Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1. Систематика сусликов рода Spermophilus в классических зоологических исследованиях 10
Род Суслики -Spermophilus F. Сиvier, 1825 (=Citellus Oken, 1816) 13
Подрод Настоящие суслики - Citellus Oken, 1816 17
Подрод Пустынно-степные суслики - Cofobotis Brandt, 1843 23
1.2.Спорные вопросы систематики изучаемых видов сусликов рода
Spermophilus 29
1.2.1 .Крапчатый сусли к Spermophilus suslicvs Giildenstaedt, 1770 29
1.2.2. Малый Spermophiluspygmaetts Pallas, 1778 и горный S. musicus Menctrie, 1832 суслики 32
1.2.3. Желтый суслик Spermophilus/iilvus Lichtenstein, 1823 34
1.2.4. Большой суслик Spermophilus major Pallas, 1778 34
1.2.5. Краснощекий суслик Spermophilus erythrogenys Brandt, 1841 36
1.3. Генетические исследования сусликов рода Spermophilus 38
1.3.1. Использование цитогенетических методов в систематике и филогении сусликов 39
1.3.2. Аллозимные исследования сусликов 42
1.3.3. Иммуннологнческне исследования сусликов 43
1.3.4. Молекулярные исследования и филогения сусликов 44
ГЛАВА 2. Материал и методы 47
2.1. Сведения об использованном материале 47
2.2. Кариологический анализ 52
2.2.1. Приготовление хромосомных препаратов 52
2.2.2. Карнотипирование 53
2.2.3. Рутинное окрашивание хромосом 54
2.2.4. Дифференциальное окрашивание хромосом для выявления структурного гетерохроматина (С- окраска) 54
2.2.5. Дифференциальное окрашивание ядрышкообразующих районов хромосом (NOR-окраска) 55
2.3. Молекулярно-генетический анализ 55
2.3.1. Выделение ДНК 56
2.3.2. Электрофорез в агарозном геле нативной ДНК 56
2.3.3. Условия проведения RAPD-PCR реакции 57
2.3.4. RAPD-PCR-анализ 60
2.3.5. Описание генетического разнообразия 62
ГЛАВА 3. Результаты исследования 64
3.1. Цитогепетическая характеристика сусликов рода Spermophilus 64
3.1.1. Кариологическое исследование сусликов подрода Citellus 64
3.1.1.1. Различия хромосомных наборов двух близких видов сусликов Spermophilus pygmaeus и S. musicus 64
3.1.1.2. Цитогенетические различия двух хромосомных форм крапчатого
суслика Spermophilus suslicus 66
3.1.2. Кариологическое исследование сусликов подрода Colobotis. 70
3.1.2.1. Цитогенетические различия краснощекого суслика Spermophilus erythrogenys 70
3.1.2.2. Цитогенетическая характеристика большого суслика Spermophilus major 75
3.2. Генетическое разнообразие и филогенетические взаимоотношения сусликов рода Spermophilus по данным RAPD-PCR-анализа 76
3.2.1. Молекулярная дифференциация и филогения сусликов рода Spermophilus 76
3.2.2. Генетическое разнообразие и филогенетические связи сусликов
подрода Citellus 88
3.2.3. Генетическое разнообразие и филогенетические связи сусликов подрода Colobotis 96
ГЛАВА 4. Обсуждение 106
4.1. Генетическая дифференциация сусликов рода Spermophilus 106
4.1.1. Цитогепетическая и молекулярная дифференциация сусликов подрода Citellus 106
4.1.2. Цитогепетическая и молекулярная дифференциация сусликов подрода Colobotis 112
4.2. Молекулярная дивергенция и филогенетические связи в двух группах (подроды Citellus и Colobotis) палеарктических сусликов рода Spermophilus 118
4.3. Особенности формообразования у видов сусликов с различной пространственной структурой ареалов 121
4.4. Естественная гибридіпация алло- и парапатрических видов сусликов рода Spermophilus 123
4.5. Таксономическая интерпретания полученных результатов 125
Заключение 128
Выводы 130
Список литературы
- Систематика сусликов рода Spermophilus в классических зоологических исследованиях
- Сведения об использованном материале
- Цитогепетическая характеристика сусликов рода Spermophilus
- Генетическая дифференциация сусликов рода Spermophilus
Введение к работе
Актуальность проблемы. Широкое применение цитогенетических методов исследования позволило выявить большое разнообразие внутривидовой кариотипической изменчивости во многих группах. Только за последние несколько десятков лет у ряда видов млекопитающих, в том числе и у сусликов рода Spemophilus, обнаружены внутривидовые хромосомные формы. Эти формы эволюционно молоды, часто географически обособлены и, по определению одного из основоположников теории хромосомного видообразования Н.Н. Воронцова (1999), каждая из них может быть "кандидатом в новый вид". Однако их таксономический ранг зачастую невозможно установить традиционными зоологическими методами вследствие высокого морфологического сходства. Решить многие спорные таксономические вопросы позволяют новые методы молекулярной генетики, которые выявляют маркеры, успешно дифференцирующие близкие формы, и, кроме того, позволяют оценить генетическое родство таксонов на более совершенном уровне и получать информацию об их филогенезе и разнообразии. Использование комплексного подхода — молекулярно-генетического анализа в сочетании с методами кариосистематики, биохимической генетики и сравнительной морфологии -является приоритетным направлением в исследовании биоразнообразия, которое вносит существенный вклад в изучение эволюционных процессов и механизмов видообразования в природе.
