Содержание к диссертации
Введение
1.В ведение 2
2. Обзор литературы 5
2.1.Структура, функции и полиморфизм главного комплекса гистосовместимости (гкг) 5
2.1.1.Главный комплекс гистосовместимости: история вопроса, функция, номенклатура 5
2.1.2. Структура главного комплекса гистосовместимости 8
2.1.3.Главный комплекс гистосовместимости крупного рогатого скота (BoLA) 11
2.1.4.Методы изучения главного комплекса гистосовместимости и полиморфизм генов класса II 16
2.2.Полиморфизм гена BoLA-DRB3 и его ассоциации с различными заболеваниями крупного рогатого скота 22
2.2.1 .Полиморфизм гена BoLA-DRBS 22
2.2.2. Ассоциации BoLA-DRBS с заболеваниями 25
2.3.Дифференциация пород крупного рогатого скота по ДНК-маркерам 32
3.Материалы и методы исследования 39
4.Результаты и их обсуждение 51
4.1. Дифференциация пород крупного рогатого скота по аллелям гена BoLA-DRBS 51
4.2.Распределение аллелей гена BoLA-DRBS, ассоциированных с болезнями, в исследованных породах крупного рогатого скота 59
4.3 .Дифференциация пород крупного рогатого скота с использованием молекулярного мультилокусного анализа 66
4.3.1. Спектры ISSR-полиморфизма у крупного рогатого скота 67
4.3.2.Дифференциация пород крупного рогатого скота по GA-ISSR-маркеру 71
4.3.3. Дифференциация пород крупного рогатого скота по AG-ISSR-маркеру 75
4.3.4.Характеристика (GA)9C-ISSR- и (AG)9C-ISSR-MapKepoB и возможности их использования для дифференциации пород крупного рогатого скота 78
5. Выводы 84
6. Список литературы 86
- Структура главного комплекса гистосовместимости
- Ассоциации BoLA-DRBS с заболеваниями
- Дифференциация пород крупного рогатого скота по аллелям гена BoLA-DRBS
- Спектры ISSR-полиморфизма у крупного рогатого скота
Введение к работе
Интенсивная селекция крупного рогатого скота привела к созданию специализированных пород. Хотя селекция на создание высокопродуктивных молочных пород крупного рогатого скота была успешной, однако она привела к серьезным проблемам, связанным с резким преобладанием во всем мире одной породы - голштино-фризской. Результатом этого явилось значительное сокращение численности других пород, а, следовательно, и сокращение общего генетического разнообразия генофонда крупного рогатого скота. Например, Россия в первой половине XX века потеряла более 30 местных пород и отродий крупного рогатого скота. Из 66 пород крупного рогатого скота, разводившихся в 80-90 годах XX века в бывшем СССР, в 2001 году в Российской Федерации осталось 33 породы. Из 33-х оставшихся пород только 16 имеют достаточную численность для нормального воспроизводства (Алтухов и др., 2004). Обеднение генофонда крупного рогатого скота в будущем может привести к отрицательным непредсказуемым последствиям, поскольку невозможно предсказать возникновение новых требований к продуктивности и резистентности крупного рогатого скота к заболеваниям. Важно поддерживать максимально возможное разнообразие генофонда крупного рогатого скота. Необходимым условием для проведения таких работ является проведение генетического мониторинга пород крупного рогатого скота на молекулярном уровне.
За рубежом большое внимание уделяется проблемам изучения биоразнообразия крупного рогатого скота. Многие ведущие зарубежные институты разрабатывают долгосрочные проекты, посвященные генетическому мониторингу и, в частности, ДНК-мониторингу генофонда крупного рогатого скота (например, проект Roslin Institute (Edinburg) - "Genetic Diversity in Cattle"). С использованием молекулярных методов анализа исследуется генетическая структура пород крупного рогатого скота (MacHugh et al., 1998), их происхождение (Troy et al., 2001; Hanotte et al., 2002); создана международная программа и база данных по картированию генома Bos taurus (http://www.ri.bbsrc.ac.uk/bovmap/bovmap.htm). Однако исследуются, в основном, европейские породы. Большая часть местных и аборигенных пород на молекулярно-генетическом уровне практически не исследована, что определило цель наших исследований, заключающуюся в изучении генетического разнообразия пород к.р.с. с использованием ДНК-технологий.
