Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 7
1.1. Ген BoLA-DRB3 как один из ключевых генов Главного Комплекса Гистосовместимости 7
1.1.1. Главный Комплекс Гистосовместимости (ГКГ): общие положения 7
1.1.2. Главный комплекс гистосовместимости крупного рогатого скота (BoLA) 15
1.1.3. Ген BoLA-DRB3: структура, функции, полиморфизм в популяциях 18
1.2. Вирус лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС): патогенность, геном, методы детекции, распространение 32
1.2.1 Латогенность 32
1.2.2.Геном ВЛКРС 34
1.2.3.Методы детекции ВЛКРС 46
1.2.4.Мировое распространение ВЛКРС 49
2. Материалы и методы 52
2.1. Выделение ДНК 52
2.2. Определение концентрации ДНК 53
2.3. Анализ полиморфизма гена BoLA-DRB3 методом ПЦР-ПДРФ 54
2.4. Анализ последовательностей От- и Ин-фрагментов renapol ВЛКРС 60
2.5. Методы статистической обработки данных 62
3. Результаты и обсуждение 64
3.1. Сравнительный анализ разнообразия и характера распределения аллелей гена BoLA DRB3 у изученных пород крупного рогатого скота 64
3.1.1. Оптимизация условий типирования аллелей гена BoLA-DRB3 64
3.1.2. Сравнительный анализ разнообразия и характера распределения аллелей гена BoLA-DRB3 у изученных пород крупного рогатого скота 67
3.1.3. Сравнительный анализ разнообразия и характера распределения BoLA-DRB3 генотипов у изученных пород крупного рогатого скота 75
3.2. Анализ полиморфизма гена BoLA-DRB3 в связи с резистентностью к лейкозу, ряду
других заболеваний, признаками молочной продуктивности 79
3.2.1. Анализ распределения аллелей гена BoLA-DRB3 в связи с устойчивостью и
восприимчивостью к лейкозу 79
3.2.2. Распределение частот BoLA-DRB3-renoTmiOB, ассоциированных с устойчивостью и восприимчивостью к лейкозу у изученных пород КРС 83
3.2.3. Распределение чаетот аллелей гена BoLA-DRB3 у исследованных пород КРС в связи с резистентностью к маститу 91
3.2.4. Распределение чаетот аллелей гена BoLA-DRB3 в евязи с уетойчивостью к другим заболеваниям Q4
3.2.5. Распределение аллелей гена BoLA-DRBS,
аесоциированных с признаками молочной продуктивноети
3.3. Идентификация новых форм и классификация изолятов вируса лейкоза крупного рогатого скота России и Украины, на оенове анализа изменчивоети вирусного гена
Заключение 109
Выводы 112
Список литературы
- Главный комплекс гистосовместимости крупного рогатого скота (BoLA)
- Анализ полиморфизма гена BoLA-DRB3 методом ПЦР-ПДРФ
- Сравнительный анализ разнообразия и характера распределения BoLA-DRB3 генотипов у изученных пород крупного рогатого скота
- Распределение частот BoLA-DRB3-renoTmiOB, ассоциированных с устойчивостью и восприимчивостью к лейкозу у изученных пород КРС
Введение к работе
Актуальность темы
Одной из проблем российского животноводства является обеднение породного, а значит, и генетического разнообразия крупного рогатого скота (КРС). Из 70 пород, разводимых на территории бывшего СССР в 80-90е гг XX, на сегодняшний день официально зарегистрировано 18 отечественных пород крупного рогатого скота. Обеднение генетических ресурсов КРС, может привести к снижению эффективности селекции и снижению резистентности животных к постоянно эволюционирующим возбудителям заболеваний. В связи с этим, важно поддерживать максимально возможное разнообразие генофонда КРС.
Необходимым условием для проведения таких работ является проведение генетического мониторинга пород КРС на молекулярном уровне. Особый интерес представляют гены, участвующие в формировании полезных признаков. Одним из наиболее значимых в этом отношении генов является ген BoLA-DRB3, кодирующий антигены класса II главного комплекса гистосовместимости КРС, обладающий высоким аллельным разнообразием. Установлены ассоциации аллельных вариантов данного гена с устойчивостью к таким заболеваниям, как лейкоз, мастит, цистит, дерматофилоз, тейлериоз, кожному заболеванию, вызываемому иксодовыми клещами Boophilus microplus.
Особенно актуальным является изучение полиморфизма гена BoLA-DRB3 в связи с резистентностью к лейкозу. Лейкоз крупного рогатого скота (КРС) -хроническое инфекционное заболевание опухолевой природы, в основе которого лежит системное поражение лейкопоэтической ткани. Данное заболевание широко распространено в нашей стране и приносит значительный экономический ущерб сельскому хозяйству вследствие падежа животных, недополучения продуктов животноводства, потери уникального генофонда в молочном скотоводстве. В первую очередь лейкозу подвержены высокопродуктивные животные. Возбудителем данного заболевания является вирус лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС). Для эффективной профилактики лейкоза важно не только учитывать данные о полиморфизме гена BoLA-DRB3 КРС в селекционной работе, но и рассматривать распространение различных форм ВЛКРС на территории регионов нашей страны. В странах Западной Европы и Америки обнаружены географические изоляты ВЛКРС, генотипы которых существенно различаются. Однако российские разновидности ВЛКРС не исследовались.
