Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 7
1.1. Вид и род - основные категории классификации прокариот 7
1.2. Таксономические характеристики и методы их определения 8
1.2.1. Генотипические и филогенетические характеристики 8
1.2.2. Культурально-морфологические и физиолого-биохимические характеристики 14
1.2.3. Хемотаксономические характеристики 14
1.2.4. Некоторые методы определения хемотаксономических признаков 32
1.2.5. Таксономическое разрешение методов 37
1.3. Система классификации класса Actinobacteria 38
1.4. Характеристика семейства Nocardioidaceae 43
1.5. Характеристика рода Kribbella 47
2 Материалы и методы исследования 52
2.1. Объекты исследования 52
2.2. Определение генотипических признаков и филогенетического положения 53
2.3. Определение культурально-морфологических признаков 55
2.4. Определение физиолого-биохимических признаков 55
2.5. Определение хемотаксономических признаков 57
3 Результаты и их обсуждение 61
3.1. Формирование рабочей коллекции штаммов 61
3.2. Генотипические характеристики и филогенетическое положение штаммов 62
3.3. Культурально-морфологические характеристики 69
3.4. Физиолого-биохимические характеристики 70
3.5. Традиционные хемотаксономические характеристики 72
3.6. Состав гликополимеров клеточной стенки 80
3.7. Анализ МАЛДИ масс-спектров 87
3.8. Определение видового состава изученных штаммов 90
3.9. Описание предлагаемых видов рода Kribbella 98
3.10. Дополнения к описанию рода Kribbella 106
3.11. Таксономическая ревизия семейства Nocardioidaceae 106
Заключение 111
Выводы 112
Благодарности 113
Список литературы 114
Приложения 131
1. Нуклеотидные последовательности фрагментов генов 16S рРНК изученных штаммов 131
2. МАЛДИ масс-спектры на матрице НССА изученных штаммов 138
- Хемотаксономические характеристики
- Характеристика рода Kribbella
- Традиционные хемотаксономические характеристики
- Таксономическая ревизия семейства Nocardioidaceae
Введение к работе
Актуальность проблемы. Представители порядка Actinomycetales (Stackebrandt et al. 1997) выделяются среди других прокариот высоким содержанием ГЦ-пар в ДНК (более 50%), сложной организацией и большими размерами генома (до 12 млн. п.н.), разнообразием морфологии клеток и жизненных циклов, химического состава клеточной оболочки (Goodfellow et al., 1984; Gao & Gupta, 2012). Актиномицеты превосходят другие группы микроорганизмов по способности синтезировать биологические активные соединения (Anderson & Wellington, 2001). Вместе с тем, значительная часть этих уникальных бактерий с высоким биотехнологическим потенциалом остается неизученной или слабо исследованной в таксономическом аспекте.
К одной из таких групп относится род Kribbella Park et al., 1999 emend. Sohn et al. 2003, который в настоящее время включает 17 видов (). Согласно описанию, представители рода образуют фрагментирующийся вегетативный и воздушный мицелий, имеют тип I клеточной стенки (LL-диаминопимелиновая кислота, отсутствие дифференцирующих сахаров), фосфолипиды типа PIII (фосфати- дилхолин в качестве диагностического компонента) и доминирующй менахинон МК-9(Н4). Особенностью рода Kribbella является высокое сходство видов по нук- леотидным последовательностям гена 16S рРНК (97,1-99,7/100%) (Kirbi et al., 2010; Cui et al., 2010; Xu et al., 2012). Этот факт и проблема разграничения близких ви- дов/геномовидов криббелл по традиционным фенотипическим признакам (общая для бактериальной систематики) являются одной из причин того, что система классификации организмов этого рода остается разработанной крайне слабо и не отражает их реального природного разнообразия.
Ключевую роль в развитии систематики актиномицетов в «домолекулярный» период сыграло изучение хемотаксономических признаков (структура пептидогли- кана, состав сахаров клеточной стенки, тип менахинонов, фосфолипидов, жирных кислот) (Goodfellow, 1989). Отличия по этим признакам, наряду с обособленным филогенетическим положением организмов, являются определяющим фактором при обосновании выделения нового рода актиномицетов и в настоящее время (Stacke- brandt, 2006). Результаты изучения тейхоевых кислот клеточных стенок актиноми- цетов показали огромное разнообразие этих биополимеров и возможность использования их структур и структурных компонентов для дифференциации видов и групп видов внутри рода (Naumova et al., 2001; Потехина, 2005). Структуры других типов анионных полимеров установлены у представителей отдельных групп и не исследованы в таксономическом аспекте.
Белки и пептиды клетки, регистрируемые методом масс-спектрометрии с мат- рично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (МАЛДИ МС) - другая группа биомолекул, которая в последние годы успешно используется при идентификации и классификации бактерий, преимущественно патогенных (Welker & Moore, 2011). Имеющиеся в литературе данные о МАЛДИ масс-спектрах актиномицетов весьма фрагментарны.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось таксономическое изучение актиномицетов рода Kribbella.
В задачи исследования входило: 1. Формирование рабочей коллекции штаммов рода Kribbella.
-
Анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов генов 16S рРНК и gyrB и определение филогенетического положения организмов.