Исследование различных механизмов видообразования принято проводить на целых группах близкородственных видов. Суслики голарктического рода Spermophilus Cuvier, 1825 служат удобной экспериментальной моделью для изучения комплекса систематических, эволюционных и генетических вопросов. Они отличаются высокой численностью, быстрой сменой поколений, достаточно хорошей морфологической изученностью. Для них характерны слабые морфологические различия близких видов и широкая изменчивость генетических признаков. Хромосомный полиморфизм, способность к гибридизации и существование гибридных зон у некоторых видов сусликов обеспечивают устойчивый интерес к этой группе наземных беличьих.
Палеарктические суслики рода Spermophihis распространены на огромных пространствах Евразии, смена ландшафтных и климатических условий на территории которой способствуют созданию уникальных ситуаций для внутривидовой генетической изменчивости этих грызунов. Изучение меж- и внутривидовой изменчивости сусликов с различной структурой их ареалов позволяет проследить процесс генетической дифференциации таксонов разного уровня на всех последовательных этапах видообразования. Уже первые кариологические (Воронцов, Ляпунова, 1969; 1970; Lyapunova and Vorontsov, 1970) и аллозимные (Nadler et al., 1977; 1982) работы, проведенные в 60-80 гг. прошлого века, решили некоторые спорные вопросы таксономии сусликов Палеарктики и показали, что классификация рода Spermophihis соответствует узкой трактовке объема вида. Однако, ряд вопросов, связанных с проблемами систематики (установление таксономического ранга некоторых внутривидовых форм, с недостаточно четкой морфологической дифференциацией) (Орлов и др., 1978, Korablev, 1994) и филогении данной группы, сохраняются до сих пор. Их решению препятствует слабая изученность генетических аспектов разнообразия сусликов на молекулярном уровне. Использование комплексного подхода (цитогенетические и молекулярные методы) в исследовании генетического разнообразия рода Spermophihis позволит расширить представления о степени дифференциации близких форм неясного таксономического ранга, уточнить филогенетические связи таксонов более высокого уровня и тем самым помочь в решении спорных вопросов систематики.
Цель и задачи исследования. Цель работы - изучить особенности генетического разнообразия и филогенетические взаимоотношения палеарктических сусликов рода Spermophihis и уточнить таксономический статус некоторых внутривидовых форм двух подродов (Citellus и Coloholis) на основании данных цитогенетического и молекулярного исследований. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1. Изучить распределение цитогенетических признаков (гетерохроматина и ядрышковых организаторов) в кариотипах сусликов двух подродов {Citelhis и Colobolis).
2. Изучить генетическое разнообразие сусликов с помощью молекулярных RAPD-PCR маркеров.
3. Выяснить характер изменчивости цитогенетических и молекулярных характеристик сусликов рода Spermophilus на разных таксономических уровнях.
4. Реконструировать фено- и филогенетические связи между географическими популяциями, видами и подродами сусликов по данным RAPD-PCR.
5. Использовать полученные цито генетические и молекулярные характеристики для решения спорных вопросов систематики сусликов.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Подтверждена обоснованность выделения в составе рода Spermophilus подродов Citelhis и Colobotis.
2. Уровень генетической дифференциации видов в подродах Ci(elhis и Colobolis одинаково высок.
3. Подтверждена видовая самостоятельность Spermophilus suslicus (Giildenstaedt, 1770) и S. odessamis Nordmann, 1842 {=meridiooccidentalis Migulin, 1927), рассматривавшихся до этого в качестве одного вида или подвидов. Подтверждена видовая самостоятельность S. erythrogenys Brandt, 1841, S. brevicauda Brandt, 1843 intermedins Brandt, 1844) и S. pallidicauda Satunin, 1903, рассматривавшихся до этого в качестве подвидов.
4. Установлена гибридизация между бледнохвостым S. pallidicauda и алашанским S. alaschanicus сусликами в двух популяциях Монголии.
