Содержание к диссертации
.ВВЕДЕНИЕ 3
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
2.1. БЕЛКИ, СОДЕРЖАЩИЕСЯ В МОЛОКЕ 7
2.1.1. Полиморфизм белков молока 8
2.1.2. Полиморфизм aSl- казеина 8
2.1.3. Полиморфизм aS2- казеина 9
2.1.4. Полиморфизм р-казеина 9
2.1.5. Полиморфизм каппа-казеина 9
2.1.5.1. Частота встречаемости аллельных вариантов гена каппа-казеина у крупного рогатого скота 14
2.2. ВЛИЯНИЕ ПОЛИМОРФИЗМА КАППА-КАЗЕИНА НА МОЛОЧНУЮ ПРОДУКТИВНОСТЬ И КАЧЕСТВО МОЛОКА 19
2.3. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА КАППА-КАЗЕИНА 2 9
2.4. ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ПОРОД КРУПНОГО РУГАТОГО СКОТА ПО ДНК-МАРКЕРАМ 35
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 41
3.1. Объекты исследований 41
3.2. Выделение ДНК 42
3.3. Определение концентрации ДНК 43
3.4. Проведение полимеразной цепной реакции 43
3.5. Проведение ПЦР для амплификации гена каппа-казеина 44
3.6. Типирование А- и -аллелей гена CSN3 с использованием рестрикционного анализа (метод ПЦР-ПДРФ) 45
3.7. Типирование А- и -аллелей гена CSN3 с помощью аллель-специфичной ПЦР 46
3.8. Проведение ISSR-анализа 47
3.9. Статистический анализ данных 47
4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 49
4.1. АЛЛЕЛЬНЫЙ ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНА КАППА-КАЗЕИНА (CSN3) У
РОССИЙСКИХ ПОРОД КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА 49
4.1.1.Типирование аллелей гена каппа-казеина у исследуемых животных 49
4.1.2. Оценка частот встречаемости А- и В-аллелей гена каппа-казеина
у исследуемых пород крупного рогатого скота 51
4.1.3. Обсуждение результатов 51
4.2. ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ПОРОД КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА И ЯКОВ С ПОМОЩЬЮ МОЛЕКУЛЯРНОГО МУЛЬТИЛОКУСНОГО АНАЛИЗА (ISSR- АНАЛИЗ) 55
4.2.1. Спектры ISSR-полиморфизма у исследуемых животных 55
4.2.2. Дифференциация пород крупного рогатого скота и яков по AG-ISSRH GA-ISSR- маркерам
4.2.2.1. Характеристика исследуемых популяций по числу и частотам встречаемости А G-ISSR-фрагментов 58
4.2.2.2. Характеристика исследуемых популяций по числу и частотам встречаемости GA-ISSR-фрагментов 67
4.2.2.3. Сравнительный анализ исследуемых выборок животных по AG- и GA-ISSR-маркерам (доля полиморфных фрагментов, коэффи циент внутригруппового сходства и уровень гетерозиготности) 71
4.2.3 Характеристика AG-ISSR- и GA-ISSR-маркеров и возможности их использования для дифференциации пород крупного рогатого скота 75
4.2.3.1. Дифференциация пород крупного рогатого скота на основе AG-ISSR-маркера 75
4.2.3.2. Дифференциация пород крупного рогатого скота на основе GA-lSSR-маркера 78
4.23.3. Дифференциация пород турано-монгольского корня с использованием AG-ISSR и GA-ISSR-маркеров 80
4.2.4. Дифференциация стад и линий ярославской породы по AG-ISSR и GA-ISSR-маркерам 86
4.2.5 Обсуждение результатов 98
5. ВЫВОДЫ 102
6. СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 104
7. ПРИЛОЖЕНИЕ 126
Введение к работе
Современная теория селекции животных основывается на детальном изучении генетических аспектов улучшения породных и продуктивных качеств молочных пород крупного рогатого скота (КРС). Интенсивная селекция КРС привела к созданию специализированных пород. При существующей системе разведения КРС большую опасность представляет снижение в породе, стадах, линиях, семействах генетического разнообразия, которое существенно влияет не только на продуктивность и воспроизводство, но и резко ограничивает приспосабливаемость к условиям содержания, жизнеспособность потомства.
