛЕТОЧНЫХ И НИТЧАТЫХ СЕРОБАКТЕРИЙ 135
5.1. Ферменты серного цикла бесцветных серобактерий 136
Оксидазы неорганических серных соединений 136
Определение величины фиксации С0? в культуре Beggiatoa leptomitifoi>ms. . . 141
Редуктазы неорганических соединений серы 144
Связь процессов восстановления соединений серы у B.leptomitiformis с синтезом АТФ 156
5.2. Механизм окисления соединений серы у одноклеточ
ных и нитчатых бесцветных серобактерий .... 160
Окисление восстановленных серных соединений в культурах серных спирилл. . 161
Механизм окисления соединений серы Macromonas blpunc:tata 168
Образование перекиси водорода у одноклеточных и нитчатых серобактерий 171
Условия накопления элементарной серы внутри клеток одноклеточных серобактерий 175
Окисление соединений серы другими гетеротрофными бактериями 176
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 183
ВЫВОДЫ 191
СШСОК ЛИТЕРАТУРЫ 193
Введение к работе
Актуальность проблемы. Бесцветные серобактерии являются важными компонентами биоценозов пресноводных и морских местообитаний, характеризующихся присутствием сероводорода. Как известно, сероводород оказывает токсическое воздействие на многих гидробионтов, в том числе на молодь рыб, даже в минимальных концентрациях, не превышающих тысячных долей мг/л (Константинов, 1967; Ве<цемейер и др., 1981). Проблема охраны водных ресурсов от сероводородного загрязнения становится особенно актуальной в современных условиях в связи с ускоряющимся антропогенным воздействием на природные экосистемы. Развитие бесцветных серобактерий способствует удалению из среды сероводорода, что оказывает положительное влияние на биопродуктивность водоёма. Многие представители этой группы микроорганизмов - типичные обитатели сточных вод, где они участвуют в окислении сероводорода. В связи с этим их изучение представляет и практический интерес с точки зрения применения для очистки вод от сероводорода.
В теоретическом отношении они представляют многосторонний интерес по ряду причин.
К группе бесцветных серобактерий принадлежат гигантские, самые крупные, уникальные по ряду свойств прокариотные микроорганизмы. Некоторые из них рассматриваются бесцветными аналогами цианобактерий. Между тем, сведения о клеточном строении, метаболизме большинства представителей серобактерий, их родственных связях с другими группами организмов крайне ограничены.
Для выяснения биогеохимических превращений в цикле серы необходимо детальное знание организмов, катализирующих эти реакции. Между тем, вклад бесцветных серобактерий в эти процессы исследо-
ван недостаточно. Неполноту знаний о биологии бесцветных серобактерий убедительно демонстрируют все существующие монографии, обзоры и учебники. Бесцветные серобактерии представляют интерес и в историческом плане, ибо с их изучением в конце XIX века связано открытие С.Н.Виноградским хемосинтеза у бактерий.
Состояние вопроса, цели и задачи. В настоящее время для бесцветных серобактерий убедительно показана способность к окислению восстановленных соединений серы, но до сих пор не ясно, всегда ли эти реакции сопровождаются использованием в обмене выделяющейся при окислении энергии. Основной причиной недостаточной изученности бесцветных серобактерий является отсутствие методов культивирования для большинства представителей этой группы. За исключением единичных видов рода Beggiatoa, Thiothrix nivea до последнего времени подавляющее большинство представителей бесцветных серобактерий не были получены и исследованы в чистых культурах. Из-за отсутствия физиолого-биохимических исследований чистых культур невозможно использование современных принципов систематики этих организмов. В настоящее время она основана на морфологическом изучении объектов, обнаруживаемых в виде элементов биоценоза природных сред.
Таким образом, до настоящего времени не ясен основной вопрос о функциональной роли окисления соединений серы у нитчатых серобактерий и совершенно не исследованы процессы окисления серных соединений одноклеточных бесцветных серобактерий.
Диссертация посвящена дальнейшему изучению физиологии, морфологии, таксономии различных представителей нитчатых и одноклеточных бесцветных серобактерий.
Конкретные задачи работы состояли в следующем:
I. Разработка методов культивирования, выделение чистых
культур одноклеточных серобактерий.
Изучение морфологических, физиолого-биохимических и гено-типических свойств выделенных чистых культур бесцветных серобактерий.
Исследование механизмов окислительных реакций и ферментов, участвующих в метаболизме неорганических соединений серы у представителей нитчатых и одноклеточных серобактерий.
Выяснение физиологической роли соединений серы в обмене веществ выделенных культур серобактерий.
Научная новизна и теоретическая значимость работы. Разработаны методы культивирования одноклеточных серобактерий и впервые получены чистые культуры этих микроорганизмов. Исследование механизма биохимических реакций окисления соединений серы, ферментов серного метаболизма и некоторых особенностей углеродного метаболизма позволило доказать отсутствие способности к хемолитоавто-трофному и хемолитогетеротрофному обмену у выделенных культур серобактерий и выяснить функциональную роль серы в обмене веществ нитчатых и одноклеточных серобактерий. Доказано наличие перекис-ного механизма окисления соединений серы и отсутствие связи их окисления с использованием клетками энергии.
Принципиально новые сведения получены в отношении функциональной роли соединений серы у представителей нитчатых серобактерий. Показано, что нитчатые серобактерии Beggiatoa leptomitifor-mis способны осуществлять диссимиляционную редукцию тиосульфата и серы, используя их в качестве акцепторов, а не доноров электронов. Полученные результаты изменяют представление о типе обмена веществ, биологии исследованных представителей нитчатых серобактерий, их роли в круговороте серы и значительно расширяют знания о разнообразии метаболических путей у бесцветных серобактерий.
Определенный вклад внесен в изучение систематики бесцветных серобактерий. Использование современных методов геносистематики и детальное изучение фенотипических свойств чистых культур серобактерий позволило пересмотреть таксономическое положение бесцветных серных спирилл рода Thiospira. Показана их принадлежность к гетеротрофным спириллам рода Aquaspirillum. В соответствии с требованиями Международного кодекса бактерий описано несколько новых видов этого рода. Впервые даны описания диагнозов рода Macromonas и серных спирилл, соответствующие современным требованиям систематики.
Практическая ценность исследования. Бесцветным серобактериям принадлежит большая роль в сохранении окружающей среды от загрязнения, а именно - в удалении сероводородного заражения водоемов. Выделенные культуры бесцветных серобактерий могут оказаться полезными для использования в очистных сооружениях. Детальное знание физиологии и серного метаболизма представителей слабоизучен-ной группы микроорганизмов важно для понимания их роли в глобальном биогеохимическом цикле серы.