Таким образом, исследование полиморфизма гена BoLA-DRB3 у отечественных пород КРС актуально в связи с необходимостью разработки селекционно-генетических подходов к оздоровлению стад животных и проблемой сохранения пород и их биоразнообразия. Несомненный практический интерес представляет детекция эндемичных для России разновидностей ВЛКРС.
Цель исследования
Цель данного исследования - анализ полиморфизма гена BoLA-DRB3 у калмыцкой, якутской, костромской, красно-пестрой, черно-пестрой пород КРС и зебувидного скота, а также детекция форм ВЛКРС, распространенных на территории Российской Федерации.
Задачи исследования:
Изучить разнообразие и характер распределения аллелей и генотипов BoLA-DRB3 у шести пород КРС: у калмыцкой, якутской, костромской, красно-пестрой, черно-пестрой пород КРС, зебувидного скота и провести сравнительный анализ с ранее изученными породами.
Оценить характер распределения BoLA-DRB3-аяяєяєй и генотипов, ассоциированных с резистентностью к лейкозу, в исследованных породах КРС.
Оценить характер распределения аллелей гена BoLA-DRB3, ассоциированных с резистентностью к другим заболеваниям (маститу, циститу, отслоению плаценты, клещевому заболеванию, вызываемому Boophilus microplus), в исследованных породах КРС.
Оценить характер распределения аллелей гена BoLA-DRB3, ассоциированных с признаками молочной продуктивности, в исследованных породах крупного рогатого скота.
На основании анализа полиморфизма гена рої выявить формы ВЛКРС, распространенные на территории РФ.
Научная новизна
Впервые получены данные о полиморфизме гена BoLA-DRB3 у пород отечественной селекции (калмыцкой, якутской, костромской пород КРС, зебувидного скота), хорошо приспособленных к суровым условиям обитания в регионах Российской Федерации, относящихся к различным географическим и климатическим зонам.
Впервые проведен сравнительный анализ разнообразия и характера распределения аллелей и генотипов BoLA-DRB3, ассоциированных с признаками молочной продуктивности и резистентностью к заболеваниям, у пород КРС российской селекции. Показана высокая частота аллелей и генотипов, определяющих устойчивость к лейкозу, у костромского, калмыцкого и зебувидного скота.
Впервые на основе анализа нуклеотидной последовательности вирусного гена рої охарактеризована изменчивость вируса лейкоза КРС в животноводческих хозяйствах на территории России и Украины.
Впервые выявлены новые формы ВЛКРС, эндемичные для России.
Предложена новая классификация форм ВЛКРС на основе анализа изменчивости областей гена рої, кодирующих обратную транскриптазу и интегразу.
Практическая значимость
Полученные в ходе выполнения работы данные по аллельному полиморфизму гена BoLA-DRB3 и частотам встречаемости ценных аллелей, ответственных за устойчивость к заболеваниям, у широкого спектра отечественных пород, могут стать фундаментальной основой для разработки селекционно-генетических подходов к оздоровлению стад животных и сохранению биоразнообразия. Высокое содержание ценных аллелей и генотипов у костромского, калмыцкого и зебувидного скота может служить основанием для разработки программ по сохранению их генофондов и рациональному использованию в целях улучшения генофондов других пород КРС, разводимых в России.
Разработанные новые варианты аллель-специфичной ПЦР, позволяющие дифференцировать трудно тестируемые аллели (*07 и другие), могут быть использованы для разработки тест-систем с повышенной точностью типирования аллелей гена BoLA-DRB3 и получить применение в научной и селекционной практике.
Обнаружение российских разновидностей ВЛКРС позволит в будущем создать эффективные диагностикумы для детекции вирусоносительства среди КРС с учетом эндемичных для России форм вируса.
Апробация результатов
Основные положения и результаты работы были представлены на XVII Международной конференции "Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии", секция - "Геномика. Гены и болезни" (Ялта-Гурзуф, 2009), на научно-практических конференциях «БиоТехЖ-2008» (Дубровицы, 2008), «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», (Москва, 2010), «Популяционная генетика: современное состояние и перспективы», посвященная памятной дате, 75-летию со дня рождения академика Ю.П. Алтухова (Москва, 2011); на межлабораторном семинаре отдела генетики животных Института общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН (Москва, 2011).
Декларация личного участия автора
Диссертация написана автором лично с использованием собственных результатов, а так же результатов, полученных ранее в лаборатории. Автор самостоятельно осуществлял выделение ДНК, постановку ПНР и АС-ПЦР, рестрикционный анализ, электрофоретический анализ, статистическую обработку данных. Данные о полиморфизме гена BoLA-DRB3 у костромского и якутского скота получены совместно с н.с. Т.А.Штыфурко. Данные о полиморфизме данного гена у ярославского и монгольского скота, использованные в сравнительном анализе, были получены ранее к.б.н. М. Мохаммад Абади. Обработка последовательностей ВЛКРС проводилась совместно с д.б.н. Б.В. Андриановым. Обсуждение результатов исследования и
написание научных публикаций осуществлялась при участии научного руководителя д.б.н. Сулимовой Г.Е.
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 147 страницах машинописного текста, включая 30 таблиц, 26 рисунков. Список литературы включает 190 наименований.
