Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 5
1.1. Краткое описание сурков 5
1.2. Палеонтологическая история и становление ареалов сурков 7
1.3. Применение современных методов в систематике и филогенетических исследованиях сурков 14
1.4. Систематика рода Marmota 33
1.5. Цель и задачи исследования 38
Глава 2. Материал и методы исследования 39
2.1. Материал исследования 39
2.2. Первичная обработка материала 42
2.3. Кариологический анализ 45
2.3.1. Приготовление препаратов хромосом 45
2.3.2. Дифференциальное G-окрашивание хромосом 46
2.3.3. Дифференциальное окрашивание ядрышкообразующих районов (ЯОР) хромосом 46
2.4. Сравнительный анализ изменчивости протеинов методом электрофореза 47
2.5. Сравнительный анализ изменчивости ядерной ДНК методом HHTep-SINE-ПЦР 49
Глава 3. Результаты исследования генетического полиморфизма сурков 54
3.1. Результаты исследования кариотипов 54
3.1.1. Описания кариотипов 54
3.1.2. Результаты анализа G-окраски хромосом сурков 60
3.1.3. Результаты анализа NORs-окраски хромосом сурков 64
3.2. Результаты аллозимного анализа 64
3.2.1. Интерпретация электрофоретических данных 64
3.2.2. Генетическая изменчивость и дивергенция 66
3.3. Анализ полиморфизма ядерной ДНК в роде Marmota по данным интер-8ШЕ-ПЦР70
3.3.1. Анализ изменчивости яДНК 70
3.3.2. Филогенетический анализ 74
Глава 4. Обсуждение 79
4.1. Хромосомная эволюция в роде Marmota 79
4.1.1. Хромосомное видообразование в группе серых сурков и видовая самостоятельность лесостепного сурка 79
4.1.2. Хромосомная эволюция в роде Marmota 87
4.2. Аллозимная дифференциация 91
4.2.1. Биохимическая систематика 91
4.2.2. Палеонтологический возраст и генетическая дивергенция 92
4.3. Филогенетическая и таксономическая интерпретация результатов интер-MIR-ПЦР 94
4.4. Давняя гибридизация М. caudata и М. menzbieri 100
4.5. Таксономическое содержание полученных результатов 103
4.6. Филогенетические связи в роде Marmota и история становления его ареала 107
Выводы 117
Благодарности 119
Список использованной литературы
- Краткое описание сурков
- Дифференциальное G-окрашивание хромосом
- Результаты анализа NORs-окраски хромосом сурков
- Хромосомное видообразование в группе серых сурков и видовая самостоятельность лесостепного сурка
Введение к работе
Одной из центральных проблем эволюционной теории всегда были и остаются вопросы, связанные с процессом видообразования. Формирование видов может идти различными путями. Аллопатрическое и симпатрическое видообразование, естественный отбор и нейтрализм, накопление мутаций и хромосомные перестройки - разные пути, факторы и механизмы эволюции могут действовать в разных группах последовательно и в различных комбинациях.
Изучение различных механизмов видообразования в природе удобно проводить, используя модельные группы. Одной из таких групп являются сурки {Marmota). Голарктический род Marmota включает в себя формы, находящиеся на разных уровнях дифференциации. Среди них имеются хорошо морфологически и генетически дифференцированные симпатрические и семисимпатрические виды, аллопатрические виды и виды и формы, находящиеся на начальной стадии дивергенции. Неоднократные возникновения и исчезновения Берингийской суши, поддающиеся достаточно точной датировке, дают возможность определять время миграций и, соответственно, дивергенций некоторых форм. Имеющиеся палеонтологические находки сурков, как в Старом, так и в Новом свете позволяют сопоставлять данные генетического анализа с палеонтологической летописью. Все это делает сурков удобной модельной группой для изучения эволюционных процессов. Но, несмотря на пристальное внимание ученых-эволюционистов к этой группе, ряд проблем истории рода Marmota не имеет удовлетворительного решения. Дискутируется вопрос о месте происхождения и формирования рода, эволюционных отношениях берингийских видов camtschatica и broweri, времени дивергенции и филогенетических связях палеарктических форм.