В качестве тест-систем для изучения генетического разнообразия и дифференциации пород крупного рогатого скота нами был использован анализ полиморфизма гена BoLA-DRB3 главного комплекса гистосовместимости, участвующего в формировании иммунного ответа организма на вирусные и бактериальные инфекции, и ISSR-фингерпринтинг, позволяющий оценивать уровень полиморфизма генома в целом. Высокий уровень полиморфизма гена BoLA-DRB3 (секвенировано более 90 аллелей) позволяет использовать его как высоко информативный маркер для изучения генетического разнообразия пород крупного рогатого скота. При этом генетическая дифференциация популяций (в том числе и пород сельскохозяйственных животных) по главному комплексу гистосовместимости актуальна не только для рассмотрения проблем сохранения видов и биоразнообразия, но и для рассмотрения проблем устойчивости к заболеваниям. В генетико-селекционных исследованиях сельскохозяйственных животных большое значение имеет анализ популяции, изучение их гетерогенности, дифференциация и идентификация пород. Использование молекулярных маркеров значительно расширяет возможности генетического анализа популяций, позволяет установить меж- и внутри-породную вариабельность отдельных участков генома и составить представление о генетической структуре породы. Одним из наиболее эффективных направлений исследований в этом плане является анализ межмикросателлитного полиморфизма - ISSR-анализ или, как его еще иногда называют, — ISSR-фингерпринтинг. Этот метод относится к методам молекулярного мультилокусного анализа, он позволяет одновременно оценивать полиморфизм десятков локусов (до 30 локусов и выше). Данный подход широко применяется для дифференциации видов и сортов растений, однако, крайне мало используется в исследованиях генофондов сельскохозяйственных животных.
Целью данного исследования было изучение генетического разнообразия пород крупного рогатого скота и их дифференциация на основе ДНК-полиморфизма гена BoLA-DRB3 и ISSR-анализа. Для достижения указанной цели были поставлены следующие нижеперечисленные задачи:
1. Провести сравнительный анализ аллельного разнообразия гена BoLA-DRB3 у четырех пород крупного рогатого скота: у ярославской, монгольской, немецкой черно-пестрой пород и у иранской породы Систани.
2. Оценить характер распределения аллелей гена BoLA-DRB3, ассоциированных с болезнями, в исследованных породах крупного рогатого скота.
3. Провести сравнительный анализ спектров ISSR-полиморфизма у исследованных пород с использованием двух типов праймеров: (GA)9C и (AG)9C.
4. Охарактеризовать генетическое разнообразие исследованных пород на основе ISSR-маркеров.
5. Изучить возможность использования (GA)9C-ISSR- и (AG)9C-ISSR-MapKepoB для дифференциации исследуемых пород.
Структура главного комплекса гистосовместимости
Наиболее детально главный комплекс гистосовместимости исследован у человека. Поэтому целесообразно рассмотреть структуру ГКГ на примере человека. Локусы системы HLA кодируют антигены, подразделяющиеся в зависимости от строения и функции на классы I, II и III.
К классу I относятся классические трансплантационные антигены HLA-A, -В и -С. Антигены класса I представлены на поверхности практически всех ядросодержащих клеток, за отдельными исключениями. Продукты полиморфных генов класса I представляют собой белковую а-цепь с молекулярным весом 45 Ш, которая ассоциируется с Ь2-микроглобулином (короткой не полиморфной цепью, кодируемой геном, локализованным на 15 хромосоме). Кроме перечисленных, в районе класса I отмечено много дополнительных генов, например, HLA-E, HLA-F и HLA-G, присутствуют также и псевдогены. Возможно присутствие дополнительных генов, которые экспрессируются в отдельных тканях или на определенных стадиях развития организма (Auffray, Strominger, 1986). Биологическая роль всех антигенов класса I еще не до конца изучена. Известно, что функция классических антигенов (HLA-A, -В, -С) состоит в представлении чужеродных антигенов (после внутриклеточного процессинга) на поверхности клеток, инфицированных вирусом, или опухолевых клеток цитотоксическим Т-клеткам, обеспечивая, таким образом, цитотоксическую реакцию против клеток, инфицированных внутриклеточными патогенами.