Главный комплекс гистосовместимости крупного рогатого скота (BoLA)
Строение молекул ГКГ класса II принципиально сходно с таковым молекул класса I, несмотря на большие различия в составе образующих их субъединиц (рис.2). В состав этих молекул так же входят две цепи -аир, но в отличие от существенно отличающихся друг от друга а- и р-цепей молекул класса I, а- и Р-цепи молекул класса II очень сходны между собой. Обе цепи кодируются разными генами, расположенными в описываемом регионе ГКГ. Цепи аир представляют собой трансмембранные полипептиды внеклеточная часть которых организована в два домена по 90 аминокислотных остатков каждый. Гидрофобный трансмембранный домен содержит 30, а цитоплазматический участок 12-15 остатков. Домены а2 и Р2 прилежат к мембране, они гомологичны доменам иммуноглобулинов и имеют Р-слоистую структуру. Наружные домены al и pi по конфигурации аналогичны al и а2 доменам молекул класса I. Наиболее существенное различие между доменами al и pi состоит в отсутствии внутридоменной дисульфидной связи в al и ее наличии в pi. В этих доменах содержатся полиморфные последовательности, которые участвуют в формировании щели для связывания антигенного пептида (рис.З). Полиморфизм в значительно большей степени характерен для Р-, чем для а-цепи. В р-цепи HLA-DQ они соответсвуют аминокислотным остаткам в положениях 52-58, 70-77, 84-90. Структура щели в молекулах второго класса в принципе аналогична таковой в молекуле класса I: на р-слоистой поверхности располагаются две а-спирали, служащие стенками щели. Однако если в молекулах I класса щель сформирована разными доменами одной цепи, то в молекулах II класса она образована двумя разными цепями. Это обуславливает особенности встраивания в них антигенных пептидов. Щель в молекуле класса I замкнута с обоих концов и соответствует в среднем 9 аминокислотным остаткам. Для некоторых аллельных вариантов молекул длина встраиваемого пептида может составлять до 13 аминокислотных остатков, в этом случае пептид выбухает из щели, образуя арку. В молекулах класса II щель для связывания пептида открыта с обеих сторон. Длина встраивающихся в нее пептидов составляет 12-25 остатков, что превышает длину щели. Кроме этого, в данном случае пептид заякорен в пяти позициях, поэтому он прилежит к дну щели, а его концы выступают за ее пределы (Ярилин, 1999).
Антигены класса II отмечены на поверхности В-лимфоцитов, макрофагов и активированных Т-клеток (German, Hendrix, 1991). Их функция состоит в том, чтобы представить чужеродные белки после внутриклеточного процессинга Т-хелперам, которые затем стимулируют соответствующий иммунный ответ гуморального типа. Основной особенностью комплекса является значительная полигенность (наличие нескольких неаллельных близкосцепленных генов, белковые продукты которых сходны в структурном отношении и выполняют идентичные функции) и ярко выраженный плиморфизм (присутствие многих аллельных форм одного и того же гена). Вес гены комплекса наследуются по кодоминантному типу. Полигенность и полиморфизм определяют антигенную индивидуальность особей данного вида (http.//medbiol.ru/niedbiol/immunologv/imm-gal/0006Rnhahtni Вариабельность молекул ГКГ реализуется на уровне популяций человека и животных. Отдельный индивид может иметь не более двух разновидностей продуктов каждого гена ГКГ, следовательно не может полноценно распознавать весь спектр белковых пептидов, но для популяции в целом така возможность гарантирована разнообразием репертуара молекул ГКГ (Ярилин, 1999).
Высказываются четыре гипотезы в качестве оснований, вызывающих полиморфизм генов ГКГ: необычайно высокая скорость мутирования, конверсия генов или межлокусный обмен генетическим материалом, частотно-зависимый отбор, отбор сверхдоминирования. Наиболее вероятной считалась гипотеза сверхдоминирования (преимущества гетерозигот), обусловленная антиген-связывающими функциями молекул. Она была предложена в связи с наблюдениями о различных способностях конкретных аллельных продуктов представлять чужеродные белки Т-клеткам. Таким образом, в популяции, подверженной воздействию многочисленных патогенов, гетерозиготные индивидуумы будут иметь преимущество, так как смогут связывать большое количество чужеродных антигенов (Huges, Nei, 1989; Hedrick, 1991; «Главный комплекс...», 1993).
В природных популяциях отмечен избыток гетерозигот. Повышенная гетерозиготность характерна для молекул класса 1, принимающих участие во взаимодействии с пептидами. Несколько ниже уровень гетерозиготности на участках, связывающихся с рецепторами Т-клеток, а наименьший - в консервативных участках молекул (Hedrick, 1991).
Разнообразие гомологичных al и а2 доменов несколько отличается и может коррелировать с частичным разделением функций, касающихся связывания пептида и Т-клеточных рецепторов. Консервативные участки молекулы, по-видимому, участвуют в поддержании общей конформации молекулы класса I, в ориентации молекулы на поверхности клеточной мембраны. Поддержание полиморфизма наиболее вероятно обеспечивается действием отбора на антиген-узнающий сайт (ARS) молекулы ГКГ, так как было показано преобладание значимых нуклеотидных замен в зонах молекулы, входящих в ARS (57 ко донов) и меньше, чем в других участках гена количество молчащих замен (Huges, Nei, 1989). Впоследствии было показано, что скорость значимых замен в связывающей щели значительно выще, чем в других участках антиген-узнающего сайта. Кроме того, отбор действует для того, чтобы способствовать разнообразию профиля распределения зашшов в связывающей щели (Huges, 1990). Отмечено, что профиль распределения зарядов аминокислотных остатков служит определяющим фактором в способности к связыванию того или иного чужеродного белка.