-
Изучение культурально-морфологических, физиолого-биохимических и хемо- таксономических признаков штаммов рабочей коллекции.
-
Определение состава гликополимеров клеточных стенок криббелл.
-
Анализ МАЛДИ масс-спектров представителй рода Kribbella и выявление таксон-специфичных компонентов спектров.
-
Определение видового состава изученных штаммов на основе принципов полифазной такономии и характеристика новых видов рода Kribbella.
-
Оценка положения рода Kribbella в системе высших таксонов бактерий.
Научная новизна. Методами фазово-контрастной и электронной микроскопии
обнаружены ранее неизвестные для рода Kribbella репродуктивные формы (споран- гиеподобные структуры, состоящие из полиморфных клеток). В составе сахаров клеточных стенок криббелл обнаружены мадуроза и рамноза, а также 2,3-ди-О- метил-а-галактоза, найденная у грамположительных бактерий впервые. Впервые у организмов рода Kribbella определён состав гликополимеров клеточной стенки. Обнаружены уникальные тейхулозоновые кислоты (с псевдаминовой кислотой в основной цепи), относящиеся к новому классу биогликанов, и новые структуры тейху- роновых кислот. Выявлены специфичные для криббелл фосфолипиды и компоненты МАЛДИ масс-спектров. Выявлено и охарактеризовано 10 новых видов и предложено дополненное описание рода Kribbella. Предложены новые семейства "Kribbella- ceae" и "Actinopolymorphaceae" в составе порядка "Propionibacteriales", а также изменение границ семейства Nocardioidaceae. Для новых и ревизованного семейств определены маркерные (сигнатурные) нуклеотиды гена 16S рРНК; в описания семейств включены фенотипические характеристики.
Практическая значимость. Создана коллекция охарактеризованных штаммов рода Kribbella, выделенных из почв разных регионов России, которые доступны широкому кругу специалистов для дальнейших исследований. Таксономические предложения и полученные данные о нуклеотидных последовательностях генов 16S рРНК и gyrB, компонентах клеточных стенок, МАЛДИ масс-спектров и других фе- нотипических признаках представителей рода Kribbella способствуют усовершенствованию системы классификации бактерий, развитию экспресс-методов идентификации криббелл на уровне вида и могут быть полезны при решении ряда практических задач эко- и биотехнологии, а также вопросов, касающихся защиты интеллектуальной собственности на штаммы. Полученные результаты могут быть использованы для аннотации геномов, данных метагеномики и метапротеомики, при исследованиях в области биохимии и химии природных полимеров.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Всероссийском симпозиуме с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов» (Москва, 2009); Молодежной школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2009 и 2010); Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2010); Всероссийском симпозиуме с международным участием «Автотрофные микроорганизмы» (Москва, 2010); Всероссийской школе-конференции «Химия и биохимия углеводов» (Саратов, 2011).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, приложений. Работа изложена на 157 страницах машинописного текста, содержит 34 таблицы и 24 рисунка. Список цитируемой литературы содержит 190 ссылок.
Хемотаксономические характеристики
Хемотаксономические признаки характеризуют количественный и качественный состав химических компонентов бактериальной клетки. Биосинтез полимеров и низкомолекулярных соединений у бактерий детерминирован большим числом генов. Хемотаксономические признаки достаточно стабильны, коррелируют с филогенетическим положением организмов. Химический состав клеточной стенки характеризуют такие соединения, как пептидогликан, сахара, фосфоли-пиды, дыхательные хиноны, жирные кислоты, тейхоевые кислоты и др.
Тип клеточной стенки
Тип клеточной стенки характеризуют такие соединения как диаминокислоты, аминокислоты и сахара. Ле Шевалье с соавторами (Lechevalier et al, 1971) показали, что тип клеточной стенки - признак постоянный, не зависящий от условий выращивания клеток. У актиномицетов и близких им бактерий они выделили 9 типов клеточной стенки на основании присутствия дифференцирующих аминокислот и Сахаров. Позже эту схему уточнили и немного видоизменили (табл. 1).
Амино- и диаминокислоты содержат одновременно карбоксильные и аминогруппы. Среди наиболее часто в клеточной стенке обнаруживают мезо- и LL-диаминопимелиновую и диамино-масляную кислоты, глицин, лизин, орнитин и аспарагиновую кислоту.
Актиномицеты, содержащие мезо-диаминопимелиновую кислоту в составе пептидоглика-на, по профилю Сахаров могут быть разделены на 4 типа: тип А - виды характеризуются присутствием арабинозы и галактозы и отсутствием ксилозы; тип В - виды характеризуются присутствием мадурозы и отсутствием арабинозы и ксилозы; тип С - виды не имеют характеристических Сахаров; тип D - виды характеризуются присутствием арабинозы и ксилозы (Lechevalier et ah, 1971).
Помимо клеточной стенки, сахара могут происходить из цитоплазмы, капсул и экзополиса-харидов. Такие сахара традиционно не рассматриваются в качестве диагностических.