Участок генов класса III у человека в ГКГ обнаружен между генами класса I и II и кодирует компоненты комплемента С2 ,С4 и фактор В. Гены С2 и С4 полиморфны. В центральной части ГКГ отмечено присутствие генов, кодирующих белки теплового шока {HPS701 и HPS702), а также генов, определяющих факторы некроза опухолей (JNFa и TNFb) (Spies et al., 1986, Carrol et al., 1987). Продукты генов TNFa и TNFb принимают также участие в процессе регуляции генов ГКГ.
Гены класса II ГКГ иначе называют генами иммунного ответа. К классу II относятся DR, DQ, и DP районы, каждый из которых включает несколько генов, кодирующих тяжелые а-цепи (Л-гены) и легкие b-цепи (5-гены), образующие гетеродимер. Гетеродимер функционально связан с инвариантной цепью, обозначаемой Ii и кодирующейся за пределами ГКГ на другой хромосоме. Отмечены антигены класса II на поверхности В-лимфоцитов, макрофагов и активированных Т-клеток (Germain & Hendrix,1991).
Молекулы класса II - гликопротеины на поверхности антиген-представляющих клеток иммунной системы, функция которых состоит в том, чтобы представить чужеродные белки (после внутриклеточного процессинга) Т клеткам, которые затем стимулируют соответствующий иммунный ответ (гуморального типа). Чужеродные антигены после внутриклеточного процессинга связываются молекулами ГКГ класса II и представляются соответствующим популяциям Т-клеток, экспрессирующих маркер дифференцировки неполиморфный мембранный гликопротеин CD4, имеющий четыре внеклеточных домена (цит. по: Удина, 1994). Предполагают, что взаимодействие CD4 с молекулами ГКГ класса II осуществляется за счет неполиморфных участков последних. По-видимому, молекулы, кодируемые D-областью, многофункциональны: отмечены различия в функциях продуктов, определяемых различными субрегионами этой области. В D-районе отмечены пять участков DP, DQ, DR, DN и DO , содержащие по одному или более А и В генов. Исключение составляют DN (иногда обозначаемый как DZ) и DO, включающие по одному А и В гену, соответственно. Уровень транскрипции генов DNA и DOB приблизительно на порядок ниже, чем DQ и DR. Продукты этих генов не описаны и функция их неизвестна. В настоящее время полностью расшифрована и представлена в базах данных нуклеотидная последовательность ГКГ у человека (http:/ oinformatics.roslin.ac.uk; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Построена тонкая физическая карта этого локуса (The МНС sequencing consortium, 1999). ГКГ других животных устроен сходным образом. Так, в ГКГ мыши (Н2-комплекс) описаны гены иммунного ответа 1-А и 1-Е, аналогичные DQ и DR, соответственно, есть гомологи DRA и DRB, DOB, DPB, DQB, DQA и DNA генов (Sell, 1987, Rask et al., 1990). У мыши расстояние между генами и экзонами короче, чем у человека, соответственно, короче и весь участок, занимаемый ГКГ. Присутствие генов гомологов DP, DQ и DR показано в геноме свиньи, крысы и собаки, генов-гомологов DQ, DR, DOB и DNA - в геноме овцы и крупного рогатого скота (цит. по: Удина, 1994). В геноме лошади присутствуют гены, гомологичные DQ и DR (Rask et al., 1990). По-видимому, для всех высших позвоночных характерна консервативная первичная, вторичная и третичная структура продуктов генов класса I и II (Kroemer et al., 1990). Локусы класса I и II представляют собой семейства тесно сцепленных генов и выполняют аналогичные функции у животных разных видов.