Полученные результаты хорошо согласуются с гипотезой поддержания полиморфизма антигенов ГКГ с помощью отбора сверхдоминирования, обусловленного способностью связывать чужеродные антигены и, таким образом, обеспечивающего устойчивость к заболеваниям.
Генетический полиморфизм ГКГ характеризуется чрезвычайно высоким разнообразием аллелей и большим количеством нуклеотидных замен между аллелями Так, например, в природных популяциях мышей отмечено около 100 аллелей в КЙЖДОМ функциональном локусе классов I и П. Отдельные продукты аллельных генов мыши различаются более, чем на 50 аминокислот, а кодирующие последовательности -примерно на 70 нуклеотидов в кодирующий районах. Количество нуклеотидных замен между аллелями одного локуса составляет от 1 до 50.
Для полиморфных генов класса II большая часть полиморфизма приурочена к дистальному от мембраны домену (Bell et al., 1989). Показано, что обмен генетической информацией в рі-домене DRB-родственных генов играет важную роль в их эволюции. Второй домен, кодируемый экзоном 3, консервативен. Интересно, что ос2 и 2 домены антигенов класса II, как «3 домен антигенов класса I и р2-микроглобулин, напоминают по своей последовательности постоянные домены тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов. Все перечисленные домены молекул ГКГ высоко консервативны (Colombani, 1990). Высокий консерватизм некоторых участков молекул ГКГ, по-видимому, связан с конформационными требованиями, необходимыми для объединения а- и -цепей в гетеродимер (Gyllenstein, Erich, 1989). Поддержание консерватизма названных участков предполагает, что отбор действует против нарастания полиморфизма в их последовательностях. Отдельные нуклеотиды в первом домене так же консервативны. в некоторых случаях полиморфизм генов класса II обусловлен альтернативным сплайсингом. Чаще всего этот механизм затрагивает цитоплазматический участок молекул Р-цепей DQ, DR и DP-генов (Briata et al., 1989).
У разных видов наблюдается полиморфизм по количеству генов в конкретных областях ГКГ. Так, у кролика, крысы и мыши по одной транскипционно активной копии гена, эквивалентного DQA. В геноме человека два DQA-гена, но только один из них транскрибируется. У овцы два транскрибирующихся DQA-гена (Scott et al, 1991; Andersson, Rask, 1988; Zhu et al., 1991).
Столь высокий уровень полиморфизма отдельных генов ГКГ предполагает наличие различных механизмов для поддержания полиморфизма одних генов и мономорфизма других. Возможно наличие участков хромосомы, в которых по структурным или физическим причинам не могут происходить события типа конверсии генов и рекомбинации. В качестве другого механизма, поддерживающего мономорфизм на уровне последовательности ДНК, следует предположить действие стабилизирующего отбора на продукты генов. Различия в уровне полиморфизма конкретных генов класса II несомненно обусловлены дифференциацией их функций («Главный комплекс...», 1993).
Анализ полиморфизма гена BoLA-DRB3 методом ПЦР-ПДРФ
Так же было показано, что аллели DRB3.241 ( 0901, особенно - 0902), 4701 ( 12) ассоциированы с низким провирусным грузом, 1501 и 1503 ( 16) - с высоким. Генотипы по BoLA-DRB3, несущие хотя бы один аллель «устойчивости» к лейкозу и не несущие аллелей «восприимчивости» к этому заболеванию, были ассоциированы с низким провирусным грузом. Генотипы, содержащие аллели «восприимчивости» к лейкозу - с высоким. Для генотипов, состоящих из аллелей «устойчивости» и «восприимчивости» к лейкозу подобных ассоциаций обнаружено не было (Miarena et al., 2008).
Важно отметить, что отбор животных, несущих аллели, ассоциированные с устойчивостью к лейкозу, не приводит к ослаблению общей устойчивости к другим вирусам, таким, как вирус ящура, диареи КРС, герпеса КРС I типа (Miarena et al, 2009).
Изучены ассоциации различных аллелей гена BoLA-DRB3 с заболеваниями, вызываемыми бактериями. Гак, было показано, что аллель DRB3.2 2703 ( 23) ассоциирован с успехом вакцинации против тейлериоза. Иммунизированные животные с таким аллелем не проявляли симптомов заболевания после вакцинации. Аллель DRB3.2 1501 ( 16) ассоциирован с неудачей иммунизации при этом заболевании (Ballingal et al., 2004). Показано также, что различные аллели DRB3 не ассоциированы с устойчивостью и восприимчивостью к Neurospora caninum (Schwab et al., 2009).
Одно из важнейщих заболеваний бактериальной природы — мастит, или воспаление молочной железы. До 30% переболевших маститом коров выбраковываются из-за атрофии четвертей вымени. В результате средняя продолжительность жизни коровы не превышает 5-ти лет, а продукцию от нее получают всего лишь 2-3,5 года. Следовательно, от каждой такой коровы недополучают минимум 3 - 4 теленка и удой молока за 3 - 4 лактации.