Определение Сахаров в препаратах клеточных стенок, а не в целых клетках, позволяет выявлять дополнительные диагностические для таксона моносахариды, например, глюкозу, рибозу (Schleifer & Seidl, 1985). Сравнительный анализ опубликованных данных по "сахарам клеточных стенок" показал, что моносахариды, не относящиеся к группе "дифференцирующих Сахаров", часто входят в состав полимеров клеточных стенок. Так, галактоза является ценным химическим маркером группы видов стрептомицетов из кластера "5. violaceusniger", галактоза и манноза (происходящие из галактоманнана) характерны для Kineosporia aurantiaca, наличие галактозы (глюкозы) свойственно ряду видов Nocardiopsis и Saccharothrix и т.д. Изучение состава Сахаров препаратов клеточных стенок позволяет также выявить моносахариды, ранее считавшиеся несвойственными представителям того или иного рода (например, мадуроза для ряда видов стрептомицетов).
Обнаружение у штамма нового моносахарида, не найденного в составе клеточных стенок известных (близких) видов, с высокой степенью вероятности свидетельствует о том, что такой штамм относится к новому таксону. Специфичность биосинтеза "нового" сахара и полимера, включающего такой сахар, обусловлена специфичностью соответствующих локусов генома микроорганизма.
Изомеры диаминопимелиновой кислоты разделяют на целлюлозных пластинах системой растворителей: метанол-вода-бИ НС1-пиридин (80:26:4:10 об.). Пятна появляются после визуали зации 0,2%-ным раствором нингидрина в н-бутаноле и нагревания до 100С. Аминокислоты определяют с помощью автоматического аминокислотного анализатора, представляющего собой жидкостной или газовый хроматограф. В основном используют нормальнофазную ВЭЖХ на силика-гельных колонках и разные подвижные фазы, например, дихлорметан:метанол:15М раствор аммиака (92:8:1 или 80:15:3 об.). Определение Сахаров после кислотного гидролиза клеточных стенок проводят с помощью тонкослойной хроматографии, газовой хроматографии или ВЭЖХ (Ко-magata & Suzuki, 1987; Takeuchi & Yokota, 1989). Для ТСХ используют целлюлозные пластины и систему растворителей н-бутанол-вода-пиридин-толуол (80:26:4:10 об.). Пятна визуализируют анилинфталевой кислотой и нагреванием до 100С. Мадуроза и ксилоза могут быть разделены на бумаге системой н-бутанол-вода-пиридин-толуол (5:3:3:4 об.) (Suzuki etal, 1993).
Структура и состав пептидогликана
Пептидогликан (муреин) - полимер, находящийся снаружи цитоплазматической мембраны почти всех бактерий. Он сохранят целостность клетки под действием внешнего давления, служит опорой другим клеточным компонентам оболочки, таким как белки и тейхоевые кислоты, вовлечен в процессы клеточного роста и деления. Структура пептидогликана представляет собой линейные цепи гликана, состоящие из чередующихся N-ацетилглюкозоамина (GlcNAc) и N-ацетил-мурамовой кислоты (MurNAc), связанных /3-І-» 4 связями (рис. 3).
D-лактоильная группа связана с каждой MurNAc, замещённой пептидным остатком, состав которого наиболее часто L-Ala-y-D-Glu-me.ro-А2рт(или L-Lys)-D-Ala-D-Ala (Агрт - 2,6-диамино-пимелиновая кислота) в образующемся пептидогликане, последний аланин (D-Ala) последней макромолекулы. Гликановые цепи между карбоксильной группой D-Ala в положении 4 и аминогруппой диаминовой кислоты в положении 3 образуют короткий пептидный мостик. Определенная степень вариации существует в каждом в пептидном остатке, в гликановых цепях, в позиции или составе межпептидного мостика.
Немецкими авторами (Schleifer & Kandler, 1972) предложена следующая классификация пептидогликанов (табл. 2). Латинской буквой А или В обозначают тип перекрестной связи между диаминокислотой в положении 3 или 4 одной пептидной субъединицы и D-аланином в положении 4 другой пептидной субъединицы, арабской цифрой - тип пептидного мостика или его отсутствие, греческой буквой - аминокислоту, находящуюся в положении 3 основной цепи. Всего 18 типов пептидогликана: Ala, Alft AI7, A2a, АЗа, A3ft АЗ7, A4a, A4ft A4y, A4S, Bio; Blft BI7, BIS, B2a, B2ft B2y
Убихиноны синтезируются в основном грамотрицательными, а менахиноны - грамположи-тельными бактериями (Collins & Jones, 1981). Деметилменахиноны характерны для родов Streptococcus, Actinobacillus, Haemophilus, кальдериелла-хиноны - для рода Caldariella, метилменахино-ны - для рода Campylobacter, пластохионы - для рода Cyanobacteria, родохиноны - для рода Rho-dospirillium, убихиноны - для рода Legionella, хлоробиум-хиноны - для рода Chlorobium (Koma-gata & Suzuki, 1987; Suzuki et al, 1993). Таксономическое значение имеет структура хинона, длина и степень гидрированности изо-преноидной цепи. В таксономии используют данные о составе хинонов, их количестве и степени гидрированности. Степень гидрированности менахинонов для актиномицетов варьирует от 7 до 14. Среда и условия культивирования обычно не влияют на преобладающие менахиноны, но для сравнительных исследований рекомендовано использовать стандартные условия культивирования. Таксономически значимыми считают преобладающие компоненты, а минорные обычно приводят в качестве дополнительных характеристик. Большинство родов актиномицетов характеризуется одним или двумя доминирующими менахинонами (Goodfellow & Minnikin, 1985). Состав менахинонов имеет высокую таксономическую значимость для актиномицетов.