Полученные в работе результаты могут быть использованы при чтении курсов лекций по микробиологии в университетах, а также учреждениями, в которых проводятся исследования физиологии и экологии микроорганизмов цикла серы - Институте микробиологии АН СССР, кафедре микробиологии МГУ им.Ломоносова, Всесоюзной коллекции микроорганизмов АН СССР при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР, Институте гидробиологии АН УССР.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Всесоюзном совещании лимнологов "Круговорот веществ и энергии в водоемах" (Иркутск, 1981г.), на конференции молодых ученых Института микробиологии АН СССР (Москва, 1983г.) и представлены на Ш Между-
народном Совещании по гидромикробиологии в ЧССР (Братислава, 1981г.).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано три работы и две статьи сданы в печать.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, пяти глав, заключения, выводов и списка литературы. Материалы изложены на 217 страницах машинописного текста, включая 26 таблиц, 26 рисунков и 5 схем. Список литературы содержит 33 отечественных и 213 иностранных наименований работ.
Место проведения работы. Работа проведена в Институте микробиологии АН СССР в Отделе пресноводной и морской микробиологии (заведующий Отделом - доктор биологических наук Г.А.Дубинина). Исследования генетических свойств бактерий проводили совместно с сотрудниками ИНМИ АН СССР к.б.н. А.МДысенко и Н.А.Черных, а измерения АТФ - с сотрудником ИОАН СССР к.б.н. С.Д.Авиловой. Автор приносит им искреннюю благодарность.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ГЛАВА I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БЕСЦВЕТНЫХ СЕРОБАКТЕРИЙ
В окислительных реакциях биологического цикла серы в биосфере принимают участие микроорганизмы различных систематических групп. Среди этих групп микроорганизмов наиболее изучены в физиологическом отношении представители фототрофных серобактерий и тионовые бактерии. У представителей зеленых и пурпурных серобактерий (как и у некоторых аэробных фототрофов - цианобактерий) восстановленные соединения серы служат донорами электронов при фотоассимиляции углекислоты. Тионовые бактерии, представители родов Thiobacillus, Thiomicrospira и Sulfolobus используют сероводород и другие восстановленные соединения серы в качестве источника энергии и обладают хемолитоавтотрофным или хемолитогете-ротрофным типом обмена веществ. Многие представители этих родов достаточно хорошо изучены в физиологическом отношении. В последние годы у целого ряда новых микроорганизмов была описана способность к росту в автотрофних условиях за счет окисления соединений серы. Среди них имеются не только бактерии, отнесенные к новым родам, но и обнаружена способность к росту в хемолитоавтотрофных условиях при окислении тиосульфата у ранее известных видов. К новым родам отнесены облигатные ацидофильные термофилы Suifobacii-lus, Thermothrix. Из известных ранее микроорганизмов использование энергии окисления тиосульфата для автотрофного роста обнаружено у представителей некоторых водородных бактерий - Aquaspi-rillum autotrophicum, Paracoccus denitrificans, Xantobacter au-totrophicus и Pseudomonas palleronii (Wiegel et al., 1978; Pridrich, Mitrenga, 1981).
- II -
При развитии в микроаэрофильных условиях в темноте способность к хемосинтезу за счет окисления неорганических соединений серы проявляют и некоторые пурпурные серные бактерии.
Помимо этого, известны и другие литотрофные микроорганизмы, способные к осуществлению окисления восстановленных соединений серы, для которых физиологическое значение указанных окислительных реакций остается пока неясным.
Среди этих микроорганизмов наибольший интерес представляют так называемые бесцветные серобактерии. Они известны очень давно, привлекают интерес специалистов благодаря своеобразию морфологических, физиологических свойств и массовому развитию в природе.
В морфологическом отношении они характеризуются крупными размерами клеток разнообразной формы. Их развитие в природе нередко достигает огромных масштабов и всегда приурочено к местам, характеризующимся одновременным присутствием сероводорода и кислорода .
Отличительной особенностью и критерием для отнесения к группе бесцветных серобактерий является способность к внутриклеточному накоплению включений элементарной серы при наличии сероводорода в среде обитания.
Группа бесцветных серобактерий объединяет прокариотные грам-отрицательные микроорганизмы, способные к внутриклеточному накоплению элементарной серы при развитии в присутствии сероводорода. Важным экологическим признаком, отличающим их от других гетеротрофных микроорганизмов, способных накапливать серу внутри клетки, является приуроченность их местообитаний к сероводородным биотопам.
Бесцветные серобактерии неоднородны в систематическом отношении и включают представителей таксонов разного ранга. Сюда от-
носятся трихомные скользящие и прикрепленные бактерии и крупные одноклеточные бактерии разнообразной морфологии.
Подразделение на роды в группе бесцветных серобактерий проводится на основе морфологии клетки: формы, подвижности и характеру движения. К бесцветным серобактериям относят 8 родов бактерий.
Одноклеточные бесцветные серобактерии включают представителей родов Achromatium, Macromonas, Thiovulum, Thiospira, Thio-bacterium.
К трихомным формам бесцветных серобактерий относятся представители родов Beggiatoa, Thiothrix, Thloploca.
Известно также, что окисление восстановленных соединений серы, сопровождаемое в ряде случаев накоплением серы внутри клеток, свойственно многим гетеротрофным микроорганизмам из различных таксономических групп. К ним относятся, например, грибы Fusarium solani (Wainwright, Killman, 1980), Aureobasidium pullulans (Killman et al., 1981), дрожжи рода Rhodotorula (Kurek, 1979, 1983) и гетеротрофные бактерии Pseudomonas fluorescene, P.aeruginosa, Achromobacter stutzeri (Starkey, 1934; Schook, Berk, 1979), представители рода Microococcus (Pepper, Miller, 1978), ряд неидентифицированных бактериальных организмов (Trudinger, 1967а; Tuttle et al., 1974; Tuttle, Jannasch, 1977; Tuttle, 1980), актиномицеты представители рода Streptomyces (Yagi et al., 1971) и другие. К этой же группе гетеротрофных организмов, по-видимому, следует отнести вид, ранее описанный как Thiobacilius trautweinii (Trautwein, 1921, 1924), близкий Pseudomonas, у которого окисление соединений серы не связано с энергетическим обменом. Накопление серы в клетках при культивировании в микроаэро-фильных условиях в присутствии сероводорода в среде отмечено у
- ІЗ -Sphaerotilus natans (Skerman et al., 1957), Leptothrix pseudo-ochraceae (Дубинина, 1977), Campylobacter штамм 5175 (Wolf, Pfennig, 1977), грибов Fusarium (Wainwright, 1978).
Хотя в определенных экологических условиях гетеротрофные микроорганизмы, окисляющие соединения серы, могут численно преобладать среди других микроорганизмов, участвующих в этом процессе (Вайнштейн, 1975; Trudinger, 1967а; Wainwright, 1978) о НИХ известно немного.
