Содержание к диссертации
Введение
I. Аналитический обзор литературы 10
1.1. Развитие молекулярно-генетических методов исследования видов Pinus L 10
1.2. Основные направления исследований растений рода Pinus L. с применением молекулярно-генетических маркеров 13
1.3. Исследования в популяционной биологии сосны обыкновенной {Pinus sylvestris L.) на территории СНГ .25
II. Материалы, методы и объекты исследований 32
2.1. Объекты исследований 32
2.2. Сбор и хранение образцов для анализа 34
2.3. Выделение геномной ДНК растений для ПЦР анализа 34
2.4. Полимеразная цепная реакция .36
2.5. Электрофорез продуктов амплификации 37
2.6. Визуализация и математическая обработка данных ПЦР-анализа 37
2.7. Объем исследований 38
III. Результаты и обсуждение исследований 39
3.1. Оптимизация методики IS SR-анализа для оценки генетического полиморфизма сосны обыкновенной 39
3.1.1. Выбор оптимального метода разрушения клеточных структур 39
3.1.2 Подбор ISSR-праймеров для анализа генетического полиморфизма сосны обыкновенной 46
3.1.3 Разработка программного модуля Bioimage Geles PCR Analysis v.1.0 52
3.4 ISSR-анализ выборок сосны обыкновенной различных селекционных категорий 57
3.5. ISSR-анализ плюсовых деревьев сосны обыкновенной из различных географических районов 65
Выводы 74
Заключение 76
Список литературы 77
Список сокращений и условных обозначений 95
Приложения 96
- Основные направления исследований растений рода Pinus L. с применением молекулярно-генетических маркеров
- Выбор оптимального метода разрушения клеточных структур
- Разработка программного модуля Bioimage Geles PCR Analysis v.1.0
- ISSR-анализ плюсовых деревьев сосны обыкновенной из различных географических районов
Введение к работе
Актуальность темы. Генетические ресурсы основных лесообразующих пород к настоящему времени на территории бывшего СССР исследованы достаточно детально (Крутовский и др., 1989; Гончаренко, 2001; Падутов, 2001; Потенко, 2004; Политов, 2007 и др.). Однако изучению генетических ресурсов искусственных насаждений посвящено гораздо меньше исследований (Шигапов и др., 1996; Авров, 2001; Коршиков и др., 2010). К тому же основная часть этих работ выполнена с применением в качестве маркеров изоферментов, имеющих ряд методологических и методических ограничений (Сулимова, 2004). Современные генетические маркеры и методы в популяционно-генетических исследованиях древесных растений в России (по сравнению с зарубежными странами) применяются крайне редко (Семериков, 2007; Боронникова, 2009; Bushbom et al, 2011).
Сосна обыкновенная (Pinus sylvestris L.) - один из наиболее широко распространенных экономически важных лесообразующих видов России, играющий исключительно важную роль в формировании структуры и функций лесных экосистем (Тараканов, 2003). В европейской части России более 65 % работ по созданию объектов единого генетико-селекционного комплекса (ЕГСК) приходится на сосну обыкновенную (Прохорова и др., 2008; Ефимов, 2010). Традиционными в лесной генетике и селекции являются пути, основанные на изучении географических культур и использовании плюсовой селекции (Видякин, 2008). Однако они не учитывают исторически сложившуюся генетическую структуру природных популяций древесных видов и необходимость сохранения и воспроизводства генетических ресурсов в условиях ex situ (Политов, 2007). По этой причине генетические исследования объектов ЕГСК, основанные на применении современных эффективных методов генетического анализа и сравнении полученных оценок с генофондом природных популяций, представляются актуальными. Они позволят оценить эффективность селекционных и лесовосстановительных мероприятий, организовать мониторинг динамики генофондов.
ISSR-анализ генетического полиморфизма, основанный на ПЦР, включает амплификацию фрагментов ДНК, находящихся между двумя близко расположенными микросателлитными последовательностями (Zietkiewicz et al., 1994). Данный сравнительно простой и воспроизводимый метод имеет ряд преимуществ: позволяет анализировать одновременно до 150 локусов в геноме (Reddy et al., 2002) и по уровню выявляемого полиморфизма не уступает RFLP-маркерам (Nagaoka, Ogihara, 1997). Он находит широкое применение в областях генетики, связанных с изучением биоразнообразия, картированием геномов, определением генетического сходства особей и сортов, мониторингом генетического разнообразия при различных манипуляциях и т.д. (Reddy et al., 2002; Rakoczy-Trojanowska, 2004). ISSR-анализ, использованный для изучения геномов широкого круга растений, в том числе, древесных (Боронникова и др., 2009), для сосны обыкновенной ранее практически не использовался. Одна из основных причин этому - трудности при выделении ДНК из древесины и хвои -тканей, богатых у данного вида вторичными метаболитами, инактивирующими нуклеиновые кислоты (Ganopoulos et al, 2013).