Ассоциации BoLA-DRBS с заболеваниями
Очевидно, что функции антигенов ГКГ, связанные с обеспечением иммунного ответа на чужеродные антигены, могут обусловливать многочисленные ассоциации с конкретными заболеваниями (Stear et al., 1988ab; Crittenden, 1991; van Eijk et al., 1991). Отмечены ассоциации с инфекционными заболеваниями, например, с малярией, вызываемой Plasmodium falciparum (Hill et al., 1991, 1992), устойчивостью к паразитам (Stear et al., 1988bc, Sher et al., 1992). Среди заболеваний, ассоциирующихся с антигенами ГКГ, много аутоиммунных. В природных популяциях была показана важная роль антигенов ГКГ на этапах внутриутробного развития (Joosten et al., 1991), а также при взаимодействии с паразитами, которых можно рассматривать как основной фактор, поддерживающий разнообразие по маркерам ГКГ в отдельных популяциях, что также может приводить к избытку гетерозигот (Paterson et al., 1998). Установленные ассоциации генов ГКГ с заболеваниями у животных могут служить моделью для изучения болезней человека, например, у мышей отмечена форма диабета, сходная с таковой у человека (Todd et al., 1988). Большая часть выявленных ассоциаций была установлена с антигенами, кодируемыми генами ГКГ класса П.
В настоящее время интенсивно проводится изучение молекулярных механизмов, обусловливающих ассоциации различных заболеваний КРС и других домашних видов с маркерами ГКГ (Lunden et al., 1990, Park et al., 1991, Williams et al., 1991, Horin et al., 1998, Lewin et al., 1999, Haghparast et al., 2000, Garcia-Briones et al., 2000, Maillard et al., 2002). Изучают также ассоциации маркеров ГКГ с устойчивостью к паразитам (Stear et al., 1988с, Lunney et al., 1991). Отмечены ассоциации с маркерами BoLA таких признаков, как плодовитость (Joosten et al., 1991, Ostergard et al., 1989, 1991), аналогичные ассоциации с маркерами ГКГ установлены и для других видов (Lunden et al., 1991). У крупного рогатого скота ассоциации маркеров BoLA-системы наиболее детально исследовались для двух наиболее распространенных заболеваний: мастита и лейкоза.
Лейкоз крупного рогатого скота является заболеванием опухолевой природы, вызываемым вирусом лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) (Burny et al., 1980, 1988). ВЛКРС является онкогенным ретровирусом, вызывающим В-клеточный лимфоцитоз, лейкемию и лимфосаркому у овец и крупного рогатого скота. ВЛКРС имеет 50%-ное сходство с вирусом Т-клеточной лейкемии человека типа I и II (Sagata et al., 1985). В-клетки являются первичными мишенями для ВЛКРС-инфекции (Esteban et al.,1985). Это заболевание наносит огромный экономический вред сельскому хозяйству по всему миру. Например, в США для отдельных пород КРС инфицированность животных вирусом лейкоза КРС (ВЛКРС) составляла до 50% (Lorenz et al., 1987). Для российских пород КРС также показан высокий процент этой инфекции. У 30% инфицированных животных развивается персистентный лимфоцитоз (ПЛ), который является субклинической стадией заболевания лейкозом (Ferrer et al., 1978). Однако животные, инфицированные ВЛКРС, редко заболевают клинической стадией ВЛКРС-инфекции лимфосаркомой. Заболевание характеризуется поликлональной экспансией В-клеток, инфицированных ВЛКРС, которая приводит к изменению соотношения Т-и В- клеток и к увеличению абсолютного количества В-клеток в периферической крови (Lewin, 1988ab).
Была выявлена ассоциация между серологически определяемыми антигенами класса I главного комплекса гистосовместимости (ГКГ) BoLA-A и устойчивостью и чувствительностью к В-клеточному лимфоцитозу у шортгорнской, голштинской и других пород крупного рогатого скота (Lewin et al., 1986, 1988, Stear et al., 1988, Hines et al., 1991). Однако эти обычно слабые ассоциации отмечены для разного спектра антигенов BoLA-A в разных породах (Lewin et al., 1989). Наблюдаемые ассоциации в значительной степени обусловлены аллелями генов класса II ГКГ, входящими в протяженные гаплотипы с аллелями BoLA-A.