Роль процессов окисления серных соединений в обмене веществ остается пока не ясной, а вклад гетеротрофных микроорганизмов в баланс окислительных процессов круговорота серы исследователями обычно не принимается во внимание.
I.I. Одноклеточные бесцветные серобактерии I.I.I. Систематика одноклеточных серобактерий
Ни один из представителей этой группы серобактерий не был выделен в чистую культуру. Поэтому все сведения об одноклеточных серобактериях накоплены только на основании экологических наблюдений за развитием этих организмов в природных условиях. Причем основные сведения о них остаются в основном на уровне их первоначального описания исследователями в конце прошлого - начале нашего века (Надсон, 1914; Hinze, 1903; Omelianski, 1905; Molish, 1912; Lauterborne, 1915; Kolkwitz, 1918; Gicklhorn, 1920; Hadson, Wislouch, 1923; Bavendamm, 1924; Koppe, 1924).
Позже исследователями был описан еще ряд морфологических видов бесцветных серобактерий (Владимирова, 1958; Перфильев, 1969; Lackey, Lackey, 1961).
Некоторые дополнительные сведения получены путем наблюдения
за развитием в лабораторных условиях природных популяций, обогащенных исследуемым организмом, с имитацией природных условий. Такие наблюдения проведены с Thiovulum ma jus Ла Ривьером с соавторами и Яннашем и Вирсеном (La Rivier, 1963, 1965; Wiraen, Jan-nasch, 1978) и Achromatium oxaliferum (De Boer et al., 1961). Применение вышеуказанных методов культивирования позволило выяснить некоторые физиологические потребности исследованных бактерий и особенности их морфологии и ультраструктуры.
Морфологические признаки одноклеточных серобактерий суммированы в табл.1.
Существующие методы определения как видовой, так и родовой идентификации бесцветных серобактерий основаны на перечисленных в таблице свойствах. Деление на виды внутри рода принято лишь на основе различий в размерах клеток (Bergey's, 1974). Ниже приведен ключ для определения родов и видов одноклеточных бесцветных серобактерий (Горленко и др., 1977) (рис.1).
Ключ для определения одноклеточных бесцветных серобактерий
А. Обладают подвижностью
а. Клетки круглые или овальные диаметром от 5-7 мкм до 30-100 мкм, обладают слабым вращательным движением за счет выделения слизи, содержат включения серы и оксалатов-Achromatium. Известно два вида - A.oxaliferum и A.volutans.
аа. Клетки круглые или яйцевидные от 5 до 20 мкм диаметром, перитрихи, капли серы располагаются по полюсам-Thiomlum. Имеется один вид - Т. ma jus.
ааа. Клетки 3-14 и 10-30 мкм, цилиндрические или слегка изогнутые, содержат крупные кристаллы СаСОд и мелкие капли серы, имеют один толстый полярный жгутик-Macromonas. Известно два вида отличающиеся по размеру клеток и включений M.mobilis и M.bipunc-
Таблица I Морфологическая характеристика представителей одноклеточных бесцветных серобактерий*
Род и вид
Форма клеток
Размеры, мкм (пределы)
Включения в клетке
Наличие и тип движения
Источник
Aohromatium A. oxalif erum, A.volutans
Овальная или сферическая
5-7x30-100 СаСОо (или скользящее De Boer et ai.,
оксалат) 19.71
сера
Macromonas M.mobilis M. bipunctata
Thiovulum Т.majus
От цилиндрических до грушевидной
Овальные или сферические
3-9x8-20
толстый
полярный
жгутик
сера перитри-хиальное жгутикование
Lauterborn, 1915
Бе Boer et ai., І9&1J WIrsen, Jannasch, 1978
I
Thiospira
T.winogradskii
T.bipunctata
Спирально изогнутая
2,0^3,5x50 1,7-2,4x6,6-14
сера
полярный жгутик
Омелянский, 1905; Molisch, 19-12
Thiobacterium T.bovista
Палочковидные клетки, погруженные в желеобразную массу
0,6-1,5x2,5
сера
неподвижные
Lackey, Lackey, 1961
По Ьа Riviere, Schmidt, 1981
Рис.1 Бесцветные серобактерии
S - сера, Са - включения соединений кальция, шкала - 2 мкм.
Beggiatoa
Thiothrix
Thioploca
Thiospira
Macromonas mobilis
Macromonas bipunctata
Thiovulum
Achromatium
tata.
aaaa. Клетки спиральные с включением серы, имеют полярные жгутики-Thiospira. Известно два вида - T.winogradskii и T.bipunctata.
Б. Неподвижны
а. Клетки 0,6-1,5 х 2,5 мкм заключены в железообразную мас-cy-Thiobacterium. Известен один вид - T.bovista.
Более подробно описание основных представителей бесцветных серобактерий, а также истории их изучения приведены в вышеуказанных работах, а также в сборниках последних лет (Заварзин, 1972; La Riviere, 1974; La Riviere, Schmidt, 1981). Однако все существующие обзоры ярко демонстрируют неполноту знаний относительно физиологических особенностей, прежде всего роли серных соединений в метаболизме и типов обмена веществ этих микроорганизмов.
I.I.2. Условия развития одноклеточных серобактерий в природе
Сведения по физиологии одноклеточных серобактерий ввиду неудач в получении чистых культур весьма скудны и ограничены лишь результатами экологических наблюдений над развитием в природных условиях. Бесцветные серобактерии - типичные водные микроорганизмы, широко распространенные в пресных и морских водоемах. Их развитие приурочено к определенным экологическим нишам, характеризующимся присутствием невысоких концентраций сероводорода, порядка долей - нескольких мг/л. Их места обитания характеризуются одновременно и наличием достаточных концентраций органических веществ. Многие из них - постоянные обитатели ниш, где происходит разложение отмершей водной растительности, листового опада. Как правило, подобные условия характерны для границы окислительно-восстанови-
тельной зоны на разделе вода-грунт, реже - в зоне хемоклина озер, в донных осадках серных источников, в сточных водах. Это типичные "градиентные" микроорганизмы, существующие в неравновесных условиях среды. Возможность существования в таких меняющихся условиях среды определяется наличием ряда приспособлений для миграции в зону оптимальных условий развития. К ним относятся наличие активной подвижности у большинства представителей этой группы, заметно выражен хемотаксис.
Неподвижные формы (Thiohacterlum bovista) приспособлены к прикрепленному образу жизни в условиях постоянного подтока сероводорода на дне мелководных сероводородных источников (Lackey, Lackey, 1961), реже - на поверхности донных отложений мелководных водоёмов. В серных источниках бактерии растут в виде дендро-видных колоний, погруженных в слизистую массу, и прикрепленных к твердому субстрату близко к водной поверхности.