Состав изопреноидных хинонов определяют методами ТСХ, ВЭЖХ и масс-спектрометрии. Сочетание ВЭЖХ и масс-спектрометрии дает полную информацию о хинонах (Komagata & Suzuki, 1987). Убихиноны и менахиноны экстрагируют из лиофилизованной биомассы смесью хлороформ-метанол в соотношении 2:1. При анализе изократической ВЭЖХ используют следующие условия хроматографирования: обращённо-фазная колонка С18 (Zorbax-ODS и др.), элюент -метанол:изопропанол (4:1, об.) или метанол:изопропиловый эфир (3:1, об.), детекция спектрофо-тометрическая при 270 и 275 нм соответственно. При анализе обращённо-фазной ТСХ система растворителей для убихинонов: ацетон-ацетонитрил (80:20 об.), для менахинонов: ацетон-вода (99:1 об.); пятна визуализируют под УФ-светом при длине волны 254 нм.
Фосфолипиды
Фосфолипиды - сложные эфиры глицерина и органических кислот (триглицериды), в которых в состав одной из групп входит остаток фосфорной кислоты, связанный со спиртовыми компонентами, такими как би- или полифункциональные гидроксисоединениия (этаноламин, холин, серии, глицерин, миоинозит), гликолипиды - соединения липидов и углеводов (табл. 5).
В настоящее время известно огромное разнообразие полярных липидов у прокариот, во многих случаях их структуры не выяснены. Полярные липиды часто относят к индивидуальным соединениям, например, к фосфатидилглицерину. Однако правильнее их рассматривать как класс соединений, т.к. каждое сочетание жирных кислот с глицерином является новым соединением. Для любого штамма пятно, соответствующее, например, фосфатидилглицерину, может содержать несколько соединений с различными сочетаниями жирных кислот, что подтверждает масс-спектрометрический анализ (Tindall et al, 2010). Во многих публикациях используют такие термины, как "неидентифицированные фосфолипиды" или "гликолипиды", которые авторы не смогли определить во время анализа. Биосинтез полярных липидов не вполне понятен. Ни один обзор не охватывает все аспекты прокариот липидов. Все работы по профилям полярных липидов должны включать хроматограммы, на которых визуализированы все липиды после окрашивания реаген том, для того, чтобы показать расположение пятен друг относительно друга и сравнивать работы между собой. (Schumann et ai, 2009).
Характеристика рода Kribbella
Род Kribbella (Kri.bbe .lla. К. gen. от KRIBB - Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology) предложен Park в 1999 г. Описание рода ревизовано и дополнено Sohn в 2003 г. В настоящее время род содержит 17 видов: К. flavida и К. sandramycini Park et al. 1999, К. koreensis Lee et al. 2000, Sohn et al. 2003, K. solani и К. jejuensis Song et al. 2004, K. antibiotica Li et al. 2004, K. lupini Trujillo et al. 2006, K. yunnanensis и К. alba Li et al. 2006, K. karoonensis и К. swartbergensis Kirby et al. 2006, K. aluminosa Carlsohn et al. 2007, K. catacumbae и К. sancticallisti Urzi et al. 2008, K. hippodromi Everest & Meyers 2008, K. ginsengisoli Gsoli 001T Cui et al. 2010, K. amoyensis XMU 198TXue/a/.2012.
Усваивают широкий спектр источников углерода (углеводы, спирты) и азота, обладают
Это аэробные, неподвижные, аспорогенные грам-вариабельные или грам-положительные актиномицеты с хорошо развитым вегетативным мицелием и воздушными гифами (рис. 11). Белый или бледно-желтый воздушный мицелий состоит из прямых или изогнутых разветвленных гифов, фрагментирующихся в удлиненные или короткие палочковидные элементы. Белый, бледно-желтый, кремовый или оранжевый вегетативный мицелий обычно непигментирован и фраг-ментирован на неправильные палочковидные и кокковидные неподвижные элементы. На интенсивность фрагментации, размер и форму фрагментов влияет состав ростовой среды. Распространенные пигменты обычно не продуцируют кроме меланоидных пигментов, характеризующих некоторые виды. Каталазоположительные и некислотоустойчивые значительным спектром гидролитической активности (табл. 13).
Мезофилы, оптимум роста при 28-30 С, верхний и нижний пределы температуры роста для разных видов - 10 и 45С. Обычно негалофилы и нейтрофилы; некоторые виды растут при начальной величине рН = 10 и слабо при рН ниже 5. Например, К. hippodromi слабо растет при рН = 4,3 (Everest & Meyers, 2008).
Тест на оксидазную реакцию сильно разниться между видами. Предполагают, что представители этого рода способны расти в присутствии следов источников азота и углерода и являются хемоорганотрофами с потенциалом к миксотрофии и метаболической гибкости.