Научная новизна. Впервые выполнено сравнительное исследование разных хромосомных форм сусликов двух подродов {Citelhis и Colobotis) со спорным таксономическим статусом комплексом цитогенетических и молекулярных методов. Исследование различных кариоморф двух видов сусликов (крапчатого S. suslicus и краснощекого S. erythrogenys) показало, что отличия между ними достигают уровня "хороших" видов рода Spermophilus.
Критический анализ дифференцированных форм на хромосомном и молекулярном уровнях выявил целесообразность повышения их таксономического статуса до уровня самостоятельных видов: Spermophilus suslicus (Gtildenstaedt, 1770) и S. odessamis Nordmann, 1842 (=meridiooccidentalis Migulin, 1927), S. erythrogenys Brandt, 1841, S. brevicauda Brandt, 1843 {intermedins Brandt, 1844) и S. pallidicauda Satunin, 1903.
Впервые проведен сравнительный анализ генетического полиморфизма наземных беличьих методом RAPD-PCR позволил выяснить особенности генетического разнообразия, реконструировать филогенетические связи и уточнить систематические положение исследуемых форм рода Spermophilus. Показано, что подроды, виды и географические популяции сусликов рода Spermophilus генетически высоко дискретны.
Теоретическая и практическая значимость. Работа представляет исследование генетических и эволюционных аспектов изменчивости сусликов рода Spermophihis. Уточнение систематического положения ряда форм сусликов Палеарктики является вкладом в разработку систематики и филогении группы. Выявленные молекулярные и цитогенетические маркеры могут быть использованы для более широкого изучения популяций с целью дискриминации морфологически близких форм, обнаружения генетических гибридов, внешне неотличимых от родственных видов и поиска свидетельств межвидовой гибридизации. В связи с тем, что суслики являются основными компонентами степных (аридных) биогеоценозов, переносчиками ряда инфекционных заболеваний человека и животных, вредителями сельского хозяйства, установление их таксономического статуса также важно для решения практических задач эпидемиологии и паразитологии. Результаты изучения генетического разнообразия могут служить основой для разработки природоохранных мероприятий и стратегии сохранения редких видов сусликов.
Полученные цитогенетические и молекулярные данные по генетическому разнообразию двух подродов (Citellus и Colohotis) палеарктических сусликов свидетельствуют в пользу принятия узкой концепции объема вида.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на IV Международном маммалогическом конгрессе в Брно в 2003, на международных конференциях MAPEEG (2001) во Владивостоке, "Систематика, филогения и палеонтология мелких млекопитающих" (2003) в Санкт-Петербурге, "Фауна Казахстана и сопредельных стран" (2003) в Алма-Аты, международных симпозиумах "Систематика и филогения грызунов и зайцеобразных" (2000) и Териофауна России и сопредельных территорий" (2003) в Москве, на VI всероссийском съезде Териологического общества (1999) в Москве, региональных конференциях и конкурсах молодых ученых БПИ ДВО РАН (1997, 1998, 1999, 2003).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертации состоит из введения, четырех глав, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 162 страницах, иллюстрирована 13 таблицами и 26 рисунками. Список литературы включает 202 наименования, из них 74 на иностранных языках.
Гранты РФФИ. Работа выполнена при частичной поддержке грантов РФФИ 04-04-48001, 03-04-39016-ГФЕН.
Благодарности. Автор выражает глубокую признательность своим научным руководителям - к.б.н. В.П. Кораблеву и д.б.н. Г.Н. Челоминой - за обучение и помощь в освоении лабораторных методов, методические указания и всестороннюю поддержку. Благодарю О.В. Брандлера, М.Р., Ахвердяна, Е.А. Ляпунову (ИБР АН РФ), Е.И. Жолнеровскую (ИСиЭЖ СО РАН), О.А. Ермакова и СВ. Титова (Пензенский педагогически университет) за предоставление исследовательского материала. Искренне благодарю д.б.н. М.П. Тиунова, д.б.н. А.С. Лелея, д.б.н. А.П. Крюкова, к. б. н. К.В. Коробицыну, а также всех сотрудников лаборатории эволюционной зоологии и генетики БПИ ДВО РАН за критические замечания, ценные советы и рекомендации по оформлению работы.
Систематика сусликов рода Spermophilus в классических зоологических исследованиях
К настоящему времени опубликовано множество работ по систематике, биологии и экологии сусликов рода Spermophilus F. Cuvier, 1825 (=Citeilus Oken, 1816,). Несмотря на хорошую морфологическую и географическую изученность сусликов, до сих пор существует ряд противоречий в систематике современных сусликов Евразии, которые напрямую зависят от взглядов разных систематиков на классификацию и структурігую подразделенность рода Spermophilus (=Ci(eIhts).