Потребность одновременно в кислороде и H2s определяет их развитие к микроаэрофильных условиях.
По мнению большинства исследователей, одноклеточные серобактерии - строгие микроаэрофилы. Отсутствие исследований в этом плане не позволяет выяснить влияние концентрации кислорода на их развитие. Большей частью наблюдения по влиянию экологических факторов на развитие отдельных видов серобактерий носят качественный характер.
Детальное изучение зависимости поведения и развития Thiovuium в природной обстановке от содержания о2 и H2s получены недавно Юргенсеном (Jorgensen, Revsbach, 1983) с применением селективных микроэлектродов. Автор установил важную роль слизистой взвеси, образуемой клетками Thiovuium и хемотаксиса в снабжении клеток минимальными концентрациями оР и hps. Слизистая взвесь
служит не только твердым субстратом между микроаэрофильной и сульфидсодержащими микрослоями воды, толщиной не более 50 мкм, вдоль которой постоянно мигрируют клетки, но и своего рода "физическим" барьером, препятствующим диффузии, смешению и химическому взаимодействию H2S и о2 при микротурбулентном движении клеток.
Концентрация о2 и H2s в зоне развития бактерий находится в пределах не более 10 мкМ/л. Образование слизистой взвеси, таким образом, рассматривается авторами как стратегия бактерий для стабилизации оптимальных условий в микрозоне развития.
I.I.3. Культивирование одноклеточных серобактерий
Неудачные попытки выделения чистых культур представителей одноклеточных серобактерий заставили исследователей применить ряд приемов имитации естественных условий для культивирования природных популяций, обогащенных тем или иным видом серобактерий. А это позволило в ряде случаев наблюдая за развитием получить новые сведения по влиянию концентрации кислорода, сероводорода, добавок различных органических субстратов на рост бактерий.
Кроме того, наличие материала, обогащенного клетками исследуемых микроорганизмов, способствовало проведению микроскопических и электронномикроскопических исследований.
Наиболее удачным оказался метод, предложенный Ля Ривьером (La Riviere, 1963, 1965) по поддержанию роста в колбах на морской воде с H2s, в которых создавался градиент о2 и H2s за счет медленного пропускания тока воздуха. Усовершенствованный метод культивирования Thiovulum в проточной системе предложен Бирсеном и Яннашем (Wirsen, jannasch, 1978). Согласно этому методу, куль-туральный сосуд соединяют полупроницаемой мембраной с источником
HgS, подается проток стерильной морской аэрированной воды. Заражение культурального сосуда осуществляется обогащенной суспензией Thiovulum из природной популяции. Развитие бактерий происходит в зоне одновременного присутствия H2s и о2. Регулируя скорость подачи воды, можно добиться необходимых концентраций кислорода в сосуде. Авторы провели эксперименты с меченной углекислотой, *30о и некоторыми органическими соединениями, с достаточно очищенной от контаминантов суспензией Thiovulum. Они показали зависимость С02-фиксации от наличия H2S в среде и отметили отсутствие заметного потребления клетками углерода казаминокис-лот, ацетата, глготамата и маннита.
Эти результаты авторы рассматривают как подтверждение хемо-литоавтотрофной природы Thiovulum. Однако, эти выводы авторов недостаточно убедительны по следующим причинам: при проведении опытов в вышеуказанных условиях не исключена возможность присутствия в используемой отмытой популяции Thiovulum мелких клеток хемоавтотрофных тионовых бактерий, ответственных за фиксацию
COg. Отсутствие же стимуляции роста Thiovulum органическими добавками, рассматриваемое как указание на отсутствие гетеротрофного роста, могло быть обусловлено тем, что эти соединения не входят в спектр используемых Thiovulum органических субстратов. Таким образом, хотя полученные результаты и указывают на возможность автотрофного роста Thiovulum, их нельзя принять в качестве убедительных доказательств.
Наряду с попытками культивирования одноклеточных микроорганизмов в 'автотрофних условиях, Владимирова (1958) попыталась культивировать Thiospira на минеральной среде с дрожжевым авто-лизатом. Рост накопительной культуры Thiospira sp. (1,0-2,0 мкм х 3,4-7,6 мкм) был получен при использовании следующего приема
культивирования.
В стерильные пробирки наливался на 1/5 расплавленный агар с минеральной средой Ван-Ниля для пурпурных серобактерий, содержащей 2 г/л Ha2s.9H2o. Поверх застывшего агара наливали почти доверху стерильную водопроводную воду. Крупные спириллы на минеральной жидкой среде развивались только в присутствии дрожжевого автолизата. Чистую культуру автору не удалось получить.
Попытки исследователей культивирования других одноклеточных серобактерий на питательных средах либо в пробах природного материала были неудачными (Molisch, 1912; Lackey, Lackey, 1961; La Riviere, Schmidt, 1981 и др.).
Таким образом, методы культивирования одноклеточных бесцветных серобактерий отсутствуют. До настоящего времени не удалось получить чистые или накопительные культуры ни одного из известных представителей этой группы микроорганизмов. Вследствие этого остаются не исследованы типы обмена веществ основных представителей одноклеточных серобактерий и отсутствуют доказательства предположения о хемолитоавтотрофии.
1.2. Нитчатые бесцветные серобактерии I.2.I. Систематика нитчатых серобактерий
Трихомные формы бесцветных серобактерий представлены родами Beggiatoa Trevisan, 1842, 56; Thiothrix Lauterborn, 1907, 242; Thioploca Lauterborn, 1907, 242.
В последнее время все три рода включены в порядок Cytopha-gales (Leadbetter, 1974) на основании способности трихомов или отдельных клеток к скользящему движению. Роды Beggiatoa и Thioploca относятся к семейству Beggiatoaceae, род Thiothrix - к
- 23 -семейству Leucothrixaceae (Weissner, 1981).
Результаты физиологического изучения нитчатых серобактерий обобщены в ряде обзоров последнего десятилетия (Заварзин, 1972; Weissner, 1981; Larkin, Strohl, 1983). Ниже дано краткое описание основных представителей нитчатых серобактерий и далее рассмотрены материалы по метаболизму соединений серы и углерода.
Род Beggiatoa Trevisan, 1842. Представители этого рода относятся к наиболее известным бесцветным серобактериям. Это объясняется не только их массовым развитием и широким распространением в природе, но и тем, что это практически единственные представители бесцветных серобактерий, которые удалось получить в чистой культуре в ряде лабораторий исследователям разных стран. Практически все сведения о физиологии нитчатых бесцветных серобактерий базируются на изучении отдельных представителей рода Beggiatoa.
Род Beggiatoa включает организмы трихомного строения, которые откладывают серу внутри клеток, обладают скользящим движением и не имеют чехлов. При скольжении нити выделяют слизь полисаха-ридного состава (Strohl, Larkin, 1978а).