Состав и строение клеточной стенки видов рода Kribbella типичны для грам-положительных бактерий, но результаты теста окраски по Граму могут быть вариабельны (Park et al., 1999). Все виды характеризует присутствие LL-диаминопимелиновой кислоты (ЬЬ-Агрт) в качестве диаминокислоты в клеточной стенке пептидогликана типа АЗу (Schleifer & Kandler, 1972), аланин, глутаминовая кислота и глицин, ацетильный тип связи с мурамовой кислотой. В клеточной стенке вида К. lupini имеются специфические дипептиды (L-Ala-D-Glu, LL-A2pm-D-Ala и LL-A2pm-Gly). Мономер этого полимера содержит L-аланин в первом положении и ЬЬ-Агрт в третьем положении тетрапептидной цепи, а остаток глицина в межпептидном мостике (Trujillo et al, 2006). Сахара клеточных стенок или целых клеток варьируют для разных видов: сочетание манно-зы, глюкозы, галактозы, рибозы, ксилозы и одного или двух неидентифицированных Сахаров. Специфичного сахара, характерного для всех представителей рода не найдено, однако у большинства видов обнаружена манноза. Состав Сахаров может служить химическим маркером видов рода Kribbella (Trujillo et al, 2006).
Преобладающими дыхательными хинонами для всех изученных видов являются тетрагид-рированные менахиноны с девятью изопреновыми единицами МК-9(Н4), содержание которого у К. aluminosa достигает 93% (Carlsohn et al, 2007).
Диагностический компонент полярных липидов - фосфатидилхолин (PC); дополнительные основные полярные липиды — дифосфатидилглицерин (DPG), фосфатидилглицерин (PG) и фосфа-тидилинозит (PI) (табл. 14). Могут также присутствовать различные фосфо- и гликолипиды в минорных количествах.
Среди жирных кислот видов рода Kribbella преобладают насыщенные изо- и антеизо- разветвленные кислоты, антеизо-Сі5:о, изо-Сібои изо-Сі5:о,составляющие максимальную долю. Обычно встречаются мононенасыщенные изо-разветвлённые (в основном изо-Спі) и насыщенные 9-метилразветвлённые (в основном 9-метил-Сібо) жирные кислоты, содержание которых может превышать 10%; другие жирные кислоты, включая 2-гидрокси (в основном 2-гидрокси-изо-Сіб:о) и 10-метилразветвлённые кислоты (10-метил-Сі8:о и Ю-метил-Спю) для некоторых видов в минорных количествах. Качественный и количественный состав жирных кислот может значительно изменяться в зависимости от вида, условий роста, возраста культуры и используемого аналитического метода, как показано для К. flavida и К. sandramycini (Park et al, 1999; Sohn et al., 2003; Song et al., 2004; Trujillo et al, 2006). Миколаты отсутствуют.
К. flavida, К. antibiotica, К. jejuensis, К. karoonensis, К. koreensis, К sandramycini, К. solani и К. swartbergensis чувствительны к ампициллину, к цефотаксиму (кроме К. jejuensis). Эти же виды, К. catacumbae и К. sancticallisti чувствительны к тобрамицину (кроме К. solani), к стрептомицину (кроме К. sancticalisti), к карбенциллину (Kirby et al, 2006), а также к широкому спектру других антибиотиков. Несколько видов рода Kribbella продуцируют биологически активные вещества: К. sandramycini - противоопухолевый антибиотик сандрамицин (Matson & Bush, 1989; Matson et al, 1993), К. koreensisis - новый нейрофилин (комплекс факторов роста) (Lee et al., 2000). К. antibiotica обладает противогрибковой активностью (Li et al, 2004), а К. jejuensis ингибирует рост Strepomyces scabiei (Song et al, 2004). Описанные виды рода Kribbella имеют высокую степень сходства по нуклеотидным последовательностям гена 16S рРНК (97,0-99,7%) и образуют отдельный филогенетический кластер. Содержание ГЦ-пар в ДНК составляет 66,3-71,3 мол. % (Li et al, 2004). Полностью геном секве-нирован у Kribbella flavida DSM 17836т (Pukall et al, 2010). Последовательности 16S-23S ITS и генов рибонуклеазы Р РНК определены для К. flavida и К. sandramycini (73,6-80,8% сходства) (Yoon et al, 1998). Сходство по ДНК-ДНК гибридизации между видами рода Kribbella варьирует от 0% для пары К. koreensis-K. sandramycini (Sohn et al, 2003) и до 61,2% для пары К. sandramycini-K. yunnanensis (Li et al, 2006). Наибольшая степень сходства по нуклеотидным последовательностям генов 16S рРНК обнаружена между парами видов К. sandramycini-K. yunnanensis (99,3%) и К. solani-K. hyppodromii (99,6%). Типовые штаммы К. solani и К. hyppodromi имеют высокую степень сходства (98%) по нуклеотидным последовательностям фрагмента гена gyrB (Kirby et al, 2010), однако уровень сходства ДНК-ДНК гибридизации для них около 40%. Штаммы также различались по ряду фенотипических признаков (Everest & Meyers, 2008).
Представители рода Kribbella широко распространены в наземных экосистемах, преимущественно в почвах, некоторые виды ассоциированы с растениями. К. aluminosa выделен с кислых поверхностей горных пород, загрязненных тяжелыми металлами, К. solani - из клубней картофеля, пораженных паршой. Однако, до сих пор криббеллы не обнаружены в морских экосистемах. Считают, что споры или клетки видов рода Kribbella способны выжить или сохранять низкую метаболическую активность в экстремальных условиях в природе.