На основании вышесказанного были сформулированы цели и задачи настоящего исследования.
Цель исследования - разработка молекулярных ISSR-PCR маркеров и анализ генетического полиморфизма сосны обыкновенной на объектах единого генетико-селекционного комплекса.
Задачи исследования:
-
Оптимизировать методику ISSR-анализа ДНК сосны обыкновенной из хвои и древесины для оценки ее внутривидового генетического полиморфизма.
-
Провести анализ генетической изменчивости деревьев сосны обыкновенной различных селекционных категорий.
-
Провести сравнительный анализ генетического разнообразия плюсовых деревьев сосны обыкновенной из разных географических районов.
Научная новизна работы. Разработана методика ISSR-PCR анализа для оценки генетического полиморфизма сосны обыкновенной. Показана информативность в этих целях 6-ти полиморфных IS SR-прайм еров, ранее
использованных для генетического анализа растений других таксонов. Получены оценки генетического разнообразия плюсового насаждения сосны обыкновенной в Республике Марий Эл и различий в полиморфизме ДНК деревьев разных селекционных категорий. Впервые проанализирован уровень генетического разнообразия и степень генетической дифференциации групп плюсовых деревьев сосны обыкновенной из Республики Марий Эл, Чувашской Республики, Пензенской и Кировской областей.
Научно-практическая значимость работы. Создан программный модуль для анализа и обработки изображений фрагментов ДНК на электрофореграммах, получено свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ Biolmage Geles PCR Analysis v. 1.0. Разработанная методика анализа генетического полиморфизма сосны обыкновенной по ISSR-маркерам может быть рекомендована к использованию для оценки генофонда популяций данного вида, при разработке лесосеменного районирования на генетической основе, для мониторинга эффективности селекционных и лесовосстановительных мероприятий, при проведении экспертиз по идентификации растений сосны в криминалистических лабораториях. Данные о генетической изменчивости плюсового насаждения в Республике Марий Эл и плюсовых деревьев сосны обыкновенной с идентифицированными генотипами из Республики Марий Эл, Чувашской Республики, Пензенской и Кировской областей могут быть использованы при разработке научно-обоснованных программ создания и эксплуатации объектов ЕГСК в Среднем Поволжье. Материалы диссертационной работы могут быть использованы при проведении учебных занятий по направлению «Лесное дело» в вузах, а также на курсах повышения квалификации работников лесного хозяйства.
Апробация работы. Основные результаты исследований докладывались и обсуждались на Международной научной студенческой конференции по естественным и техническим дисциплинам «Научному прогрессу - творчество молодых» (г. Йошкар-Ола, 2007-2011), Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения М.Д. Данилова «Современные проблемы теории и практики лесного хозяйства» (Йошкар-Ола,
2008), Международной научной конференции «Плодоводство, семеноводство, интродукция древесных растений» (Красноярск, 2009, 2011), III Российском форуме «Российским инновациям - российский капитал», (Ижевск, 2010), Всероссийском молодежном образовательном форуме «Селигер - 2010» (Селигер, 2010), Молодежном инновационном форуме Приволжского федерального округа (Ульяновск, 2010), Международной конференции с элементами научной школы для молодёжи «Лесные экосистемы в условиях изменения климата: биологическая продуктивность, мониторинг иадаптационные технологии» (Йошкар-Ола, 2010), III Всероссийской научно-практической конференции «Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира» (Волгоград, 2010), Постоянно действующей Всероссийской междисциплинарной научной конференции с международным участием «Вавиловские чтения» (Йошкар-Ола, 2010, 2011), VI Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2011), 3-м международном совещании «Сохранение лесных генетических ресурсов Сибири» (Красноярск, 2011), Всероссийской научно-практической конференции «Лесовосстановление в Поволжье: состояние и пути совершенствования» (Йошкар-Ола, 2013).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 18 печатных работ, в т.ч. 3 - в рецензируемых журналах из перечня ВАК. Получено свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ.
Личный вклад заключается во включенном участии автора на всех этапах выполнения диссертационной работы, в т.ч. при постановке цели и задач, анализе литературных данных, разработке программы и методики исследований, первичном сборе экспериментального материала, выполнении лабораторных исследований, написании и оформлении диссертации, апробации полученных данных на научных форумах различного уровня. Подготовка публикаций и программы для ЭВМ выполнена лично или при активном участии автора.
Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена при финансовой поддержке Минобрнауки России в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы по направлению 1.3.2 «Проведение научных исследований целевыми
аспирантами» (ГК № 14.740.11.0458 от 01.10.2010 г. «Оценка генетического полиморфизма деревьев хвойных видов, отличающихся по селекционным категориям и географическому происхождению, на основе использования молекулярных маркеров»; Соглашение № 14.132.21.1767 от 15.10.2012 г. «Проведение исследований по оценке возможности использования ISSR-маркеров для генетической идентификации, паспортизации и сертификации растительного сырья»), а также Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере в рамках личного гранта по программе УМНИК (2009 г.) «Метод ДНК-маркеров для выявления фактов несанкционированных заготовок древесины».
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста, содержит 14 таблиц и 26 рисунков. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, который включает 149 источников.
Основные направления исследований растений рода Pinus L. с применением молекулярно-генетических маркеров
Молекулярно-генетические маркеры являются на сегодняшний день основным инструментом изучения генетического полиморфизма растений. В последние годы проведено большое количество исследований сосен на территории Китая. Так, изучение популяций P. squamata на северо-востоке провинции Юньнань с использованием RAPD- и ISSR-маркеров, показали очень низкую генетическую изменчивость. Основные параметры генетического полиморфизма, выявленные с использованием RAPD-анализа (индекс Шеннона (I) - 0,030; среднее эффективное число аллелей на локус (Ne) - 1,032; доля полиморфных локусов (Р) - 6,45; ожидаемая гетерозиготность (HJ - 0,019) на уровне вида коррелировали с результатами ISSR-анализа, но оказались несколько ниже: 1= 0,048; Ne = 1,042; Р = 12,3, Не = 0,029. Генетическая изменчивость субпопуляций на юго-западном склоне была намного выше, чем у субпопуляции на северо-восточном склоне, что можно объяснить более разнообразными условиями среды на юго-западном склоне. Генетическая дифференциация между двумя субпопуляциями была очень низкой (GST (RAPD) = 0,011, GST (ISSR) = 0,024). Низкое генетическое разнообразие исследователи связали с долгой изолированной эволюцией популяции и с деятельностью человека (Zhang et al., 2005).
ISSR-маркеры были использованы для генетического анализа девяти субпопуляций P. sylvestris. Было получено 108 локусов с использованием 10 праймеров. Процент полиморфных полос среди различных субпопуляций варьировал от 27% до 54%. Информационный индекс Шеннона (I) на видовом уровне составил 0,158; генетическое разнообразие по Нею (Н) -0,239. Большая часть генетической изменчивости (60,35%) была обнаружена в пределах субпопуляций (Li et al., 2005).
Генетическая близость 12 видов сосны секции Strobus изучена с применением ISSR-маркеров. Двенадцать ISSR-праймеров позволили идентифицировать 117 локусов, при этом процент полиморфных полос варьировал от 5,93% до 19,92%. Общее генетическое разнообразие (Н) составило 26,21%, из которых на внутривидовое генетическое разнообразие (Hs) пришлось 7,66%, а на межвидовое (DST) - 18,55%. Межвидовое разнообразие составило 70,78% от общего генетического разнообразия. Изучаемые виды разделились на две группы. В первую группу вошли Р griffithii, P. armandi, P. fenzeliana, P. kwangtungensis, P. strobus, P. monticola и P. wangii. Во вторую группу вошли P. albicaulis, P. pumila, P. flexilis, P. sibirica и P. koraiensis (Liu et al., 2005).
Эндемичный и наиболее широко распространенный вид сосны в северном Китае - P. tabulaeformis Carr. - изучался RAPD-методом. Исследования показали, что популяции P. tabulaeformis характеризовались относительно высоким уровнем генетического разнообразия (Я = 0,323). Разнообразие было сосредоточено в основном в пределах популяции (79,2%). Популяции с гор Lingkong и Willing имели более высокий уровень разнообразия (0,269), чем другие исследованные популяции (0,254). Статистически значимой связи между генетическим разнообразием и климатическими факторами обнаружено не было (Wang & Gao et al., 2009).
Исследования пяти популяций P. tabulaeformis Carr. в провинции Шаньси с использованием 15 RAPD- и 5 ISSR-праймеров у 140 деревьев показали сходные результаты. Генетическое разнообразие Нея составило соответственно 0,284 и 0,308, индексы Шеннона - 0,433 и 0,447. Генетическое разнообразие на видовом уровне было выше по сравнению с другими представителями рода Pinus L. Относительная величина дифференциации между популяциями (GST) составила 0,149 и 0,136. Это показывает, что большая часть генетической вариации сосредоточена внутри популяций (Li et al., 2008).