Развитие персистентного лимфоцитоза находится под генетическим контролем хозяина. Показано, что аллели BoLA-DRB3 влияют на субклиническое развитие инфекции ВЛКРС (Lewin et al., 1999). Была установлена роль аллелей гена BoLA-DRB3, ассоциирующихся с устойчивостью (DRB3.2 !!, 23, 28) и чувствительностью к лейкозу (JDRB3.2 8, 16, 22, 24) у голштинсокого скота (Хи, et al., 1993). Этот же спектр аллелей был подтвержден у черно-пестрого скота российской селекции (Сулимова и др., 1995). Позднее было показано, что с чувствительностью к лейкозу ассоциирован также аллель DRB3.2 3, а аллель BoLA-DRB3.2 7 с делецией ко дона 65, приводящей к измененной конформации молекулы антигена, ассоциирован с устойчивостью к этому заболеванию (Удина и др., 2003). Устойчивость к персистентному лимфоцитозу была доминантной, а чувствительность наследовалась как сложный рецессивный признак (Xu, et al., 1993; Удина и др., 2003). Проведен сравнительный анализ распределения частот BoLA-DRB3-аллелей в трех выборках коров черно-пестрой и айрширской пород российской селекции: больных персистентным лимфоцитозом, вирусоносителей и здоровых животных (табл. 2) и показан аналогичный описанному ранее спектру аллелей чувствительности и устойчивости к лейкозу (Сулимова и др., 1995; Удина и др., 2003). Тем самым, доказан универсальный характер ассоциации конкретных аллелей гена BoLA-DRB3 с устойчивостью и восприимчивостью к лейкозу.
Дифференциация пород крупного рогатого скота по аллелям гена BoLA-DRBS
Для дифференциации пород крупного рогатого скота использовали в качестве маркерной системы аллельный полиморфизм гена. Этот ген является одним из наиболее полиморфных генов у млекопитающих (см. раздел «Обзор литературы»), что позволяет рассматривать его как информативную маркерную систему для дифференциации видов и популяций.
В данной работе аллельный полиморфизм гена BoLA-DRB3, который в основном определяется вариабельностью экзона 2, использовали для анализа генетического разнообразия и дифференциации пород крупного рогатого скота. Характер распределения аллелей гена изучали в ярославской (п = 120), монгольской (п = 53), немецкой черно-пестрой (п = 32) и иранской Систани (п=65) породах крупного рогатого скота. Тестирование аллелей осуществляли методом ПЦР-ПДРФ с использованием эндонуклеаз Rsal, НаеШ и Xholl) с последующим разделением фрагментов в 6-9%-ном полиакриламидном геле (van Eijk et al., 1992; Xu et al., 1993). Типичные картины электрофоретического разделения продуктов рестрикции представлены на рис. 4 и 5. На основе полученных ДНК-паттернов определяли аллели гена в соответствии с номенклатурой BoLA-DRB3 аллелей, представленной на сайте http://www.projects.roslin.ac.uk/bola/drb3pcr.html и в табл. 6 и 7 раздела «Материалы и методы». Исследованные породы различались как по спектру аллелей гена BoLA-DRB3, так и по распределению их частот. Наиболее высокое разнобразие спектра аллелей гена BoLA-DRB3 (35 аллелей) было показано для ярославской породы. У монгольской породы выявлено 17 аллелей, у черно-пестрой породы - 29 и у иранской породы Систани - 33 аллеля (Табл. 8).
Для ярославского скота отмечен неоднородный профиль частот аллелей: на долю пяти (DRB3.2 12, 13, 15, 24 и 28) из 35 выявленных аллелей приходится 51.56%. Распределение аллелей гена BoLA-DRB3, сходное с ярославской породой, отмечено у аргентинского креольского скота, где на долю пяти аллелей приходится 68% от всего разнообразия (BoLA-DRB3.2 15, 18, 20, 24 и 27) (Giovambattista et al., 1996). Наиболее широко представлены аллели DRB3.2 24 и 28 (14.68% и 14,37% соответственно). Более наглядно распределение аллелей представлено на рис. 6.