Хотя в настоящее время селекция на создание высокопродуктивных молочных пород КРС была успешной, однако она привела к серьезным проблемам, связанным с резким преобладанием во всем мире одной породы - голштино-фризской. Результатом этого явилось значительное сокращение численности других пород, а, следовательно, и сокращение общего генетического разнообразия генофонда КРС. Например, Россия в первой половине XX века потеряла более 30 местных пород и отродий КРС. Из 66 пород КРС, разводившихся в 80-90 годах XX века в бывшем СССР, в 2001 году в Российской Федерации осталось 33 породы. Из 33-х оставшихся пород только 16 имеют достаточную численность для нормального воспроизводства (Алтухов и др., 2004). Обеднение генофонда КРС в будущем может привести к отрицательным непредсказуемым последствиям, поскольку невозможно предсказать возникновение новых требований к продуктивности и резистентности КРС к заболеваниям. Важно поддерживать максимально возможное разнообразие генофонда КРС. Необходимым условием для проведения таких работ является проведение генетического мониторинга пород КРС на молекулярном уровне.
За рубежом большое внимание уделяется проблемам изучения биоразнообразия КРС. Многие ведущие зарубежные институты разрабатывают долгосрочные проекты, посвященные генетическому мониторингу и, в частности, ДНК-мониторингу генофонда КРС (например, проект Roslin Institute (Edinburg) -"Genetic Diversity in Cattle"). С использованием молекулярных методов анализа исследуется генетическая структура пород КРС (MacHugh et al., 1998), их происхождение (Troy et al., 2001; Hanotte et al., 2002); создана международная программа и база данных по картированию генома Bos taurus (http://www.ri.bbsrc.ac.uk/bovmap/bovmap.htm). С молекулярно-генетической точки зрения, зарубежные породы лучше исследованы по сравнению с местными и аборигенными породами. В связи со всем вышесказанным становится очевидной необходимость сравнительных исследований генетического разнообразия российских и зарубежных пород КРС, в особенности, аборигенных пород.
В качестве тест-систем для изучения генетического разнообразия пород КРС на молекулярном уровне используют монолокусные и мультилокусные ДНК-маркеры. В качестве монолокусных ДНК-маркеров особый интерес представляют полиморфные варианты генов, участвующих в формировании хозяйственно-полезных признаков. К таким генам относится ген каппа-казеина (CSN3), аллельные варианты которого оказывают значительное влияние на физические и химические свойства молока (Schaar et al., 1984, 1985; Robitaille 1995), его пригодность для сыроделия (Zadworny & Kuchnlein, 1990). Интерес исследователей к изучению генетического полиморфизма этого гена связан также с тем, что различные аллельные варианты этого гена могут быть использованы в качестве генетических маркеров качества молока в селекционных программах разведения молочного скота.
Для оценки уровня полиморфизма генома в целом используются микросателлитные и мультилокусные ДНК-маркеры. Микросателлитные маркеры широко используются для исследования генетического полиморфизма различных видов, однако, стандартные тест-системы на основе определенного набора из 12-20 микросателлитных локусов разработаны только для пяти видов млекопитающих: человека, лошади, КРС, собаки и мыши (Applied Biosystems). При этом необходимо иметь в виду, что предлагаемые для КРС наборы могут оказаться неподходящими для мало изученных аборигенных пород, в особенности зебувидного происхождения, и для родственных видов (яков, зубров). Кроме того, следует указать на высокую стоимость оборудования и наборов для тестирования, что делает затруднительным использования данного подхода для популяционных исследований. В связи с этим большой интерес у исследователей вызывают мультилокусные тест-системы, такие как RAPD (Randomly amplified polymorphic DNA), AFLP (Amplified fragment length polymorphism) и ISSR (Inter-simple-sequence-repeats). Эти системы не дорогостоящи и, кроме того, могут быть использованы для исследования мало изученных видов, поскольку для их применения не нужно знания нуклеотидной последовательности ДНК исследуемого объекта.
В качестве тест-системы для изучения генетического разнообразия и дифференциации пород КРС нами был использован анализ межмикросателлитного полиморфизма - ISSR-анализ или, как его еще иногда называют, - ISSR-фингерпринтинг. Этот метод относится к методам молекулярного мультилокусного анализа. Он позволяет одновременно оценивать полиморфизм десятков локусов (до 30 локусов и выше). Данный подход широко применяется для дифференциации видов и сортов растений, однако, крайне мало используется в исследованиях генофондов сельскохозяйственных животных.
В генетико-селекционных исследованиях сельскохозяйственных животных большое значение имеет анализ популяции, изучение их гетерогенности, дифференциация и идентификация пород. Использование молекулярных маркеров значительно расширяет возможности генетического анализа популяций, позволяет установить меж- и внутри-породную вариабельность отдельных участков генома и составить представление о генетической структуре породы.