Тринадцать природных популяций со всего ареала P. tabulaeformis Carr. изучены с применением микросателлитных маркеров. Большая часть генетической изменчивости китайской сосны сосредоточена внутри популяций, при этом генетическая дифференциация между популяциями достоверна. Генетическое разнообразие имеет тенденцию к снижению от центральных к периферийным и маргинальным популяциям. Кластерный анализ, основанный на генетических расстояниях Нея, позволил получить разделение на четыре субпопуляции, которое обусловлено историческими факторами, сыгравшими ключевую роль в формировании пространственной и генетической структур вида (Wang et al., 2010).
Генетическое разнообразие и генетическая дифференциация четырех популяций P. koraiensis на северо-востоке Китая и в Приморском крае России были проанализированы с использованием ISSR-маркеров. Исследования с использованием 15 праймеров показали, что полиморфны 60,7% фрагментов ДНК. Уровень генетического разнообразия P. koraiensis у центральных популяций выше, чем у периферийных. Но не обнаружено положительной корреляции между генетическими и географическими расстояниями для изучаемых популяций (Feng et al., 2006). При исследовании горных популяций P. koraiensis на основе AFLP-анализа 78 особей получено 13 полиморфных локусов, на основе которых разработаны микросателлитные праймеры для анализа генетического полиморфизма. Эти маркеры могут быть использованы для генетических исследований этого вида, а также при разработке эффективных программ сохранения P. koraiensis (Yu et al., 2012).
Исследования популяций P. massoniana в Китае и Тайване показали, что генетическое разнообразие островных популяций ниже, чем материковых (Geetal.,2012).
С применением аллозимов исследованы уровень и структура генетического разнообразия девяти популяций P. densata Master в провинции Юньнань. Отмечено, что по сравнению с другими видами голосеменных P. densata имеет более высокие средние значения параметров генетического разнообразия. Аллозимный полиморфизм составил 97,0% и 71,4% на видовом и популяционном уровнях соответственно. Среднее число аллелей на локус - 3,1 на видовом и 2,0 на популяционном уровне. Средняя ожидаемая гетерозиготность P. densata значительно выше чем средние значения для других исследованных таксонов голосеменных растений как на популяционном, так и на видовом уровнях. Из общей генетической изменчивости менее 12% распределяется между популяциями. Наблюдаемое высокое разнообразие P. densata исследователи объясняют гибридным происхождением вида от двух генетически различных видов - P. yunnanensis и P. tabulaeformis (Yu et al., 2000).
С применением аллозимного, RAPD- и ISSR-анализов исследованы популяции Р. рит йа на участках склонов гор Aino-dake (Япония). Результаты показали, что менее одной трети изученных растений размножаются вегетативно. Исследователи пришли к выводу, что изученные популяции Р. pumila имеют генетическую структуру, которая в значительной степени обусловлена вегетативным размножением и распространением семян птицами (Tani et al., 1998).
Популяции сосен, имеющие европейский ареал, также исследовались с использованием молекулярно-генетических маркеров. Исследования сосны обыкновенной в Финляндии показали, что молекулярные маркеры не ассоциированы с датами начала цветения популяций из разных географических широт. Из всех рассмотренных видов маркеров (изоферменты, RFLP, RAPD и SSR) микросателлиты отличаются наивысшим уровнем полиморфизма (Н = 0,77). Все молекулярные маркеры характеризуются высоким уровнем изменчивости, в то время как между популяциями дифференциация низкая (Gsr 0,02) (Karhu et al., 1996).
Популяции P. sylvestris L. на Апеннинах (Италия), принадлежащие к западной границе ареала вида, проанализированы с использованием микросателлитных маркеров. Изучалась ядерная и хлоропластная ДНК, результаты сравнивались с показателями альпийских популяций, которые относят к основному ареалу вида. Исследования показали, что фрагментированные апеннинские популяции поддерживают высокий уровень генетического разнообразия. Выявлена значительная межпопуляционная дифференциация с использованием ядерных SSR-маркеров (FST = 0,08) и хлоропластных SSR-маркеров (р = 0,14). Анализ молекулярной дисперсии позволил установить важность опыления как фактора гомогенизации генетической изменчивости в географическом масштабе (Scalfi et al., 1998).