Система рода Marmota разработана достаточно хорошо. Однако имеется ряд спорных вопросов, связанных с недостаточно четкой морфологической дифференциацией некоторых близких форм, трансгрессией признаков и наличием переходных форм. В частности, таксономический статус форм, традиционно объединяемых в группу bobak {baibacina, bobak, sibirica, himalayana), является предметом длительной дискуссии систематиков с начала прошлого века до наших дней. Использование генетических маркеров часто оказывается решающим в таксономических исследованиях. Однако отсутствие более или менее полной картины генетической изменчивости в роде Marmota препятствует решению спорных вопросов систематики сурков.
Наиболее адекватное представление об эволюционных процессах, ведущих к дифференциации природных популяций, о филогенетических связях форм и таксономическом уровне их дивергенции можно составить только на основе использования и сопоставления данных как классической биологии, так и современных методических разработок. Этот подход применяется для решения некоторых проблем эволюции и систематики сурков в данной работе.
Краткое описание сурков
Сурки - наиболее крупные представители семейства беличьих Sciuridae. Все сурки объединяются в один род Marmota Bltimenbach, 1779 и образуют весьма компактную группу экологически сходных видов. Все сурки имеют отчетливые черты специализации к норному образу жизни и к обитанию в открытых пространствах. Только американский лесной сурок М. топах имеет ряд адаптации к жизни в лесу. Специфической чертой биологии сурков является наличие у них зимней, а у некоторых видов и летней спячки.
Сурки распространены в открытых ландшафтах гор и равнин Северного полушария. Большая часть сурков является обитателями горных степей различного типа от альпийских лугов до горных пустынь и холодных тундро-степей за полярным кругом. В высокогорьях Центральной Азии и Северной Америки обитают на высотах превышающих 4000 м над ур. м. (Громов и др., 1965; Бибиков, 1989). Часто места обитания горных сурков приурочены к нагромождениям камней, имеющим моренный характер. Некоторые формы (байбак, частично тарбаган) обитают в степных равнинных ландшафтах Евразии. Лесной сурок заселяет открытые биотопы лесной зоны Северной Америки.
Сурки - территориальные животные. Они образуют колонии, которые состоят из участков, занимаемых отдельными семейными группировками. Размер семейного участка в среднем составляет 0,5-1 га. В состав семейной группы чаще всего входят самец-доминант, 1-2 размножающиеся самки, годовалые сурки и сурчата текущего года рождения. Молодые сурки начинают мигрировать после второй в их жизни зимовки. Расселяющиеся молодые сурки перемещаются на сравнительно небольшие расстояния от 300 м до 5 км. Иногда, впрочем, наблюдаются дальние перемещения зверьков, которые достигают нескольких десятков километров (Бибиков, 1962; 1989).
Отличительной чертой биологии сурков является способность впадать в сезонную спячку при наступлении неблагоприятных погодных условий. Возможность спячки обеспечивается способностью животных накапливать энергетические резервы в виде жировых запасов во время активного периода. Активный период у сурков обычно прекращается с окончанием периода вегетации. В разных частях ареала и у разных видов сурков продолжительность спячки колеблется от 6 до 9 месяцев. Как правило, сурки зимуют семейными группами в одной зимовочной норе в гнездовой камере, которая располагается в наиболее глубокой части норы на глубине от 1 до 5 м. Исключение составляет североамериканский М. топах, зимующий в одиночку. Спаривание происходит весной до выхода сурков из зимовочной норы, либо сразу же после выхода на поверхность.
Характерная черта поведения сурков как колониальных животных -способность общения членов колонии с помощью условных сигналов. В частности у сурков существует система оповещения о появлении потенциальной опасности посредством звукового сигнала - особого тревожного крика. Это позволяет повысить защищенность колонии и уменьшить смертность сурков от воздействия внешних врагов (хищники, человек).
Значение сурков для человека определяется тем, что они являются источником шкур, использующихся в меховой индустрии, диетического мяса и жира, имеющего ценные лечебные свойства (Федосеева, Казакова, 1999). Сурки также являются источником опасных для человека зоонозных инфекций, в частности чумы. В последнее время в Европе и Северной Америке возросла роль сурков как эстетического фактора в развитии туристической индустрии (Рамюсс, Жибуле, 1997; Луи и др., 2002).
Дифференциальное G-окрашивание хромосом
Для G-окрашивания хромосом применялся метод, предложенный М. Сибрайт (Seabright, 1971) с модификациями.