Инфекционный мастит возникает в результате проникновения в вымя через сосковый канал стрептококков, стафилококков или кишечной палочки. Источником заражения могут быть такие заболевания половых органов, как задержание последа выпадение влагалища. Широко распространены также неинфекционные маститы, связанные с неправильным доением животных, плохим уходом за выменем, с ушибами вымени, трещинами на сосках. Признаком мастита является выдаивание из больной четверти вымени творожистых сгустков с неприятным зшізхом, иногдз. с примесью крови Устойчивость к маститу ассоциируется с маркерами BoLA (Giovambattista et al., 1996, Dietz et al., 1997ab, Keim et al., 1997, Starkenburg et al, 1997, Sharif et al. 1998 Gilliespie et al, 1999). Выявленная ассоциация обусловлена тем, что продукт гена BoLA непосредственно участвует в связывании чужеродных антигенов и обусловливает специфичность иммзнного ответа.
Однако, микрофлора, вызывающая мастит, может быть разнообразной, включая E.coli. Поэтому пока нет полной ясности относительно ассоциации конкретных аллелей BoLA-DRBS с резистентностью к данному заболеванию. Так, с устойчивостью к маститу связывают аллелл DеB3.2и, 41, 43, 48, 22, 24, 27 (Kulberg et al., 2007); 5 (Rupp et al., 2007); П01 ( 22) к стрептококковым и стафилококковым маститам, 4201 ( S) - к маститам, вызванным Staphylococcus aureus. Streptococci, Е.coli. (Yoshida et al, 2009). C восприимчивостью к маститу ассоциированы 22, 26 (Kulberg et al., 2007); 8 (Rupp et al., 2007); 25 (Shariff et al, 1998); 8 (Pashmi et al, 2007); 0101 ( 24) - c маститом, вызванным стаффилококками и Е.coli, 4506 {46) - с маститом, вызванным Е.coli. (Yoshida et al, 2009). Некоторые авторы предполагают, что скорее гаплотипы, а не генотипы ассоциированы с устойчивостью к маститу (Kulherg et al., 2007).
Для мастита, вызываемого стафилококковой инфекцией показана важная роль позиций 74, 13, 71 в четвертом желобке антиген-связывающего сайта. Наличие глутамина в р74 приводит к проявлению мастита. Такое положение глутамина определяется аллелями 22, 23, 24. Присутствие аргинина или лизина (положительно заряженного основания) в іЗ связано с повышенным риском мастита, вызываемого Staphylococcus spp. Подобное расположение аминокислот определяется аллелями 23 и 8. Появление аргинина в локусе 71 так же приводит к развитию заболевания. Это определяется аллелями 22, 23. (Sharif et al, 2000).
Важно так же, какие аминокислоты расположены в позициях 9-11-13-30. Наличие в этих локусах аминокислот Елу-Сер-Сер-Тир ассоциировано с восприимчивостью к четырем типам мастита, вызванного Staphylococci, Staphylococcus aureus. Streptococci, E.coli. Такое расположение аминокислот кодируется аллелями 0101 ( 24) и 1506 ( 7б). Наличие в этих позициях Глн-Гис-Глу-Гис-86-Вал определяет устойчивость к стрептококковому и стафилококковому маститу. На устойчивость к маститу, вызванному Е.coli, аминокислоты в данных позициях оказывают меньший эффект. В этом случае важны замены в 47 и 67 позициях седьмой бороздки, а также 71 и 74 в четвертой бороздке антиген-распознающего сайта. Наличие в этих позициях аминокислот Тир-Иле-Ала-Ала ассоциировано с устойчивостью к маститу, вызванному Е.coli. Подобное расположение аминокислот кодируется аллелем 1201 ( S). (Yoshida et al, 2009b).
По некоторым данным полиморфизм гена BoLA-DRB3 вообще слабо ассоциирован с резистентностью к маститу. Более важными оказываются аллельные варианты гена BoLA-DQAl. Его аллели 0101, 10012 ассоциированы с восприимчивостью к стрептококковому маститу. Гомозиготы 0101/4101 восприимчивы к стрептококковому маститу, 10011/ 10011 - к маститу, вызванному Е.coli. (Takeshima et al., 2008).
Так же показаны ассоциации полиморфизма гена BoLA-DRB3 с клещевыми заболеваниями. Повышенный риск заражения иксодовыми клещами Boophilus microplus определяется аллелями DRB3-184, DRBP1-128, ВМ1815-152, DRBP1-130 (Acosta-Rodrigues et al., 2005). Этому заболеванию самки подвержены менее, чем самцы. Короткошерстные животные с прямой шерстью более устойчивы, чем длинношерстные с волнистой шерстью. Реже страдают животные со светлой шкурой. С устойчивостью к поражению клещами этого вида ассоциированы аллели BoLA-DRB3.2 l8, 20, 27, 1 б (Martinez et al., 2006). Клещи Ambylomma variegatum вызывают дерматофилоз. Показано, что полиморфизм второго экзона BoLA-DRB3 ассоциирован с резистентностью к этому заболеванию (Maillard et al., 1993). Устойчивость к дерматофилозу определяется положением в позициях 66-67-74-78 в антиген-распознающем сайте аминокислот Глу-Иле-Ала-Тир. Предполагаемые признаки никогда не встречаются в одном гаплотипе. (Maillard et al., 1996). Гаплотип восприимчивости удалось выявить. Это DRB3 09+DQB 1804. Выбраковка животных с таким гаплотипом позволила снизить заболеваемость в опытном стаде с 0,76 до 0,02 за 5 лет. Так как данные гены являются высокополиморфными, то можно было элиминировать один полиморфизм, не теряя генетического разнообразия и других полезных признаков. (Maillard et al., 2002, 2003). Обнаружено также, что аллель fda ассоциирован с гиперчувствительностью к этому заболеванию (Rasafmdribe et al, 2006).