В настоящее время род Beggiatoa включает шесть морфологических видов (weissner, 1981). Таксономическая дифференциация видов в пределах рода Beggiatoa и других бесцветных серобактерий остается важной проблемой. До сих пор она основана на использовании в качестве диагностического признака только ширины трихома (Bergey's, 1974):
Виды Beggiatoa
диаметр трихома, мкм
В.alba (Vaucher, 1803) Trevisan, 1845 2,5-5,0
B.arachnoidea (Agardh, 1827) Rabenhorst, 1865 5,0-14,0
Виды Beggiatoa
Диаметр трихома, мкм
B.leptomitiformis Trevisan, 1842 1,0-2,5
В.minima Winogradsky, 1888 1,0
B.gigantea KLass, 1937 26,4-55,0
B.mirabilis Conn, 1865 15,0-21,5
Изучение чистых культур показывает, что близкие по морфологии "виды" могут значительно различаться по физиологическим свойствам (Pringscheim, 1964; Strohl, Larkin, 19786).
Типовой вид: Beggiatoa alba (Vaucher) Trevisan, 1945, 58. Содержание ГЦ в ДНК для в.alba штамм В 18 ld составляет 41 мол.$. В.alba (Faust, Wolfe, 1961; Cataldi, 1940; Scotten, Stokes, 1962; Pringscheim, 1964; Strohl, Larkin, 1978a,6; Mezzino et al., 1984), B.leptomitiformis (Burton, Morita, 1964; Pringscheim, 1964; Nelson, Castanholz, 1981a), B.mirabilis (Nelson et al., 1982) были получены в чистые культуры.
Род Thioploca Lauterborn, 1907, 242. Нити Thioploca имеют толстый слизистый чехол, в который заключены трихомы организма. В одном чехле бывает от одной до двадцати нитей, которые переплетаются между собой и сохраняют подвижность. Хотя нити, заключенные в одном слизистом футляре, могут различаться по толщине, диаметр трихомов используется для диагностики видов.
Типовой вид: Thioploca schmidlei Lauterborn, 1907, 242.
Род Thioploca состоит из четырех видов: Thioploca schmidlei (диаметр отдельной нити (d = 5-9 мкм), Thioploca ingrica (d = 2-4,5 мкм), Thioploca minima (d = 0,8-1,5 мкм), Thioploca mixta (d = I мкм и 6-8 мкм). Морские крупные формы имеют ширину клеток
до 30-40 мкм, однако они не получили видового названия (Gallardo, 1977). Организмы, принадлежащие к этому роду, распространены в морском и пресноводном иле, богатом кальцием. Недавно массовое развитие Thioploca с образованием мощного слизистого слоя обнаружено в океанском бентосном сообществе вблизи Перу на глубинах 60-280 м (Gallardo, 1977; Morita et al., 1981). Ни один из видов Thioploca не был получен в чистой культуре.
Род Thiothrix winogradsky, 1888, 39. Представители этого рода включены в семейство Leucotrichaceae порядка Cytophagales.
К роду Thiothrix Виноградским были отнесены прикрепленные трихомные серобактерии, способные формировать розетки.
Thiothrix имеет прямые нити, которые прикрепляются своим расширенным основанием к субстрату. У основания нитей Thiothrix имеется прикрепительный слизистый диск. Клетки по длине трихома различаются по размерам и по форме от цилиндрических до округлых. На свободном конце нити формируются гормогонии в виде округлых клеток, обладающих скользящим движением. Размножение Thiothrix происходит с помощью гормогонии, которые, освободившись из чехла свободного конца нити, прикрепляются с помощью слизистого диска к субстрату и дают начало новой нити. Характерной особенностью Thiothrix яеляєтся способность к образованию розеток.
Следует отметить, что виды Thiothrix являются морфологическими аналогами Leucothrix, но отличаются способностью к накоплению внутри клеток элементарной серы, что никогда не происходит у последних даже в присутствии H2s в среде.
Подразделение на виды, как и у Beggiatoa, основано на различиях в ширине трихома, размеры которого варьируют от 0,5 мкм до 30 мкм у различных видов. В литературе описано семь видов этого рода, различающихся по ширине трихомов. Однако, таксономическая
ценность их описания недостаточно убедительна вследствие крайне ограниченных сведений, полученных путем единичных наблюдений. В восьмом издании определителя Берги и в списке одобренных названий (Skerman et al., 1980) приведен всего один вид T.nivea, признанный типовым видом рода.
Thiothrix распространен в серных источниках с невысокой концентрацией сероводорода. Способность к прикреплению дает преимущество этим организмам для развития в проточной среде.
Единственно чистая культура Thiothrix sp. получена лишь в 1980 году (Larkin, 1980) с применением способов культивирования и сред с органическим веществом, применяемых для выделения Beg-glatoa.
1.2.2. Особенности морфологии и ультраструктурной организации нитчатых серобактерий
Нитчатые серобактерии имеют заметное морфологическое сходство с определенными представителями цианобактерий. Морфологический параллелизм можно провести между представителями родов Beggiatoa и Oscillatoria (Pringscheim, 1949; Reichenbach, 1981), Thiothrix И Rivularia (Reichenbach, 1981) или Lingbia (Pringscheim, 1963).
Морфологическое сходство с цианобактериями выражается не только в строении трихомов и жизненном цикле, у Beggiatoa оно обнаруживается в способах деления трихома гормогониями с помощью образования некротических участков (Strohl, Larkin, 19786) и в строении клеточной стенки, наличии сложного мембранного аппарата (Strohl, Larkin, 19786; Strohl et al., 1982). Это послужило основанием рассматривать указанные нитчатые серобактерии, как и некоторые другие, морфологически сходные с цианобактериями бесцветные нитчатые бактерии, например, Pelonema, в качестве бес-
цветных цианобактерий. Кроме того, недавно предложено включить их в состав нового класса Cyanomorphae с выделением в самостоятельный порядок бесцветных аналогов цианобактерий, обладающих своеобразным обменом; сюда предлагается включить и другие морфологически сходные с цианобактериями роды бесцветных нитчатых бактерий, в частности, Leucothrix (Reichenbach, Dworkin, 1981). Однако, в настоящее время, по-видимому, нет достаточных оснований для подобного рода группировки физиологически различных и малоизученных групп бесцветных организмов с истинными цианобактериями.
Как видно из предыдущего раздела, группа бесцветных нитчатых серобактерий объединяет прокариотные организмы довольно сложного строения.