Препараты метафазных хромосом помещались в 0,25% раствор трипсина (рН=7.0 при температуре 37С) на время от 0,5 до 2 минут. Далее препараты инкубировались в солевом буферном растворе 2xSSC (0,ЗМ раствор хлористого натрия и 0,03М раствор трехзамещенного цитрата натрия; рН=6.8) при температуре 60С в течении 1 часа, после чего окрашивались в 4% растворе красителя Гимза, приготовленном на фосфатном буфере Зеренсена (1/15М Na2HP04 + 1/15М КН2РО4 в соотношении 1:1, рН=6.8) в течение 10-15 мин.
Выполнено по методу У. Хоуэла и Д. Блэка (Howell, Black, 1980) с некоторыми модификациями.
На поверхность препарата наносили 2 капли деионизированной воды, 6 капель 33%-ого раствора нитрата серебра (4 г AgNC«3 на 8 мл деионизированной воды) и 4 капли коллоидного проявляющего раствора (2%-ый раствор желатины на деионизированной воде с добавлением концентрированной муравьиной кислоты из расчёта 100 мкл на 10 мл раствора). Смесь осторожно перемешивалась с помощью автоматической пипетки таким образом, чтобы избежать её растекания по предметному стеклу. На поверхность капли осторожно наносилось чистое сухое покровное стекло и препарат помещался на несколько минут в термостат, нагретый до 58-60С, до тех пор, пока смесь под покровным стеклом не приобретала бронзово-коричневый цвет. После этого покровные стёкла смывались с поверхности предметного стекла струёй проточной воды, препарат ополаскивался дистиллятом и высушивался. Хромосомы подкрашивались в 2%-ом растворе красителя Гимза в течение 20-30 секунд.
Окрашенные препараты анализировали с помощью светового микроскопа. Метафазные хромосомы фотографировали цифровой фотокамерой "Nikon Coolpix 4500" или на микрофотопленку "Микрат 300", изображения с которой в дальнейшем вводили в компьютер с помощью фотосканера. Полученные изображения хромосом обрабатывались в пакете графических программ Corel Draw 8-11. Для проведения сравнительного кариологического анализа хромосомы в кариограммах располагались по группам на основе гомологии. Нумерация хромосом в тексте соответствует нумерации групп гомологичных хромосом.
Пробы тканей и органов сохраняли до электрофореза при температуре -70С.
Для сравнительного анализа уровня межвидовой генетической изменчивости у наземных беличьих в работе использовались пробы от представителей рода Spermophilns следующих видов: Sp.pygmaeus Pallas, 1778 - Саратовская обл. (4 экз.); Sp. suslicus Guldenstaedt, 1770 - Ульяновская обл., Николаевский р-н (4 экз.); Sp. musicus Menetrie, 1832 - Кабардино-Балкария, Приэльбрусье, Ирикское ущелье 5 км от п.Эльбрус (4 экз.); Sp. xanthoprymnus Bennet, 1835 - Армения, 10 км от Верин-Талина (3 экз.); Sp. dauricus Brandt, 1843 - Читинская обл., Ононский р-н, 10 км от п. Усть-Ималка (4 экз.); Sp.fulvus Lichtenstein, 1823 - Казахстан, Западно-Казахстанская обл., Урдинский р-н (4 экз.); Sp. major Pallas, 1778 - Саратовская обл., Балаковский р-н (2 экз.), Ульяновская обл., Новоспасский р-н (2 экз.); Sp. undulatus Pallas, 1778 - Якутия, 22 км от г.Якутска (3 экз.), Читинская обл., Ононский р-н (1 экз.); Sp.parryii Richardson, 1825 - Магаданская обл., п. Атка (3 экз.)
Электрофоретическое разделение ферментов и белков проводили в 7-7,5% полиакриламидном геле (табл. 3). Для выявления большинства ферментов использовались стандартные методики (Peacock et al., 1965; Davis, 1964; Межжерин, Морозов-Леонов, 1995), а идентификацию карбоновой ангидразы и креатинкиназы осуществляли окрашиванием на общий белок. Миоглобины идентифицировали по естественной розовато-красной окраске спектра, наблюдаемой при электрофорезе.