Стоит также отметить, что аллели BoLA-DRB3.2 16 и 22 ассоциированы с низким риском цистита, 5 с низкий риск отслоения плаценты (Sharif et al., 1998); 1001 ( J) со сниженным, а 2703 ( 25) - повышенным риском выкидышей. (Schwab et al., 2009). Показано также, что данный полиморфизм контролирует и иммунный ответ организма. Так, аллели BoLA-DRB3.2 3, 24 ассоциированы с преобладанием иммунного ответа, осуществляемого антителами (AMIR, antibody-mediated immune response), a аллель 22 - с преобладанием клеточного иммунного ответа (CMIR cell-mediated immune response), которые направлены на внутриклеточные и внеклеточные патогенны соответственно (Rupp et al., 2007).
Сравнительный анализ разнообразия и характера распределения BoLA-DRB3 генотипов у изученных пород крупного рогатого скота
Хотя TxRE энхансер является главным регуляторным элементом вирусной экспрессии, другие U3 элементы также модулирует LTR-направленную транскрипцию Так, NF-kB-связанный сайт, расположенный между проксимальным и центральным TxRE энхансерами, связывается in vitro с несколькими белками каппа В семейства, включая р49, р50 и р65, и дает возможность происходить дальнейшей активации транскрипции Другой мотив, расположенный около 5 конца проксимального TxRE энхансера, необходим для распознавания LTR глюкокортикоидами. PU-бокс расположенный в координатах -95/-84 пн специфически взаимодействует с PU1 и относящимися к Ets транскрибционными факторами Spi-B. Мутации внутри этого элемента уменьшают основную LTR-регулируемую экспрессию генов, но не ослабляют восприимчивость к Tax. Мотив Е-бокса (5 -CACGTG-3 ), расположенный ниже старта транскрипции, связывает основную структуру «спираль-петля-спираль» транскрипционных факторов USF1 и USF2 и регулирует LTR промотор. Так же транскрипция вируса регулируется R Наконец, сайт связывания фактора регуляции интерферона в U5 взаимодействует с IRF-1 и IRF-2 и стимулирует основную экспрессию при отсутствии Tax. Таким образом, транскрипция вируса регулируется значительным числом сайтов, расположенных в 5 LTR.
Транскрипция вируса регулируется на другом уровне с помощью эпигенетических модификаций, таких как ацетилирование гистонов и ДНК. Действительно культивирование мононуклеарных клеток периферической крови животных инфицированных ВЛКРС, в присутствии ингибиторов деацетилазы гистонов значительно увеличивает экспрессию вируса. Близкие корреляции связывают уровень ацетилирования гистонов и активация транкрипции LTR. Ингибиторы гистоновой ДЄЗДСТИЛЗЗЬІ увеличивают трансактивацию LTR Tax-элементом сходным способом с CRE. Методом иммунопреципитации хроматина показано, что трихостатин А увеличивает занятость CRE-элементов CREB/ATF.
ДНК метилирование может быть с другой стороны регулятором LTR-транскрипции. Действительно, in vitro метилирование LTR по CpG метилтранферазой SssI уменьшает LTR активность. Однако лишь минимальная степень метилирования была обнаружена на всех стадиях развития заболевания у КРС и овец. Для уточнения Г) ОЛИ метилирования в активизации LTR необходимы дальнейшие эксперименты.
Наконец, вирусная экспрессия также регулируется на посттранскрипционном уровне с помощью вирусного белка, называемого Rex, который взаимодействует с последовательностями РНК, расположенными между ААТААА сигналами и сайтом полиаденилирования. Тот участок способен складываться в стабильную шпилечную структуру и нести два сигнала терминации транскрипции одновременно. Связывание Rex необходимо для переноса из ядра в цитоплазму несплайсированного или отдельно сплайсированного ВЛКРС транскрипта.
Гены gug. Ген gag кодируется предшественником Pr44gag, который впоследствии разрезается на основные негликозилированные белки вирусной частицы (р15, р24 и р12). Матричный МА белок р15, который соответствует Nffi-концевой последовательноети предшественника гена gag, является миристилированным и фосфорилированньгм полипептидом. МА белок связывается с геномной вирусной РНК, но также взаимодействует и с билипидным слоем вирусной мембраны. Структурно МА состоит из четырех главных спиралей, объединенных короткими петлями. Матричный белок может быть впоследствии протеалитически процессирован для объединения с тремя фрагментами; р10, пептид из 7 аминокиелот и р4. р10, который также миристилирован, образуетея в резулътате разделения МА.
р24 нейтралъный и умеренно гидрофобный белок является главным компонентом капсида СА вириона ВЛКРС. По-видимому, СА белок является основной мишенью для распознавания иммунной системой хозяина, характеризующегося высоким титром антител, обнаруживаемых в сыворотке инфицированных животных, а так же два определенных участка белка р24, который распознается специфическими Т-лимфоцитами.