У Beggiatoa трихомы состоят из клеток, которые отделяются цитоплазматической мембраной и пептидогликановым слоем клеточной стенки, тогда как остальные слои клеточной стенки не участвуют в образовании перегородок, а тянутся вдоль трихома. Клеточная стенка содержит пептидогликановый слой, что характерно для грам-отри-цательных бактерий, но более сложного строения, и имеет сходство со стенкой Oscillatoria. У разных видов она имеет 4 или 5 слоев (Maier, 1974; Strohl et al., 1981a, 1982). Трихомы обладают скользящим движением и выделяют слизь полисахаридного состава.
Внутриклеточные включения у нитчатых серобактерий представлены серой, полиоксибутиратом и волютином. Наибольший интерес при изучении ультраструктуры нитчатых серобактерий представляют данные о внутриклеточной сере. Гранулы серы появляются в клетках в присутствии в среде сульфидов (а у некоторых штаммов - тиосульфата). Исследования срезов показывают, что серные включения располагаются между клеточной стенкой и цитоплазматической мембраной. Они окружены у одних штаммов цитоплазматической мембраной (Maier,
Murray, 1965; Strohl et al., 1981a), у других - ОДНОСЛОЙНОЙ либо пятисложной мембраной. С помощью микрорентгеноструктурного анализа подтвержден элементарный состав серы в этих включениях (Lowry et al., 1981). Предполагается, что она находится в "жидком" состоянии аналогично тому, что показано у пурпурных серобактерий Cromatium (Uicolson, Schmidt, 1971).
У других нитчатых серобактерий - Thiothrix и Thioploca серные гранулы располагаются так же, как у Beggiatoa, в инваги-натах цитоплазматической мембраны (Bland, Staley, 1978; Maier, Murrey, 1965).
У Thiothrix трихомы заключены в тонкое влагалище, наличие которого не всегда признается (Bergey»e, 1974); хотя в последнее время достоверно доказано при изучении ультратонких срезов (Bland, Staley, 1978; Larkin, 1980). Цикл развития Thiothrix был описан С.Н.Виноградским (Winogradskii, 1887), который впервые описал размножение с помощью подвижных гонидий, обладающих скользящим движением. Гонидий образуются в отличие от морфологически близких видов Leucothrix не по всей длине трихома, а лишь внутри неприкрепленного конца трихома. Недавно установлено, что гонидий имеют множество фимбрий (Larkin, Strohl, 1983), принимающих, вероятно, участие в формировании розеток.
Строение трихома у Thioploca сходно с Beggiatoa. Трихомы Thioploca по морфологии очень близки Beggiatoa. Б отличие от последней, они заключены в общее слизистое влагалище. По наблюдениям, выползающие из чехла индивидуальные трихомы внешне не отличимы ОТ Beggiatoa (Корре, 1924).
Интересной морфологической особенностью, свойственной лишь крупным формам всех нитчатых серобактерий, является наличие огромных вакуолей или пустот, заполняющих почти все пространство
клетки. В этих случаях цитоплазма и включения серы располагаются по периферии, "прижаты" к клеточной стенке (Maier, Murrey, 1965; Larkin, strohl, 1983). Предположительно, подобное строение клеток носит приспособительный характер, позволяя гигантским клеткам поддерживать оптимальное соотношение поверхности к объему для удовлетворения питательных потребностей. Подобные вакуоли или "пустоты" обнаружены и у крупных морских видов Thiovulum (Wirs-sen, Jannasch, 1978).
1.2.3. Вопрос о хемолитоавтотрофии бесцветных
серобактерий
Нитчатые серобактерии сыграли огромную роль в истории микробиологии. В результате наблюдений над нитями Beggiatoa в микрокультуре С.Н.Виноградский (1952) пришел к выводу, что окисление сероводорода приводит к отложению внутри клеток капель серы, которые после исчезновения в среде сероводорода могут окисляться далее до серной кислоты. Окисление h2s сопровождается ростом клеток, а его удаление из среды тормозило рост и приводило к гибели клеток. Работы С.Н.Виноградского по изучению Beggiatoa послужили основой создания концепции аноргоксидации или хемосинтеза у бактерий. Дальнейшее подтверждение идеи об использовании энергии окисления серы для роста Beggiatoa было получено Кейлом (Keil, 1912). Ему удалось получить чистую культуру Beggiatoa sp. на минеральной среде в атмосфере с низким парциальным давлением кислорода и низким содержанием H2s, н2 и со2. Однако, позже результаты этих экспериментов Кейла Прингсхейм (Pringscheim, 1967, 1970) подверг сомнению и высказал предположение о миксотрофном росте Beggiatoa в опытах Кейла.
В последующих исследованиях, несмотря на предпринятые попыт-
- зо -
ки, не были получены результаты, подтверждающие способность Beg-giatoa и других серобактерий к росту в автотрофних условиях (Faust, Wolfe, 1961; Scotten, Stokes, 1962; Burton, Morita, 1964; Kowalik, Pringscheim, 1966, 1967; Nelson, Castenholz, 1981a; Nelson et al., 1982).
Многочисленные штаммы чистых культур различных видов Beggia-toa после работы Catalgi (1940) были выделены с использованием органических веществ. Выделенные в этих условиях чистые культуры обладали способностью к отложению серы в клетках, но не росли как автотрофы, без добавления органического субстрата. В то же время все изоляты обладали способностью к гетеротрофному росту. Хотя присутствие в среде H2S оказывало стимулирующее влияние на урожай клеток в культурах Beggiatoa. Поскольку для успешного культивирования присутствие в среде сероводорода оказывало благоприятное влияние на рост Beggiatoa, то в дальнейшем укрепилось представление о том, что бесцветные серобактерии являются литоге-теротрофными микроорганизмами, нуждающимися в органическом веществе для конструктивного обмена и в окислении серы для энергетических потребностей (Pringsheim, 1967, 1970; Strohl et al., I98I6; Gude et al., 1981). Однако, до сих пор этот вопрос не решен окончательно. Поэтому проблема культивирования и выделения чистых культур нитчатых серобактерий остается первостепенной в их изучении.
Лишь в самое последнее время Нельсон и Яннаш (Nelson, Jan-nasch, 1983) изолировали из морских осадков Beggiatoa alba штамм MS-81-6 и показали его способность к автотрофному росту в условиях пониженного парциального давления кислорода - в полужидкой среде с 0,2% агара и сульфидом, диффундирующим в эту среду из слоя агара на дне пробирки. В культурах в.alba, где создавался
- ЗІ -
градиент HgS и o2, происходил слабый рост бактерий. Доказательствами хемолитоавтотрофного роста служили следующие показатели:
а) прирост биомассы был пропорционален концентрации h2s в
нижнем слое агара (и, вероятно, его содержанию в полужидкой сре
де - за счет диффузии снизу);
б) около 90$ углерода биомассы образовывалось из СС^, что
показано с помощью х С-метки углекислоты;
в) бесклеточный экстракт содержал риболезодифосфат-карбокси-
лазу.