Название рода сусликов Citellus Oken, 1816 широко использовалось во всем мире, пока П. Герцгович (Hershkovitz, 1949) в 1949 г. не объявил, что оно невалидно и предложил другое название для обозначения данного рода -Spermophilus F. Cuvier, 1825, как самое первое доступное название. Это название было принято международной Комиссией по Зоологической номенклатуре (1956; Мнение 417) и употребляется в зарубежной систематической литературе (Corbet, 1978; "Mammal Species of the World", 1993; Nowak, 1999). Однако, в отечественных работах по систематике палеарктических сусликов до 1995 года (Огнев. 1947; Виноградов, 1933; Виноградов, Аргиропуло, 1941; Громов и др., 1963; 1965; Кузнецов, 1975; Громов, Ербаева, 1995) употребляется родовое название Citellus Oken, 1816. В последующих работах современные российские авторы также стали использовать название Spermophilus F. Cuvier, 1825 в качестве родового (Павлинов, Россолимо, 1987; 1998; Пантелеев и др., 1998; Пантелеев, 1999; Павлинов и др., 2002).
И. Брандт (Brandt, 1843, цит. по Громов и др., 1965) одним из первых систематизировал семейство беличьих Schiridae. Всех сусликов Палеарктики и два вида Неарктики (Citellus parry і й С. richardsoni) он объединил в один подрод Colobotis. А. Ховелл (Howell, 1933) и А. Бриант (Bryant, 1945) не признали подрод Vrocitellus, а подрод Colohotis сочли синонимом подрода Citellus. Дж. Эллерман и Т. Моррисон-Скотт (ЕПептшп, 1940; ЕПеппап and Morrison-Scott, 1951) делили сусликов Старого света на пять групп (fulvus, pygmaeus, citellus, suslicus, eversmanni), не придавая им таксономического ранга выше видового и не выделяя подродов. Большинство систематиков признают три подрода палеарктических сусликов Colobotis, Citellus и Urocitellus (Огнев, 1947; Васильева, 1964; Громов и др., 1965; Соколов, 1977; Громов, Ербаева, 1995; Nowak, 1999). Однако в систематико-географическом справочнике "Млекопитающие Евразии" (под ред. О.Л. Россолимо, 1995) выделяется только два подрода палеарктических сусликов Urocitellus и Cite!!us. В последнем, суслики объединяются в три надвидовые группы: fulvus, pygmaeus и citellus (Павлинов, Россолимо, 1987; 1998). Таким образом, и объем входящих в состав рода Spermophillus подродов существенно варьирует.
Долгое время вопрос о числе и объеме видов подрода Colobotis оставался открытым. Дж. Эллерман и Т. Моррисон-Скотт (Ellerman and Morrison-Scott, 1951) рассматривали краснощекого суслика S. erythrogenys как подвид большого. Этого же мнения придерживались И.А. Бобринский и др. (1965), Б.А. Кузнецов (1975) и Г.Б. Корбет (Corbet, 1978). Однако СИ. Огнев (1947) счел большого и краснощекого сусликов самостоятельными видами.
Часто один и тот же вид, в зависимости от взглядов систематиков, включается в состав разных подродов. Так, СИ. Оболенский (1927) включает в подрод Colobotis пять видов сусликов: Sperniophilus fuhus, S. major, S. erythrogenys, S. pygmaeus и S. reiictus. СИ. Огнев (1947), кроме этих видов, в состав подрода Colobotis включает короткохвостого суслика S. brevicauda. Однако, М.В. Васильева (1964) и И.М. Громов (Громов и др., 1965) сусликов S. pygmaeus и S. reiictus относят к подроду Citellus, включая в подрод Colobotis всего три вида сусликов: Sperniophilus fulvus, S. major, S. erythrogenys.
Как упоминалось выше, мнения разных систематиков о составе подрода Citellus существенно расходятся. Выделяется от четырех (Огнев, 1947) до двенадцати ("Каталог млекопитающих...", 1995; Павлинов, Россолимо, 1987; 1998) видов этого подрода. Ранее большинство авторов считали, что в Евразии распространен один вид, относящийся к подроду Urocitellus - длиннохвостый суслик S. imdulatus (Виноградов, 1933; Бобринский и др., 1944; Огнев, 1947; Виноградов, Громов, 1952; Бобринский и др., 1965; Ellerman and Morrison-Scott, 1951; Васильева, 1964). Б.С. Виноградов и А.И. Аргиропуло (1945) отмечали, что в Азии и на Аляске обитает арктический суслик (S. parry/), но, возможно, западнее р. Лены живет и другой вид- S. eversmarmi (=S. undulatus). Позже (Виноградов, Громов, 1952) стали считать длиннохвостого суслика S. undulaltis отдельным видом и предположили возможность видовой самостоятельности сусликов северо-востока Азии (S. parryi). В дальнейших работах СИ. Громов с соавторами (Громов и др., 1963; 1965) четко разграничивают этих сусликов, признавая их родственными самостоятельными видами. После получения онтогенетических данных (Воронцов, Ляпунова, 1969), это мнение стало общепринятым ("Каталог млекопитающих...", 1981; Громов, Ербаева, 1995; "Млекопитающие Евразии"; 1995; Павлинов, Россолимо, 1987; 1998; Пантелеев ид р\, 1990; Пантелеев, 1998).