Один из Т-клеточных эпитопов частично совпадает с высоко консервативным у ретровирусов доменом, главным гомологичным участком (major homology region, MHR), который необходим для вирусной инфекционности in vivo. Основываясь на использовании моноклональных антител против р24 ВЛКРС, был обнаружен общий с HTLV СА эпитоп. Такая кросс-реактивность между капсидными антигенами ВЛКРС и HTLV-1 позволяет предположить эволюционные взаимоотношения между этими двумя вируеами. Также иммунологическая кросс-реакция обнаружена между ВЛКРС и белком NC нуклеокапсида вируса лейкемии кошек (Feline leukaemia virus, FeLV).
Разные белки, кодируемые геном gag, возникают в результате протеолитического разделения предшественника Pr44gag. Это посттрансляционное созревание осуществляется вирусной протеазой р14, которая кодируется участком, расположенным между генами gag и рої. р14 синтезируется из предшественника Pv66gag prt в следствие супрессии сдвига рамки считывания. Этот предшественник локализуется на поверхности поляризованных клеток. Белок р24, состоящий из двух димеров, принадлежит к группе аспартил-протеиназ, и может быть ингибирован пепстатином. Несмотря на эволюционные взаимоотношения, ВЛКРС и HTLV протеиназы обладают отмеченной специфичностью в разделении распознавания сайтов.
Сверхэкспрессия полипротеина gag в клетках млекопитающих образует вирусоподобные частицы. Образование данных частиц зависит от PPPY мотива локализованного в МА, вовлеченном в gag миристилирование. Последовательность PPPY действует как поздний домен и играет роль в созревании вирусной частицы.
Гшро/. Генро/ транслируется с помощью механизма сдвига рамки считывания как предшественник массой 145 кДа. Рг145 содержит все трипсиновые пептиды gag-pol-предшественника и таким образом представляет собой продукт элонгации рг66 "ро/. Ген ро1 кодирует обратную транскриптазу массой 89кДа - РНК-зависимую ДНК-полимеразу, которая предпочтительно активна в присутствии ионов Mg2+. Этот фермент демонстрирует большее предпочтение к ионам Mg2+, чем Мп2+. Обратная транскриптаза ВЛКРС не чувствительна к трифосфатным аналогам нуклеотидов, которые могут быть ингибиторами обратной транскриптазы вируса иммунодефицита человека (humain immunodeficiency virus, HIV-1) и HTLV-1, и следовательно обладает более широкой специфичностью. Однако, обратная транскриптаза ВЛКРС более чувствительна к ингибиторам. Фермент ВЛКРС, синтезированный в бактериях активен как мономер, даже будучи связанным с ДНК субстратом. Удивительно, но сыворотка, взятая у некоторых животных, больных лейкозом, содержат антитела, ингибирующие действие обратной транскриптазы in vitro.
Синтез цепи ДНК с помощью обратной траскриптазы начинается с сайта присоединения праймера к РНК, расположенного на 2 пн ниже участка U5. Обратная транскриптаза ВЛКРС демонстрирует большую точность работы, чем обратная транскриптаза вируса некроза селезенки: всего 1,2 10-5 мутантных оснований (по сравнению с 4,8 10-6 для SNV) появляются за один раунд репликации. Обратная транскриптаза ВЛКРС проявляет большую точность в отношении ошибочных инсерций, чем подобный фермент HIV-1, но такую же степень точности при неверной элонгации.
Распределение частот BoLA-DRB3-renoTmiOB, ассоциированных с устойчивостью и восприимчивостью к лейкозу у изученных пород КРС
В ходе выполенения данной работы проведена оптимизация методики типирования полиморфизма гена BoLA-DRB3 КРС, заключающаяся во введении в протокол одноэтапной ПЦР вместо двухэтапной гнездовой, а также разработке новых праймеров для аллель-специфичной ПЦР, позволяющих, в сочетании с уже описанными в литературе, более точно детектировать большее число аллелей.
Были определены частоты BoLA-DRB3-ajmejie& и генотипов у шести пород КРС; калмыцкой, якутской, костромской, красно-пестрой, черно-пестрой и зебувидного скота. Проведен сравнительный анализ по данному признаку исследованных пород, а также монгольской и ярославской, изученных ранее в лаборатории.
Наиболее высокое аллельное разнообразие было отмечено у калмыцкого, ярославского и монгольского КРС (36, 35, 35 соответственно). Высокий уровень аллельного разнообразия гена BoLA-DRB3 у данных пород определил и высокий уровень разнообразия генотипов - 56, 72 и 56 генотипа соответственно. У костромского КРС также было обнаружено высокое число генотипов - 55. Предельно низкое число аллелей и генотипов характерно якутскому КРС (14 и 18 соотвественно). Максимальное значение индекса Шеннона (3,27), соответсвующее высокому разнообразию и равномерному распределению частот аллелей гена BoLA-DRB3, было получено для калмыцкого КРС. Минимальное (1,74), соответсвующее низкому разнообразию аллелей и неравномерному главных распределению их частот, - якутскому. Распределение выборок в пространстве компонент, построенное на основе стандартных генетических расстояний Нея, отражающих сходство и различие в характере распределения и спектре аллелей, а не филогенетические взаимоотношения между породами, показало своеобразие по этому параметру якутского, зебувидного и костромского КРС. У костромского, зебувидного и якутского КРС, как и у большинства мировых пород, обнаружен неравномерный характер распределения частот аллелей гена BoLA-DRB3. У монгольского, калмыцкого, ярославского, черно-пестрого КРС частоты аллелей распределены равномерно. Во всех исследованных породах наблюдается недостаток гетерозигот (-0,462 В -0,00052).