Традиционные хемотаксономические характеристики
Состав пептидогяикана
Все штаммы содержали LL-диаминопимелиновую кислоту и глицин в клеточной стенке (хемотип I). Пептидогликан имеет тип АЗу (Schleifer & Kandler, 1972; Schumann, 2011).
Состав Сахаров клеточной стенки
У всех изученных штаммов сахара определяли в препаратах клеточных стенок, а не в целых клетках, из-за большей информативности метода, позволяющего выявлять дополнительные диагностические для таксона моносахариды (например, глюкозу, рибозу, галактозу). Помимо клеточной стенки, такие сахара могут происходить из цитоплазмы, капсул и экзополисахаридов и традиционно не рассматривались в качестве диагностических.
В кислотных гидролизатах клеточных стенок всех изученных штаммов найдены в разных количествах манноза и галактоза (табл. 25). У одинадцати штаммов обнаружена глюкоза, у одного штамма (ВКМ Ас-2527) - рамноза, у шести штаммов (ВКМ Ас-2500, ВКМ Ас-2527, ВКМ Ас-2541, ВКМ Ас-2568, ВКМ Ас-2572 и ВКМ Ас-2575) - мадуроза (3-О-метилгалактоза, Gal/?30Me) и редкий сахар 2,3-ди-О-метилгалактоза (Galp2,30Me), ранее найденный лишь у фотосинтезирующих бактерий (Weckesser et al, 1979).
Состав менахинонов
У всех изученных штаммов обнаружен преобладающий менахинон МК-9(Н4), характерный для видов рода Kribbella. На хроматограммах всех изученных штаммов выявлены от 2 до 5 пиков, площадью более 10%, остальные пики были минорные и имели площадь менее 10% (рис. 17).
У семи штаммов (ВКМ Ас-2500, ВКМ Ас-2566, ВКМ Ас-2568, ВКМ Ас-2571, ВКМ Ас-2572 и ВКМ Ас-2574) в след за пиком растворителя выделены 1-2 пика, площадью 30,6-60,7% и 8,4-36,7% соответственно, первый из которых имел время удержания 2,83 мин и соответствовал менахинону МК9(Н4) (табл. 27). У других семи штаммов (ВКМ Ас-2527, ВКМ Ас-2538, ВКМ Ас-2540, ВКМ Ас-2541, ВКМ Ас-2570, ВКМ Ас-2573 и ВКМ Ас-2575) сразу после пика растворителя были три пика: первый пик - минорный площадью 3,2-11,0%, а следующие два пика имели площадь 11,6-26,7% и 35,5 15,0% соответственно. Ещё один значимый пик выходил через 33 с после третьего пика и имел площадь 12,0-25,6%. Масс-спектры для этих штаммов показали присутствие только одного менахинона MK9(bLt). Вещества, соответствующие на хроматограммах остальным пикам, не были идентифицированы. Возможно, эти соединения имеют липидную природу. Таким образом, у всех изученных штаммов доминирующим менахиноном является МК9(Н4), как и у описанных видов рода Kribbella. Состав полярных липидов
У всех изученных штаммов вьювлены фосфатидилхолин (PC), фосфатидилинозит (PI), фосфатидилглицерин (PG) и дифосфатидилглицерин (DPG), описанные ранее для известных видов рода Kribbella, а также полярный липид (L1) неустановленной природы (рис. 18).
Большинство штаммов содержали фосфолипид PL1 (кроме штаммов ВКМ Ас-2571, ВКМ Ас-2573 и ВКМ Ас-2575). У пяти штаммов обнаружен фосфолипид PL2. У штамма ВКМ Ас-2575 выявлен фосфолипид PL3. Гликолипид G1 отсутствовал только у штамма ВКМ Ас-2540. Гликолипид G2 был характерен для четырех штаммов, гликолипид G3 - для восьми, гликолипид G4 - для четырех. У восьми штаммов найден липид L2, у штамма ВКМ Ас-2572 еще и липид L3. Как отмечалось в обзоре литературы, пятно, соответствующее фосфатидилинозиту, может содержать несколько соединений с различными сочетаниями жирных кислот. Наличие фосфатидилхолина в спектре полярных липидов штаммов рода Kribbella позволяет отнести их к типу РШ (Lechevalier et al, 1977).
Состав жирных кислот
Жирные кислоты изученных штаммов представлены изо- и антеизо- насыщенными и ненасыщенными кислотами (табл. 29). Состав жирных кислот изученных штаммов был характерен для описанных видов рода Kribbella. В целом преобладали anteiso-C\so (19,1-40,4%) и wo-Сібо (11,0-35,2%) кислоты. У всех изученных штаммов также обнаружены жирные кислоты, которые отмечались у большинства [iso-Ciso (3,6-14,5%)] или отдельных видов рода Kribbella [anteiso-Cno (5,5-17,1%), iso-Cno (3,6-13,2%), йо-Ср і (4,0-12,2%), iso-Cuo (0,9-8,8%), C160 (0,7-3,0%) и Сів Ma, (0,2-3,0%)]. У штаммов ВКМ Ас-2500, ВКМ Ас-2538 и ВКМ Ас-2541 обнаружены 2-ОН-iso-C\i о и 11Ме-Сі81 кислоты, у штамма ВКМ Ас-2570 - 10Ме-Сп о кислота (менее 2%).