Существенны отличия в трактовке объема рода Spermophiilus. Часто одни и те же авторы в разных систематических сводках указывают разное число видов сусликов, обитающих в Евразии. В целом число выделяемых разными систематиками видов варьирует от пяти - шести (Ellerman and Morrison-Scott, 1951; Бобринский и др., 1965) до девяти - десяти (Виноградов, 1933; Виноградов, Аргиропуло, 1941; Бобринский и др., 1944; Виноградов, Громов, 1952). В последние годы чаще выделяют до двенадцати видов сусликов Палеарктики, вслед за СИ. Огневым (Огнев, 1947Васильева, 1964; Громов и др., 1965; Соколов, 1977; Громов, Ербаева, 1995). В данной работе по изучению некоторых видов сусликов рода Spermophiius мы следовали классификации И.М. Громова (Громов и др., 1965; Громов, Ербаева, 1995). За основу очерков по краткой морфологической характеристике, распространению, палеонтологической истории и географической изменчивости видов также взяли работы И.М. Громова (Громов и др., 1965; Громов, Ербаева, 1995).
Сведения об использованном материале
На основе исследования молекулярной структуры генома восьми палеарктических сусликов (Ginatulina et. al., 1982) был определен размер генома у представителей рода Spermophilus, который составил 2,72-3,87 пкг (минимальный у S. dauricus, максимальный - у S. pygmaeus и S. fulvus). Вариации в размерах генома включали как повторяющиеся, так и уникальные последовательности в приблизительно равной степени у всех изученных видов, за исключением S. dauricus. От 35 до 53% геномов были представлены повторяющимися последовательностями, которые образовывали три кинетические фракции: очень быстро реассоциирующую (самая изменчивая, размах вариации от 5,7 до 23,3%), быстро реассоциирующую (менее изменчивая, размах вариации от 12 до 14%) и промежуточную (вариация от 10,1 до 20%). Размах изменчивости фракции уникальных последовательностей колебался от 4, 6 у S. dauricus до 66,7% у S. relictus.
По результатам этого исследования было установлено большое сходство геномов у видов подрода Coloboiis (S. major и S. fulvus). В то же время обнаружено, что виды подрода Urocitellus (S. undulatus и S. parryi) сходны между собой в меньшей степени, а виды подрода CiteUus (S. relictus, S. dauricus, S. citellus и if?, pygmaeus) различаются между собой более всего. Кроме того, показана близость молекулярной структуры геномов S. pygmaeas с S. major и S. fulvus, что подтвердило сделанное И.С. Громовым (Громов и др., 1965) заключение о связующей роли малого суслика S. pygmaeus между двумя подродами Citellus и Coloboiis. Результаты сравнительного исследования структуры генома палеарктических сусликов рода Spermophilus в целом соответствовали карирлогическим данным (Воронцов, Ляпунова, 1970; 1972) и систематике рода (Огнев, 1947; Громов и др., 1963; 1965; Васильева, 1964; Соколов, 1977).
Сравнительное исследование последовательностей гена цитохрома b митохондриальной ДНК (Ляпунова, 2002; Harrison et al., 2003а; b) позволило оценить степень родства большинства голарктических сусликов. Построенное по этим данным филогенетическое древо распределило сусликов в четыре группы: 1) палеарктические виды рода Spermophilus,, 2) неарктические виды рода Spermophilus, роды Ictiodomys, Cynomys, Xerospermophihis, PaiiocUellus, 3) род Otospermophilus и 4) род Callospermophilus. Распределение палеарктических сусликов в кластерах согласуется со схемой, построенной на основании хромосомных наборов (Воронцов, Ляпунова, 1970; 1972; Vorontsov and Lyapunova, 1970). Группу малых сусликов образуют два вида S. pygmaeus и S. musicus; 36-хромосомные суслики распадаются на две группы (подроды Citellus и Colobotis), что соответствует представлениям зоологов; другие палеарктические суслики (S. dauricus, S. citellus, S, suslicus и S. xanthoprynmus) образуют отдельные ветви. Даурский суслик S. dauricus в этих реконструкциях значительно дивергировал от остальных евразийских видов.