В черно-пестрой породе наиболее распространены аллели BoLA-DRB3.2 l 1, 12, 13, 15, 1б, 24 и 51, частота которых составила 6.33%, 6.33%, 7.59%, 5.06%, 8.86%, 8.86% и 6.33% соответственно. На долю семи из 29 выявленных аллелей приходится 49.37%. Характер распределения частот аллелей более равномерный. Частота наиболее широко встречающихся аллелей не превышает 9% (рис.6 и табл.8). Для монгольской породы отмечен обедненный спектр разнообразия аллелей (всего 17 аллелей), но при этом для этой породы характерен относительно равномерный профиль распределения частот аллелей (рис.6). С частотой выше 5% в этой породе представлены аллели BoLA-DRB3.2 7, 10, 20, 26, 28, 29, 43, 4б, и 49 с частотами 10.96%, 13.70%, 9.59%, 5.48%, 10.96%, 9.59%, 5.48%, 6.85% и 6.85%) соответственно (сумма: 72.61%). Наиболее часто встречается аллель BoLA-DRB3.2 7 ( 11%). Широко представленные в монгольской породе аллели (BoLA-DRB3.2 7, 10, 20, и 29) относятся к редким аллелям или не отмечены в черно-пестрой и ярославской породах (табл.8). Напротив, самый распространенный у ярославской породы аллель DRB3.2 24, у монгольской породы относится к редким аллелям (частота - 0,013). Остальные аллели выявлены с частотами ниже 5%
Спектры ISSR-полиморфизма у крупного рогатого скота
Для оценки межпородного и внутрипородного генетического разнообразия пород крупного рогатого скота и их дифференциации нами был использован анализ межмикросателлитного полиморфизма - ISSR-анализ или, как его еще иногда называют, -ISSR-фингерпринтинг. Этот метод относится к методам молекулярного мультилокусного анализа, он позволяет одновременно оценивать полиморфизм десятков локусов (до 30 локусов и выше) и безусловно более информативен для оценки уровня генетического разнообразия генофондов, чем локус-специфические маркеры. К сожалению, как уже указывалось в разделе «Обзор литературы», ISSR-маркеры относятся к мало изученным маркерам, особенно у сельскохозяйственных животных и, в частности, у крупного рогатого скота. Поэтому целью нашей работы стало не только изучение генетического разнообразия исследуемых пород крупного рогатого скота по ISSR-маркерам, но и сравнительный анализ информативности двух типов ISSR-маркеров, использованных в работе: GA-ISSR-маркер, полученный на основе амплификации ДНК с праймером (GA)9C, и AG- ISSR-маркер, полученный на основе амплификации ДНК с маркером (AG)9C. В силу того, что ISSR-маркеры согласно опубликованным ранее работам (см. «Обзор литературы») обладают высокой разрешающей способностью мы рассматривали отдельно две выборки ярославского скота, полученные из двух разных хозяйств «Михайловское» (Ярі) и Горшиха (Яр2). Мы полагали, что сравнительный анализ двух выборок одной породы позволит оценить дифференцирующую способность используемых маркеров.
У всех исследованных пород спектры ампликонов, полученных с разными праймерами, резко отличались друг от друга (рис.9-12). Использование праймера (AG)9C позволяло получать более широкий спектр ампликонов по сравнению с праймером (GA)9C.
Спектры ампликонов у разных пород, полученных с использованием одного и того же праимера во многом имели сходный характер, что позволило провести сравнительный анализ разнообразия спектра полученных ампликонов и частот встречаемости отдельных фрагментов (локусов).
По среднему числу фрагментов на особь для GA-ISSR-маркера черно-пестрая и ярославская породы не отличаются друг от друга. Достоверные различия (0,0 Р 0,02) по этому параметру были выявлены между азиатскими (монгольская и иранская) и европейскими (черно-пестрая и ярославская) породами. При этом монгольская и иранская породы не отличались друг от друга по среднему числу фрагментов на особь. Для AG-ISSR-маркера никакой закономерности в достоверности различий по среднему числу фрагментов на особь не было выявлено - уровень достоверности широко варьировал вне зависимости от происхождения пород.
Высокие значения коэффициента внутригруппового сходства (табл.9) указывают на низкий уровень GA-ISSR-полиморфизма («обедненность» генофондов) у всех исследованных пород, что, по-видимому, связано с высоким давлением искусственного отбора. По уровню внутригруппового сходства достоверно отличается от всех остальных пород только монгольский скот. О низком уровне генетического полиморфизма свидетельствуют и низкие значения гетерозиготности (табл. 9). Даже у монгольского скота гетерозиготность локусам, тестируемым GA-ISSR-маркером составляет менее 50%.
По локусам, тестируемым AG-ISSR-маркером, уровень гетерозиготности существенно выше, чем по GA-ISSR-маркеру, и у монгольского скота приближается к значениям, характерным для природных популяций (таб. 9). Значения коэффициентов группового сходства по этому маркеру также существенно ниже, чем аналогичные коэффициенты по маркеру GA-ISSR.