Проведен анализ распределения частот BoLA-DRB3-amsens& и генотипов, ассоциированных с устойчивостью и восприимчивостью к лейкозу у изученных пород КРС. У монгольского, калмыцкого, зебуъидного, костромского скота преобладают аллели и генотипы, ассоциированные с устойчивостью к лейкозу (14,8%, 24,2%, 23,7%, 28,0% и 22,4%, 37,5%, 46,8%, 47,4% соответственно). У ярославского и красно-пестрого скота преобладают аллели, ассоциированные с восприимчивостью к лейкозу (23,8% и 32,1% соответственно), а генотипы - асеоциированные с устойчивостью к данному заболеванию (28,2% и 49,1% соответственно), что позволяет поддерживать благоприятный фон по устойчивости к лейкозу в этих породах. У черно-пестрого КРС преобладают BoLA-DRB3-аллели и генотипы, аесоциированные с восприимчивостью к данному заболеванию (32,7% и 42,8% соответственно). У якутского КРС практически отсутствуют генотипы определяющие резистентность к лейкозу. Высокий уровень гетерозиготности в исследованных породах указывает на высокий уровень их общей устойчивости к лейкозу. Изучено распределение частот аллелей гена BoLA-DRB3, ассоциированных с резистентностью к маститу и другим заболеваниям, а также признакам молочной продуктивности. Все исследованные породы демонстрируют преобладание аллелей, ассоциированных с устойчивостью к маститу. Досточно хорошо в породах представлены аллели, ассоциированные с устойчивостью к клещевому заболеванию (Boophilus microplus), (максимальная частота, 20,4% - у монгольского КРС; минимальная частота 3,7% - у черно-пестрого КРС). Аллель 3, асеоциированный с низким риском отслоения плаценты, встречается у данных пород достаточно редко (максимальная частота 7 4% обнаружена у черно-пестрого КРС; у якутского и костромского КРС - отсутствовал). Максимальная частота (17,9%) аллелей, аесоциированных с устойчивостью к ЦИСТИТУ обнаружена у краено-пестрого КРС, минимальная (1,4%) - у монгольского КРС. У костромского КРС высока частота аллелей, ассоциированных с пониженным параметром SCC (суммарная частота 12,7%), и с повышением удоев и белковости молока (суммарная частота 21,2%). У зебувидного скота велик процент аллелей, определяющих слабую молочную продуктивность.
Таким образом, монгольская и калмыцкая породы, принадлежащие к единому турано-монгольскому корню происхождения, характеризуются равномерным распределением частот BoLA-DRB3-wjienQU и генотипов, а также повышенной устойчивостью к лейкозу, определяющейся высокими частотами аллелей и генотипов, ассоциированных с устойчивостью к этому заболеванию. Высокий уровень резисентности к лейкозу костромского КРС связан, в первую очередь, с повышенной частотой генотипов, определяющих устойчивость к этому заболеванию, а не аллелей «устойчивости» к лейкозу. У этой породы также велики частоты аллелей, ассоциированных с устойчивостью к маститу и признаками повышенной молочной продуктивности. Красно-пестрый и черно-пестрый скот продемонстрировали высокий уровень генетической устойчивости к маститу. В этих породах также часто встречаются аллели, асооциированные с признаками повышенной молочной продуктивности. У зебувидного скота велики частоты аллелей и генотипов, ассоциированных с устойчивостью к лейкозу. у ярославского КРС повышено разнообразие BoLA-DRB3-anneneu и генотипов что указывает на высокий уровень общей резиетеноности к патогенам. Вее вышесказанное указывает на выеокий генетический потенциал местных пород в отношении уетойчивости к заболеваниям. Особым своеобразием характеризуется якутская порода КРС, у которой снижено число аллелей и генотипов BoLA-DRB3, практичееки отеутствуют извеетные аллели, определяющие устойчивость к патогенам. Это может быть следетвием того что данной группе, сохранившейся в небольшом чиеле, свойственна инбредная депрессия, а обитает она в уеловиях ениженного количества возбудителей заболеваний.
Также в ходе выполнения данной работы на оенове анализа изменчивости вирусного гена рої охарактеризована изменчивость изолятов вируса в животноводческих хозяйствах на территории Росеии и Украины. Для анализа иепользованы фрагменты гена рої, еоответетвующие доменам обратной транскриптазы и интегразы, размером 494пн и 233пн, соответственно. Филогенетический анализ позволяет выявить на территории России и Украины нееколько разновидностей ВЛКРС, кластеризующихея е высокой бутстреп поддержкой. Предложена новая классификация разновидноетей ВЛКРС. При сравнении филограмм, поетроенных на основании изменчивости нуклеотидных поеледовательностей доменов интегразы и обратной транскриптазы, топологические конфликты не выявлены.
Полученные данные могут быть использованы в практическом сельском хозяйстве для озодоровления етад от лейкоза и других заболеваний, повышения генетического разнообразия, а, следовательно, и общей уетойчивости к патогенам данных пород.