Данное исследование подтвердило значительную разобщенность евразийских длиннохвостых сусликов между собой (S. andulatus и S. parryi) и их безусловное генетическое родство с американскими сусликами. Было также обнаружено, что подвиды краснощекого суслика S. erythrogenys (номинативный и brevicauda) в большей степени разобщены друг с другом, чем с другими видами подрода Colobotis, а суслики рода Spermophihts более близки к суркам Marmofa, чем к американским сусликам родов Otospermophilus и Callospermophilus.
Секвенирование С-региона митохондриальной ДНК четырех видов сусликов, обитающих в зоне симпатрии в Поволжье (S. suslicus, S. pygmaeus, S. major и S. fulvus), выявило у трех экземпляров S. major и фенотипического гибрида & major / S. suslicus "чужеродные" митотипы (Ермаков и др., 2002). Еще у двух экземпляров S. major найден митотип, характерный для S. pygmaeus, и у одного S. major и гибрида S. major/S. suslicus - митотип S.fulvus: Дальнейшие исследования (рестрикционный и RAPD-PCR анализы) диапюсцировали фенотипические гибриды S. major / S. fulvus и S. major / S. pygmaeus. Данные по исследованию различий в гене опухолевого супрессора р53, полученные этой же группой исследователей, так же как и результаты RAPD-PCR-анализа, показали, что в настоящее время гибридизация пар S. major / S. fulvus и S. major / S. pygmaeus может быть определена как спорадическая. При этом возможно появление более или менее плодовитых гибридов, часть из которых способна к возвратным скрещиваниям с одним или с обоими родительскими видами. На основе экспериментальных данных и полевых наблюдений было установлено, что процент гибридных особей, выявляемых с помощью генетических методов, существенно выше (15-30%), чем обнаруживается в природе (1%). При этом авторы подчеркивают, что скопления гибридов в зонах симпатрии S. major, S. fulvus, S. suslicus и S. pygmaeus в Поволжье не наблюдается, и делают вывод об отсутствии размывания границ ареалов данных видов (Ермаков и др., 2002; 2003).
Цитогепетическая характеристика сусликов рода Spermophilus
В кариотипе малого суслика S. pygmaeus содержится 36 хромосом, все хромосомы двуплечие (NF=72) (Рис. За). Присутствуют десять пар мета-, четыре пары субмета- и три пары субтелоцентрических аутосом. Половые хромосомы: X-хромосома - крупный субметацентрик, Y-хромосома - мелкий метацентрик. Самая мелкая пара аутосом (17-я) S. pygmaeus является субметацентрическои. На всех хромосомах, включая половые, хорошо выражен прицентромерный гетерохроматин. Блоки гетерохроматина примерно равных размеров, за исключением второй, третьей и четырнадцатой пар аутосом, у которых гетерохроматиновые блоки заметно меньше (Рис. 4а). Районы ядрышкового организатора локализуются на трех парах аутосом (3-, 7- и 11-й), в теломерных областях (Рис. 5а). Среднее число ядрышковых организаторов равно 4,38 на клетку. При просмотре метафазных пластинок нами отмечено, что хромосомы, несущие ядрышковые организаторы, часто образуют ассоциативный комплекс 66 объединение хромосом посредством слияния ядрышковых организаторов. Для этого вида мы регистрировали ассоциации из двух и трех хромосом.
В кариотипе горного суслика S. musicus также 36 хромосом (NF=72) всех морфологических типов (Рис. 36). Десять пар являются метацентрическими, три -субметацентрическими и четыре - субтелоцентрическими. Самая мелкая пара аутосом iS . musicus является субтелоцентрической (17-я). Х-хромосома — крупный метацентрик, а Y-хромосома — мелкий акроцентрик. Гетерохроматин выявляется в прицентромерных областях всех хромосом, а также на тсломерах трех парах аутосом — 4-, 5- и 8-й (Рис. 46). Относительные размеры блоков прицентромерного гетерохроматина не одинаковы. На третьей и десятой парах аутосом, а также на половых Х-хромосомах гетерохроматиновые блоки мельче по сравнению с другими хромосомами,
У четырех животных (два из Баксанского ущелья и два из Ирикского ущелья) ядрышковый организатор выявляется на двух парах аутосом (4- и 7-й), а у десяти (два из Баксанского ущелья и восемь из Ирикского ущелья) — на трех парах (4-, 7-и 11-й, рис. 56). Среднее число ядрышковых организаторов на клетку у ирикской популяции сусликов составляет 3,95 и 5,18 соответственно двум обнаруженным вариациям. У баксанской популяции средние значения этого признака по данным вариантам равны 3,85 и 5,6, Для хромосом с ядрышковыми организаторами отмечено образование ассоциаций из двух, трех и (очень редко) из четырех хромосом.