Результаты анализа NORs-окраски хромосом сурков
При анализе межвидовой и индивидуальной изменчивости ферментов и структурных белков идентифицировано 39 биохимических локусов. Из них 7 при данных условиях электрофореза были инвариантными, а ген-регулятор Ldr В был в активном состоянии у всех видов, при этом устойчивых различий в распределении гетеродимеров Ldh А-В в плазме не обнаружено. Трудности идентификации и унификации локусов возникли при анализе изменчивости следующих белков и ферментов.
Неспецифические эстеразы. В плазме крови были активными два локуса: катодный диффузный, идентифицированный как Es-a, и Es-І локус, имеющий достаточно высокую электрофоретическую подвижность и экспрессирующийся во всех исследованных тканях и органах. Es-15 идентифицирована в экстрактах печени и мышц, наилучший результат получен при анализе последних. Продукт локуса на электрофореграмме представлен серией, состоящей из нескольких полос. Стандартизация подвижности проводилась по наиболее интенсивной катодной фракции. Самый мобильный локус в экстрактах паренхимных тканей был идентифицирован как Es-2. Номенклатура локусов соответствует системе обозначений, принятой у домовых мышей (Bonhomme et al., 1984).
Белки плазмы. Локус Pt-І мигрировал строго между альбуминами и трансферринами. Судя по двойным гетерозиготам, фермент - мономер, проявляется одинаково хорошо и в плазме и в гемолизате. Постальбумин у большинства видов при стандартной концентрации акриламида мигрирует сразу за альбумином, поэтому идентификация аллелей затруднений не вызывает. Исключение составляют виды S. parry И и S.fulvus, у которых альбумин закрывает постальбумин. Так как в данном случае аллели локуса Alb имеют различную электрофоретическую подвижность, можно предположить, что и аллели локуса Post кодируют разные белки. Наиболее четкая электрофоретическая картина изменчивости локуса Alb имела место в экстрактах тканей. Интерпретация изменчивости данного белка не представляет затруднений, за исключением S. dauricus, где во всех случаях альбумин состоит из двух равных по интенсивности фракций. Это напоминает спектр альбуминов желтогорлой мыши Sylvaemus flavicollis, у которой этот белок на фореграмме также представлен двумя фракциями, но разной интенсивности (Межжерин и др., 1992).
Гемоглобины. У беличьих данный белок представляется в виде компактного спектра, состоящего либо из одной, либо из трех инвариантных в пределах вида фракций. В последнем случае интенсивность каждой фракции существенно ниже, чем в однополосом спектре. Есть все основания считать, что в данном случае гемоглобин кодируется двумя локусами. Более подвижный обозначен как Hb-A, а менее подвижный - НЬ-В. Глюкозофосфатизомераза. Проявляется на электрофореграмме двумя зонами активности: катодный спектр классического локуса Gpi-І и в центральной части электрофореграммы идентифицируется менее интенсивный локус Gpi-2, проявление которого, вполне вероятно, есть результат неспецифического переокрашивания.
Аллельные пулы исследованных таксонов сусликов и сурков представлены в табл. 4. Оценки ожидаемой гетерозиготности рассчитаны только для сусликов (табл. 4), где исследовано по 3-4 экземпляра каждого вида. Среднее значение для 9 видов рода составило 0,018, изменяясь в пределах от 0,061 у крапчатого суслика до 0 у малоазийского, что существенно ниже среднего для млекопитающих (Межжерин, 1992).
Дивергенция по генетическим дистанциям (D) и дифференциация по фиксированным генным различиям (Pfd) были просчитаны для 14 таксонов и для двух особей красного сурка отдельно. Причина такого представления данных по этому виду обусловлена наличием уникальных для рода аллелей (Adh95, Sod-290) у одной из двух исследованных особей. Полученные значения генетических дистанций и фиксированных генных различий даны в виде матрицы (табл. 5), которая была преобразована в фенограмму (рис. 14). Средняя генетическая дифференциация между видами сурков составила D=0,128, (Pfd=l 1.9), сусликов D=0,414, (Pfd=33.6) и между родами - D=0.854, (Pfd=56.7).