В то же время выделенная культура в.alba обладала способностью расти и гетеротрофно в среде с ацетатом, что позволяет отнести ее к миксотрофам.
Таким образом, облигатно автотрофные виды Beggiatoa пока не удалось выделить, но способность к автотрофному росту у крупных морских форм показана достаточно убедительно. Это указывает на существование нескольких физиологических типов нитчатых серобактерий. Наряду с гетеротрофными представителями, способными окислять соединения серы, существуют миксотрофные; не исключено, вероятно, и существование в природе облигатно хемолитоавтотрофных видов нитчатых серобактерий. Решение этого вопроса, так же как функциональной роли соединений серы при гетеротрофном росте серобактерий, составляет задачи дальнейших исследований.
1.2.4. Углеродный метаболизм
Большинство выделенных штаммов Beggiatoa обладает требованием к наличию органического вещества в среде. В отличие от типичных гетеротрофных бактерий все выделенные культуры Beggiatoa не способны расти на белковых или других средах, содержащих в качестве органического углерода высокополимерные соединения, что ука-
_ *Э9 _
зывает на отсутствие у них гидролитических ферментов. Наилучшим субстратом для роста у большинства исследованных в этом отношении штаммов является ацетат. Хороший рост бактерий поддерживают лактат, сукцинат и пируват, у отдельных штаммов - некоторые аминокислоты (аспартат, глутамат). Как правило, аминокислоты, за исключением вышеуказанных, и сахара не используются различными штаммами Beggiatoa (Burton, Morita, 1964; Scotten, Stokes, 1962; Burton et al., 1966; Pringsheim, 1964, 1967; Nelson, Castenholz, I98I6; 1982; strohl et al., I98I6). Относительно углеродного обмена у представителей других родов нитчатых серобактерий сведения крайне ограничены. Единственная чистая культура Thiothrix выделенная Ларкиным (Larkin, 1980), росла только в присутствии органических веществ в среде. Из многих испытанных органических соединений, как и у Beggiatoa, только органические кислоты ЦТК поддерживают рост Thiothrix, причем наилучшим субстратом является ацетат.
Относительно углеродного обмена Thioploca сведения противоречивы. Ввиду отсутствия чистых культур, исследования углеродного обмена были проведены с применением различных меченых по углероду
С субстратов в пробе с природной популяцией нитей этого организма из морских осадков. Однако полученные разными авторами сведения противоречивы. Согласно Морита с соавторами (Morita et al., 1981), нити Thioploca не накапливали метку ч? из ацетата, смеси меченых аминокислот, глюкозы, тимидина, а также меченого бикарбоната. В противоположность этому, Мейер с соавторами (Маіег, 1982) с применением радиоактивного метода показали значительное вхождение метки из вышеуказанных субстратов в случае присутствия сульфидов в пробах. Согласно заключению автора, это характеризует возможность наличия у Thioploca миксотрофного обмена.
Ферментативные пути использования органического углерода исследованы лишь у ограниченного числа культур. Согласно ранним исследованиям Буртона с соавторами (Burton et al., 1966), yBeg-giatoa sp. использование ацетата отмечалось только в присутствии дрожжевого экстракта. Ряд ключевых ферментов ЦТК (пируваткиназа, цитратсинтаза, фосфопируватгидратаза) не был ими обнаружен. В противоположность этому, Нельсон и Кастенхольц (ueison, Casten-holz, I98I6) показали функционирование у B.leptomitifoimis ЦТК и глиоксилатного цикла. Аналогичные данные получены в отношении В.alba штамм B18LD (LarfoLn, Strohl, 1983). Можно полагать, что у разных штаммов и видов Beggiatoa использование органического углерода может идти различными путями.
Большой интерес представляет изучение фиксации СС^ у Beggiatoa. Согласно исследованиям Буртона с соавторами (Burton et al., 1966) у B.leptomitiformis фиксация COg осуществляется при участии НАДФ-зависимой изоцитратдегидрогеназы в восстановительном ЦТК. Однако другие ферменты, необходимые при функционировании этого пути - аконитаза, фумараза, ФЕП-карбоксилаза и «/-кетоглу-таратсинтаза - не были авторами обнаружены. При исследовании B.leptomitiformis Ларкиным и Штролем было подтверждено наличие этих ферментов, но активность их оказалась низкой (Larkin, Strohl, 1983).
У в.alba B18LD фиксация COg протекает с участием НАДФ-свя-занного малик-энзима и изоцитратдегидрогеназы. При росте на средах с сульфидом и ацетатом в хемостатной культуре этого штамма бактерий заметное увеличение урожая клеток не было связано с использованием энергии окисления сульфида на фиксацию С0. Авторами было показано отсутствие в клетках рибулезодифосфаткарбоксилазы ключевого фермента цикла Кальвина (Strohl et al., I98I6). Таким
образом, при росте в присутствии органических веществ и сульфидов в среде у В.alba автотрофный путь фиксации СС^ отсутствует.
Вместе с тем, наличие в клетках рибулезодифосфаткарбоксила-зы, сопоставимой по активности с таковой у других автотрофов, было показано Нельсоном и Яннашем (Nelson, Jannasch, 1983) у в.alba MS-81-6 при росте в среде с сульфидом в микроаэрофилышх условиях. Наряду с данными о значительной величине фиксации С02 (87% от прироста органического углерода) это убедительно свидетельствует о способности этого штамма Beggiatoa к автотрофному существованию.
Из вышеизложенного следует, что различные представители нитчатых серобактерий характеризуются наличием разных типов углеродного обмена. Среди выделенных в настоящее время культур Beggiatoa достоверно показана способность к хемолитоавтотрофному существованию лишь у одного штамма В.alba MS-81-6 (Nelson, Jannasch, 1983). Все другие культуры, для выделения которых исследователями использовались среды с низкой концентрацией органических веществ и восстановленными соединениями серы, обладают гетеротрофным типом обмена веществ. Предпринятые рядом исследователей попытки доказать хемолитоавтотрофный рост в этих условиях, при окислении соединений серы и использовании органических веществ в среде, не были убедительными (Pringsheim, 1967; Gude et al., 1981; Strohl et al., I98I6). Так, присутствие сульфида в среде вызвало двухкратное увеличение урожая клеточной биомассы у в.alba B18LD и приводило к заметному снижению скорости окисления ацетата (strohl et al., I98I6; Gude et al., 1981). Основываясь на этих результатах, вышеупомянутые авторы рассматривают эти результаты основанием для утверждения о миксотрофии (литогетеротрофии) исследованного штамма Beggiatoa. Однако расчеты, проведенные Куненом и Бе-
дойкером (Kuenen, Bedeuker, 1982) на основе экспериментальных данных Гюде с соавторами (Gude et al., 1981), полученных в опытах с B.leptomitlformis B18LD, показали чрезвычайно высокий урожай клеток в расчете на потребленный сульфид, превышающий теоретически допустимые величины. На этом основании авторы высказывают сомнение относительно наличия литогетеротрофного роста указанного штамма Beggiatoa в вышеприведенных опытах. Вместе с тем, в настоящее время остается неясным, какую роль выполняют восстановленные соединения серы при росте серобактерий на средах с органическим субстратом.