Как видно из данного описания, кариотипы малого и горного сусликов при одинаковом количестве хромосом имеют небольшие отличия по морфологии самой мелкой пары аутосом (17-ой): у S. pygmaem она является субмета центрической, а у S. musicus - субтелоцентрической. Различия между этими видами по количеству и локализации гетерохроматина более значительны.
Распределение структурного гетерохроматина в кариотипах сусликов подрода Citellus: a) Spermophilus pygmaeus (2п=36); б) 5. mrnicus (2n=36); в) 5. //Сщг (2n=36); г) 5 . ««//сиг (2n=34) (пунктиром отмечена пара с одним почти полностью гетерохроматиновым плечом; точками - блоки гетерохроматина на теломерных участках хромосом) обнаружены животные с 2п=34 и с 2п-36. Все хромосомы двуплечие NF=68 и NF=72 (Рис. Зв-г), плавно убывающие в размерах.
Суслики из Днепропетровской и Кировоградской областей в кариотипах содержат 36 хромосом (Рис. Зв). Восемь пар аутосом являются мета центрическими, шесть пар - субметацентрическими и две пары -субтелоцентрическими. Половые хромосомы представлены субметацентрической Х-хромосомой и мелкой акроцентрической Y-хромосомой. Гетерохроматин локализуется в прицентромерных участках всех хромосом. Блоки гетсрохроматина почти на всех аутосомах примерно равных размеров. На одной мелкой паре метацентрических хромосом (16-я) гетерохроматиновый блок занимает почти все нижнее плечо (Рис. 4в). Ядрышковый организатор локализован на теломерах трех пар аутосом (Рис. 5в). Количество ядрышкообразующих районов варьирует от 4 до 6, среднее число на клетку составляет 4,7.
Суслики из Харьковской, Луганской и Белгородской областей в своих кариотипах содержат по 34 хромосомы (Рис. Зг). Десять пар аутосом представлены метацснтриками, пять пар - субметацентриками и две пары -субтелоцентриками. Х-хромосома является метацентриком средних размеров, а Y—хромосома - мелким акроцентриком. На третьей паре аутосом в середине длинного плеча при обычном окрашивании выявляется вторичная перетяжка (маркерный признак). Дифференциальная окраска (С-окраска) у животных из вышеуказанных областей выявила на всех хромосомах, в том числе и половых, хорошо выраженные прицентромерные гетерохроматиновые блоки. Вторая и третья пары аутосом, в отличие от других пар, имеют более мелкий блок прицентромергюго гетерохроматин а. Обнаружена одна пара (15-я) мелких аутосом с полностью гетерохроматиновым плечом (Рис. 4г).
Исследование на выявление ядрышкообразующих районов показало их наличие на двух парах аутосом: в районе вторичной перетяжки маркерной хромосомы и в теломерной области средней по размеру метацентрической хромосомы (10-я пара) (Рис. 5г).
Генетическая дифференциация сусликов рода Spermophilus
Цшпогенет и чесная дифференциация. Различия хромосомных наборов сусликов рода Spermophilus были установлены уже в первых кариологичеешх работах по исследованию наземных беличьих (Воронцов, Ляпунова, 1969; Nadler et a 1., 1969). Несколько видов этого рода: S. dauricus, S. relictus, S.fulvus, S, major, S. erythrogenys, S. musicus, S. pygmaeus, имеют один и тот же диплоидный набор (2n=36, NF=72). Однако, при общем морфологическом сходстве, их кариотипы отличаются относительным содержанием гетерохроматина, что коррелирует с особенностями организации генома (Lyapunova et al„ 1980).
. По нашим цитогенетическим данным кариотипы двух видов подрода Citellus - горного S. musicus и малого S. pygmaeus сусликов - такие же, как у ранее исследованных экземпляров (Воронцов, Ляпунова, 1969; Кораблев, 1983). Они отличаются морфологией мелкой пары хромосом и локализацией гетерохроматина. У горного суслика S. musicus выявляются теломерные блоки гетерохроматина на трех парах аутосом. Это единственный из всех палеарктических сусликов, у которого данный признак является стабильным, видоспецифичньгм. Из литературы известно (Кораблев, Ляпунова, 1987), что у берингийского суслика S. рапуі обнаружены дополнительные теломерные гетерохроматиновые блоки, но этот признак (в отличие от такового у горного суслика) не постоянен. Наблюдается внутри- и межпопуляционная изменчивость по числу теломерных гетерохроматиновых блоков у некоторых подвидов S. parry і. Предполагается, что стабилизация этих различий между подвидами берингийского суслика может привести к их дивергенции, в дальнейшем - вплоть до образования новых видов (Кораблев, 1988). Примером аналогичного дифференцирующего процесса могут служить близкие друг к другу виды - малый 5. pygmaeus и горный S. musicus суслики.