Зона 1 на фореграммах препаратов гликополимеров четырёх штаммов (ВКМ Ас-2566, ВКМ Ас-2570, ВКМ Ас-2571, ВКМ Ас-2573) (рис. 19), идущая ниже нейтральной линии, окрашивалась реактивом Ишервуда в голубой цвет. Её подвижность составила ОТогор = 0,74. Кислотный гидролиз образцов из этой зоны привёл к образованию глицерофосфата (GroP), глицеродифосфата (GroP2), неорганического фосфата и верхнего фосфорного эфира. В нейтральной области методом нисходящей хроматографии фореграмм обнаружена глюкоза. Данные результаты позволили предположить, что в зоне 1 находился 1,3-поли(глицерофосфат), частично замещённый глюкозой.
Для всех штаммов идентифицирована зона 2 (рис. 19) в нейтральной части фореграммы, окрашиваемая нитратом серебра в черный цвет. В этой зоне найдена манноза, что позволило предположить наличие маннана среди гликополимеров клеточных стенок всех штаммов. Гликозидные связи локализовали методом ЯМР-спектроскопии.
На фореграммах препаратов гликополимеров девяти штаммов (ВКМ Ас-2538, ВКМ Ас-2539, ВКМ Ас-2540, ВКМ Ас-2566, ВКМ Ас-2569, ВКМ Ас-2570, ВКМ Ас-2571, ВКМ Ас-2573 и ВКМ Ас-2574) обнаружена нингидрин-положительная зона 3 (рис. 19), соединения из которой расшифровали недеструктивными ЯМР-спектроскопическими методами.
Для шести штаммов (ВКМ Ас-2500, ВКМ Ас-2527, ВКМ Ас-2541, ВКМ Ас-2568, ВКМ Ас-2572 и ВКМ Ас-2575) в препаратах гликополимеров обнаружена зона 4, идущая несколько выше нейтральной линии и окрашиваемая реактивом Ишервуда в белый цвет, а нитратом серебра - в коричневый цвет. Кислотный гидролиз элюата этого соединения привёл к идентификации галактозы и сахара, имеющего Roro = 1,14. Дополнительно в препаратах гликополимеров этих шести штаммов найдена 3-О-метилгалактоза (мадуроза), а в клеточной стенке штамма ВКМ Ас-2527 - рамноза. Структура этих полимеров установлена методами ЯМР-спектроскопии.
Углеродные и протонные спектры полностью расшифрованы с использованием двумерных как гомоядерных, так и гетероядерных ЯМР-экспериментов: COSY, TOCSY, ROESY и HSQCOCSY, gHSQC, gHMBC.
Таксономическая ревизия семейства Nocardioidaceae
Анализ нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК организмов порядка "Propioni-bacteriales" (Ludwig et al, 2011), включающего род Kribbella, показал, что представители семейства Nocardioidaceae Nesterenko et al. 1990 emend. Rainey et al. 1997 emend. Zhi et al. 2009 образуют три кластера, которые находятся примерно на равном филогенетическом расстоянии друг от друга и от кластера семейства Propionibacteriaceae (рис. 26).
Каждый кластер имеет уникальный набор сигнатурных нуклеотидов гена 16S рРНК. Позиции сигнатурных нуклеотидов для кластера "Nocardioidaceae": 134:305 (G), 371:372 (G-A), 386 (С), 391:392 (Т-С), 672 (А), 678:714 (T-G), 736:777 (T-G); для кластера "Kribbellaceae": 134:305 (А-С), 371:372 (C-G), 386 (Т), 391:392 (C-G), 672 (G), 678:714 (С-А), 736:777 (С-Т); для кластера "Actinopolymorphaceae": 134:305 (G-C), 371:372 (С-А), 386 (С), 391:392 (T-G), 672 (G), 678:714 (Т-G), 736:777 (C-G). Представители кластеров, для которых секвенированы полные геномы {Nocardioides sp. JS614 и Kribbella flavida DSM 17836), отличаются также по их размеру (4,99 и 7,58 Mb) и числу генов, кодирующих белки (4645 и 7086) (Copeland et al., 2006;. Pukall et al, 2010).
Кроме того, каждый кластер имеет морфологические и хемотаксономические особенности. Общие свойства для организмов кластера "Nocardioidaceae": 1) относительно простая морфология и циклы развития (в основном от неправильных палочек до кокковидных клеток, иногда фрагмен-тирующиеся субстратные гифы, дающие начало скудным воздушных гифам); 2) наличие подвижных клеток; 3) значительная доля неразветвленных насыщенных и ненасыщенных жирных кислот (и их 10-метилразветвленных производных); 4) фосфолипиды преимущественно PI типа; 5) единственный или доминирующий дыхательный менахинон (содержащий тетрагидрированную боковую цепь с 8 или 9 изопреновыми единицами); 6) тейхоевые кислоты или другие фосфорсодержащие полимеры клеточной стенки (Nocardioides, Aeromicrobium).