1.2.5. Метаболизм неорганических соединений серы
Использование сероводорода и тиосульфата. Продукты окисления. Как указывалось выше, наблюдения С.Н.Виноградекого над окислением сульфида в микрокультуре Beggiatoa послужили основой его концепции хемосинтеза у микроорганизмов. Окисление, по его наблюдениям, сопровождалось накоплением гранул серы внутри клетки. При исчерпании H2s из раствора капли серы исчезали, предположительно, в результате их окисления до серной кислоты. Дальнейшие физиологические изучения чистых культур Beggiatoa, выделенных ранее исследователями, были связаны с решением вопроса о связи процессов окисления H2s с ростом этих бактерий. В большинстве работ выделение чистых культур Beggiatoa было проведено с использованием H2s в качестве источника восстановленной серы (Scotten, stokes, 1962; Burton, Morita, 1964; Pringsheim, 1964, 1967; Kowallik, Pringsheim, 1966). Значительно меньше внимания в этих исследованиях уделено изучению продуктов окисления сульфида и влиянию других восстановленных соединений серы на рост нитчатых серобактерий. Лишь в работах последних лет показано, что помимо H9s, раз-
личные виды Beggiatoa способны откладывать серу внутри клеток не только при использовании HgS, но и тиосульфата (Gude et al., 1981; Nelson, Castenholz, 1981a). В случае использования сульфида анализ конечных продуктов биологического окисления и интерпретация полученных данных затруднительны из-за протекающих одновременно абиогенных окислительных реакций. Последние приводят к накоплению в числе продуктов окисления сульфида не только s, но и so?~, s2o?"\ причем последние два продукта под действием кислорода окисляются до сульфата (Chen, Morris, 1972а,б). Анализ продуктов окисления тиосульфата у B.leptomitiformis ОН-75-В показал накопление s и сульфатов, причем в соотношении образованных продуктов наблюдалась диспропорция, со смещением в сторону большего накопления сульфат-иона. Кроме того, при использовании тиосульфата отмечено накопление незначительных количеств политиона-тов, главным образом s^Og"". Из этих данных авторы сделали вывод о том, что нитчатые серобактерии способны к окислению некоторого количества восстановленных соединений серы до сульфата.
Восстановление S0. Что касается дальнейших превращений внутриклеточных отложений элементарной серы, то в настоящее время из-за ограниченности данных трудно установить, происходит ли ее дальнейшее окислениеЛСочетковой и Дубининой (1980, неопубликованные данные), Нельсон и Кастенхольц (Helson, Castenholz, 1981а) установлено, что отложенная в клетках сера способна при создании анаэробных условий в среде восстанавливаться до H2s . При добавлении в среду органических веществ (лактата) суспензия может накапливать до 40 мг/л H2s. Восстановление серы ингибируется ази-
—я
дом натрия в концентрации МО М, что указывает на его связь с
функционированием дыхательной цепи. Может ли происходить восстановление внутриклеточной серы в аэробных условиях не установлено.
Пока не ясна природа этих восстановительных реакций, и трудно сказать, выполняет ли s функцию акцептора электронов. Не исключено участие этих реакций в "поддерживающем метаболизме" по аналогии с обнаруженным процессом у пурпурных серобактерий (Van Gemergen, 1968).
Связь окисления восстановленных соединений серы с транспортом электронов в дыхательной цепи. Использование восстановленных соединений серы в качестве доноров электронов для получения энергии предполагает наличие связи процессов окисления с функционированием электронтранспортной цепи (ЭТЦ). Burton, Morita (1964) не обнаружили у B.leptomitiformis цитохромов и предположили наличие укороченной дыхательной цепи, оканчивающейся на уровне флавинов. Дальнейшими исследованиями было показано наличие в клетках различных штаммов B.leptomitiformis и В.alba у-бихинонов и нафто-ХИНОНОВ (Carr et al., 1967; Callis, Manheim, 1978), НАД-оксидо-редуктаз (Burton et al., 1966), а также цитохрома с (Кочеткова, 1980, неопубликованные данные; Cannon et al., 1979). Цитохром а не удалось обнаружить в клетках исследованных серобактерий. Скорость окисления сульфида до серы и сульфидзависимое потребление кислорода в культуре в.alba B18LD ингибировались цианидом, азидом, 8-гидроксихинолином, что предполагает, по мнению авторов, связь окисления H2S с дыхательной цепью (barkin, Strohl, 1983). Не исключено, однако, что их влияние на скорость окисления сульфидов могло быть косвенным, в частности связанным с уменьшением синтеза промежуточных продуктов восстановления кислорода (^Oq), участвующих в окислении h2s. Прямые доказательства, которые бы демонстрировали связь процессов окисления соединений серы у Beg-giatoa с синтезом АТФ при окислительном фосфорилировании, в настоящее время не получены.
Стимулирующее воздействие неорганических восстановленных соединений серы на рост бесцветных серобактерий может быть обусловлено не только их использованием в качестве доноров электронов, но и иными причинами.
Роль перекиси водорода в окислении сероводорода. Burton, Morita (1964) предложили механизм окисления сульфида до серы у B.leptomitiformis, связанный с действием перекиси водорода, образуемой при окислении органических веществ в клетке. Их гипотеза основана на следующих наблюдениях:
а) внутриклеточная S0 появлялась через короткое время после
погружения клеток в раствор с сульфидом. Такое короткое время не
достаточно для ферментативного окисления сероводорода;
б) введение каталазы в среду резко, в 20 раз, увеличивало
урожай клеток Beggiatoa, не обладавших собственной каталазной
активностью. Таким образом, стимулирующее влияние H2s может быть
связано с удалением токсических продуктов обмена. В настоящее
время установлено, что все исследованные штаммы Beggiatoa не об
ладают каталазой (Strohl, Larkin, 1978а,б; Ueleon, Catencholz,
1981a).
Хотя точка зрения Буртона и Морита о перекисном характере окисления HgS получила поддержку в ряде исследований (Morita et al., 1981; Nelson, Castencholz, 1981a), ВОЗМОЖНОСТЬ образования H02 в клетках серобактерий до сих пор не исследована.
Из вышеприведенных материалов следует, что вопрос о функциональной роли, биохимическом механизме окисления неорганических соединений серы и дальнейшей судьбе накопленной в клетках элементарной серы в настоящее время недостаточно ясен.