По данным В.П. Кораблева (1988), исследовавшего кариотипы шести особей горного суслика из п. Эльбрус в Кабардино-Балкарии, ядрышковый организатор у S. masicus находится на двух парах аутосом. Мы, изучив две популяции из окрестностей данного поселка, выявили два варианта по этому признаку. У одних животных горного суслика S. musicus ядрышковый организатор локализован на двух парах аутосом (видовой признак S. musicus), у других - на трех (видовой признак S. pygmaeus). При этом у всех исследованных нами животных на трех парах аутосом имеются теломерные блоки гетерохроматипа (видовой признак S. musicus). Предположение о том, что животные с тремя парами ядрышковых организаторов могут являться гибридами между горным и малым сусликами, так как они вылавливались в местах периодического перекрывания их ареалов, нам кажется не очень убедительным. Более вероятно предположить существование межпопуляционной изменчивости у S. musicus по этому признаку (Цвирка и др., 2000).
Наши цитогенетические исследования крапчатого суслика S. suslicus подтверждают ранее опубликованные данные (Воронцов, Ляпунова, 1969; Орлов и др., 1969; Белянин, Гайчеико, 1984; Denisov et al., 1969). Нами были также выявлены суслики с разными хромосомными показателями: у одной кариологической формы 2n=34 (NF=68), у другой - 2n=36 (NF=72) (Цвирка, 1997; 1999), которые различаются не только по количеству, но и по морфологии хромосом, локализации ядрышкового организатора (Korablev, 1994). Первые исследования кариотипов крапчатого суслика, проведенные без применения методов дифференциального окрашивания хромосом, из крайних точек (юго-западной и восточной частей ареала) показали, что 34 —хромосомная форма распространена в восточной части, а 36 - хромосомная - в западной. Ввиду отсутствия данных из центральной части ареала S. suslicus, граница между ними осталась не уточнена. Однако, основываясь на том, что для многих палеарктических видов сусликов рода Spermophilus крупные реки являются непреодолимыми преградами и поэтому часто они разграничивают видовые ареалы (Vorontsov et al., 1980), предположили, что граница между разнохромосомными формами крапчатого суслика проходит по реке Днепр (Белянин, Гайченко, 1984). Наши дальнейшие кариологические исследования iS". suslicus (Korablev, 1994; Цвирка, 1997) выяснили распространение двух кариоморф крапчатого суслика в центральной части ареала и подтвердили, что р. Днепр разграничивает их ареалы.
У крапчатого суслика S. sitslicits (2п=34) ранее была обнаружена изменчивость по некоторым цитогенетическим признакам. Так, у животных из окрестностей Харькова, в отличие от других 34- хромосомных крапчатых сусликов S. suslictts, имеющих две пары ядрышковых организаторов в кариотипе, ядрышкообразующие районы выделяются па трех парах аутосом, одна из которых является маркерной (Кораблсв, Ляпунова, 1996). На остальных хромосомах эти структуры локализованы в теломерных областях. Предполагается, что варьирование числа районов ядрышкового организатора связано с функционированием и (или) отсутствием только теломерных кластеров рибосомальных генов.
Две из одиннадцати самок из Ульяновской области в кариотипе имеют делецшо гетерохроматиновых плеч (NF=66) (Кораблев, Ляпунова, 1996). Среди сусликов из искусственно созданной популяции в Приэльбрусье также было найдено животное с делецией плеча в одном из гомологов самой мелкой пары аутосом, связанное с потерей гетерохроматинового материала. У другого суслика обнаружена диссоциация одной двуплечей хромосомы на две акроцентрические (2п=35) (Кораблев и др., 1991) и изменение локализации районов ядрышкового организатора. Причиной повышенной хромосомной изменчивости восточной кариоморфы авторы предположительно считают воздействие неблагоприятных антропогенных и абиотических факторов.
Ранее при исследовании крапчатых сусликов из заповедника «Стрелецкая степь» из Луганской обл. (ранее Ворошиловоградская обл.), на стыке ареалов 34 -хромосомной формы S. suslicus с малым сусликом S. pygmaens, были обнаружены животные, содержащие в диплоидном наборе 36 хромосом, как у малого суслика, и "маркерную" пару аутосом с вторичной перетяжкой, как у 34-хромосомной формы S. suslicus (Воронцов, Ляпунова, 1969).