Хромосомное видообразование в группе серых сурков и видовая самостоятельность лесостепного сурка
Видовая самостоятельность лесостепного сурка. Систематическая принадлежность сурков Западной Сибири неоднократно являлась предметом исследования ряда авторов. Н.Ф.Кащенко (1899) при описании М. baibacina, кроме материала из Горного Алтая, имел черепа и скелеты сурков из окрестностей Томска. Не отметив у них существенных различий, он, тем не менее, не включил томский материал в описание М. baibacina. Н.Ф. Кащенко писал: "...при изучении этого сурка (алтайского сурка - прим. автора) я пользовался также черепами и скелетом сурков из окрестностей Томска, ничем существенным от алтайского материала не отличающимися и, по всей вероятности, принадлежащими тому же виду. Но так как этого я все же положительно утверждать не могу, то в описание я внес только то, что вытекает из изучения алтайских препаратов". С.Ю.Строганов и Б.С.Юдин (1956), имея в своем распоряжении материал из окрестностей Томска, описали подвид М. b. kastschenkoi основываясь на особенностях окраски меха. Л.И. Галкина (1962а), проведя сравнительно-морфологическое исследование сурков Южной Сибири, отнесла к этому подвиду всех западносибирских лесостепных сурков.
Исследования Л.И. Галкиной (1962а; 1970) выявили отличия между М. b. kastschenkoi и номинативным подвидом по строению черепа и os penis. Было показано, что различия в строении os penis являются таксономически значимым признаком у сурков (Галкина 1962а, Ь; Червякова, 1966). Л.И.Галкина (1962а) отмечает: "Новосибирский сурок по структуре os penis ближе всего стоит к
M. sibirica, отличаясь от него многими другими признаками...". Тот же автор (Галкина, 1970) описывает отличия лесостепного сурка от алтайского по строению черепа: "1) в среднем межглазничное пространство шире, заглазничное уже, чем у алтайского; 2) os lacrimale относительно меньше, чем у алтайского, орбитальные выросты верхней челюсти часто не соединены с задним краем слезной кости, у номинального подвида названные выросты соединены на всем протяжении с задним краем слезной кости; 3) промежуточный бугорок Р4 развит лучше, чем у номинального подвида". Обратив внимание на отличие лесостепного сурка от алтайского по ряду признаков и неясность его систематического положения, Л.И. Галкина все же отнесла его к М. baibacina, учитывая их сходство в конфигурации черепа и трансгрессию морфологических признаков.
Кроме морфологических лесостепной сурок имеет и ряд экологических особенностей. Он обитает в условиях сильно расчлененного рельефа, образуя колонии не только на степных участках, но и в лесных биотопах (Огнев, 1947; Галкина, 1968), чем отличается от других палеарктических сурков, избегающих заросших лесом участков (рис. 18, 19).
Популяции лесостепных сурков, из которых нами получен кариологический материал, находятся на значительном удалении друг от друга (рис. 20) и расположены в северной, центральной и южной частях ареала этого таксона. Отсутствие хромосомного полиморфизма у изученных представителей данных популяций позволяет нам утверждать, что лесостепные сурки по всему своему ареалу обладают хромосомным набором с 2п=36, JVF=68, отличным от кариотипов других сурков.
Известно, что характеристики кариотипа видоспецифичны. Различие в диплоидном числе и морфологии хромосом у близких видов является хорошим дифференцирующим признаком и свидетельствует об их видовой самостоятельности (Воронцов, 1958). Таксономическое значение кариотипа как дифференцирующего признака в группе палеарктических сурков весьма высоко в связи с низким хромосомным полиморфизмом в данной группе.
На основании кариотипических отличий предлагается повысить таксономический статус лесостепного подвида серого сурка до уровня вида Marmota kastschenkoi — лесостепной сурок Кащенко (Брандлер, 2003). Мы считаем возможным, для данного таксона использовать описание и диагноз, приведенные ранее для подвида М. Ъ. kastschenkoi Л.И. Галкиной (Галкина, 1970), основанные на подробных морфологических исследованиях серых сурков Южной Сибири. Мы предлагаем дополнить это описание следующей характеристикой кариотипа. В кариотипе 2«=36, NF=6&. В хромосомном наборе 15 пар двуплечих хромосом, из которых выделяется одна пара наиболее крупных метацентриков, 2 пары акроцентриков. Половые хромосомы: X - средней величины метацентрик, Y -точечный элемент набора.