Кластер "Kribbellaceae" состоит из организмов, характеризуемых свойствами: 1) более сложная морфология клеток отражает более сложное развитие в процессе репродуктивного цикла; 2) отсутствие подвижных клеток; 3) преобладание в профилях жирных кислот изо- и антеизо-разветвленных кислот с неразветвленными кислотами в миноре; 4) фосфолипиды РШ типа (содержат фосфотидилхолин); 5) единственный или доминирующий дыхательный менахинон, содержащий тетрагидрированную боковую цепь с 9 изопреновыми единицами); 6) манноза в качестве сахара в клеточной стенке у большинства штаммов; 7) гликополимеры клеточной стенки представлены нейтральным полисахаридом (разветвленный маннан) и анионными полимерами, несо-держащими фосфор (тейхулозоновые и тейхуроновые кислоты), редко тейхоевыми кислотами.
Кластер "Actinopolymorphaceae" состоит из организмов, характеризуемых свойствами: 1) более сложная морфология клеток отражает более сложное развитие в процессе репродуктивного цикла; 2) отсутствие подвижных клеток; 3) преобладание в профилях жирных кислот изо-разветвленных кислот (до 70%); 4) фосфолипиды преимущественно PI типа; 5) более сложный состав менахинонов (дыхательной системы в целом) с несколькими основными изопренологами с более длинными и более насыщенными боковыми цепями; 6) отсутствие маннозы и маннана в клеточной стенке.
В соответствии с изложенными данными и современными тенденциями развития системы классификации прокариот три кластера в составе семейства Nocardioidaceae Nesterenko et al. 1990 emend. Rainey et al. 1997 emend. Zhi et al. 2009 могут быть квалифицированы как отдельные семейства: кластер I - семейство Nocardioidaceae (роды Nocardioides, Aeromicrobium и Marmoricola), кластер II - семейство с временным названием "Kribbellaceae" (род Kribbelld) и кластер III - семейство с временным названием "Actinopolymorphaceae" (роды Actinopolymorpha, Flindersiella и Thermasporomyces). При такой таксономической структуре рассматриваемой группы более чётко выражены границы семейств в терминах эволюционных расстояний и нуклеотидных сигнатур, и каждое семейство приобретает индивидуальные фенотипические контуры и таксономические маркеры. Для новых семейств "Kribbellaceae" и "Actinopolymorphaceae" и ревизованного семейства Nocardioidaceae предложены описания, включающие наборы сигнатурных нуклеотидов генов 16S рРНК, а также фенотипические характеристики (табл. 36).
Описание семейства Kribbellaceae
Семейство Kribbellaceae (Kri.bbe.lla.ee ае. N.L. fern. п. Kribbella - типовой род семейства; окончание -асеае для обозначения семейства; N.L. fern. pi. п. Kribbellaceae - семейство рода Kribbella).
Семейство содержит типовой род Kribbella. Сигнатурные нуклеотиды по 16S рРНК включают следующие позиции: 134:305 (А-С), 371:372 (C-G), 386 (Т), 391:392 (C-G), 672 (G), 678:714 (С-А), 736:777 (С-Т). Представители семейства образуют фрагментирующийся мицелий (нокар-диоформная морфология). Содержат в клеточной стенке анионные (фосфатсодержащие и фосфат-несодержащие) и нейтральный (маннан) полисахариды, тип фосфолипидов РШ, доминирующий дыхательный менахинон МК-9(Н4).
Описание семейства Actinopolymorphaceae
Семейство Actinopolymorphaceae (Ac.ti.no.po.ly.mor.pha.ce ae. N.L. fern. n. Actinopolymorpha - типовой род семейства; окончание -асеае для обозначения семейства; N.L. fem. pi. п. Actinopolymorphaceae - семейство рода Actinopolymorpha).
Семейство содержит типовой род Actinopolymorpha, а также роды Flindersiella и Thermasporomyces. Сигнатурные нуклеотиды по 16S рРНК включают следующие позиции: 134:305 (G-C), 371:372 (С-А), 386 (С), 391:392 (T-G), 672 (G), 678:714 (T-G), 736:777 (C-G). Представители семейства образуют фрагментирующиеся и нефрагментирующиеся гифы. Клетки делятся путем фрагментации и дробления, почкования. Ряд организмов характеризуется полиморфными клетками. Тип фосфолипидов РШ, доминирующие дыхательные менахиноны МК-9(Н4,Нб), МК-Ю(Нб), МК-9Д0,11(Н4).
Описание ревизованного семейства Nocardioidaceae
Семейство Nocardioidaceae Nesterenko et al. 1990 emend. Rainey et al. 1997 emend. Zhi et al. 2009.
Семейство содержит типовой род Nocardioides; а также роды Aeromicrobium и Marmoricola. Сигнатурные нуклеотиды по 16S рРНК включают следующие позиции: 134:305 (G), 371:372 (G-А), 386 (С), 391:392 (Т-С), 672 (А), 678:714 (T-G), 736:777 (T-G). Представители семейства - неправильные палочки, кокки, иногда образуют фрагментирующиеся гифы. Содержат в клеточной стенке фосфатсодержащие полисахариды, тип фосфолипидов PI (РИ, РІП у единичных), доминирующий дыхательный менахинон МК-8(Н4) или МК-9(Н4).