Выбор оптимального метода разрушения клеточных структур
Первый этап выделения ДНК из живых организмов связан с разрушением клеточных структур. Лизис цитоплазматической (а также ядерной) мембраны проводят с применением поверхностно-активных веществ в экстрагирующем буфере (Maniatis, 1989). Кроме того, используется дополнительное механическое воздействие путем растирания ткани в специальных гомогенизаторах или вручную с помощью пестика (Murray, 1980). Хорошие результаты дает растирание ткани в жидком азоте. Бактериальные клетки можно разрушать с помощью лизоцима или растворов щелочей (Lee, 1990). Однако следует отметить, что при выборе разрушающего агента и метода разрушения клеточных структур важно учитывать возможность повреждения молекул ДНК самими агентами или условиями выделения. Молодые и неспециализированные ткани зачастую имеют тонкие клеточные оболочки, поэтому большинство исследователей предпочитают работать с такими типами тканей. Хвоя, а особенно древесина сосны обыкновенной считаются сложными объектами для получения пригодных для ПЦР препаратов ДНК, так как ткани данного вида богаты вторичными метаболитами, инактивирующими нуклеиновые кислоты (Ganopoulos et al., 2013).
Для выбора оптимального метода разрушения клеточных структур было выбрано 3 разных варианта: с использованием жидкого азота, простым механическим растиранием и с использованием гомогенизатора.
Разрушение клеточных структур с использованием жидкого азота.
Навеску опила древесины сосны или хвои охлаждали жидким азотом и тщательно растирали в фарфоровой ступке пестиком (рис. 3.1).
В соответствии с рисунком 3.2, качество препаратов ДНК, полученных из древесины, значительно хуже, чем из хвои. В обоих случаях наблюдается высокая степень деградации, но в случае с древесиной практически не наблюдается ДНК. При использовании в качестве исходного материала хвои наблюдалось большее количество ДНК.
С целью проверки достаточности количества ДНК для проведения ПНР проводили пробную реакцию амплификации (рис. 3.3)
Результаты пробных реакций амплификации подтвердили данные предыдущего опыта (рис. 3.3). На электрофореграмме видно, что полимеразная цепная реакция не прошла с препаратами, полученными из древесины, лишь в некоторых случаях видны следы ПЦР. Четко детектируемых ампликонов практически не наблюдалось. В то же время в случае использования хвои на электрофореграмме присутствуют как мономорфные, так и полиморфные фрагменты ДНК. В среднем на 1 анализируемый образец в данном случае приходилось 5-9 четко детектируемых ампликонов. Это позволяет сделать вывод о том, что метод разрушения клеточных структур тканей сосны обыкновенной с применением жидкого азота позволяет получить качественные препараты ДНК лишь в случае использования в качестве источника ДНК - хвои. Для экстракции ДНК из древесины этот метод не эффективен.
Полученные результаты можно объяснить следующим образом. Охлаждение жидким азотом вызывает замерзание содержащейся в клетках воды с образованием кристаллов льда, которые при растирании разрушают клеточные стенки. Следовательно, данный метод разрушения будет не эффективен для тканей с минимальным содержанием воды, таких как древесина.
Разрушение клеточных структур простым механическим растиранием в присутствии экстрагирующего буфера.
Для экстракции ДНК из древесины и хвои в данном случае навеска древесного опила и хвои растиралась пестиком в ступке с присутствием 2хСТАВ экстрагирующего буфера. Как и в предыдущем случае, проверка качества полученных препаратов проводилась при обычной разгонке ДНК в агарозном геле (рис. 3.4) и проведением пробных ПЦР (рис. 3.5).
На рисунке 3.4 видно, что препараты, полученные с использованием в качестве исходного сырья для получения ДНК и древесины, и хвои практически не содержат молекул ДНК.
По результатам пробных реакций амплификации (рис. 3.5) можно сказать, что полимеразная цепная реакция в обоих случаях протекала неудовлетворительно. Полученные фрагменты ДНК практически невозможно визуализировать в случае использования древесины. Качество препаратов ДНК, полученных из хвои, также низкого качества: ампликоны не отделяются друг от друга, ISSR-профили размыты. Это делает обработку таких изображений практически невозможной.
При использовании в качестве исходного сырья для получения ДНК древесины практически не было выявлено четко детектируемых ампликонов, а в случае использования хвои можно выделить 2-4 размытых участка на один образец. Можно сделать вывод о том, что при экстракции ДНК разрушением клеточных структур простым механическим способом в присутствии экстрагирующего буфера невозможно получить препараты удовлетворительного качества.
Разрушение клеточных структур с применением гомогенизатора.
При данном методе разрушения древесину и хвою предварительно высушивали при комнатной температуре. Далее навеску помещали в пробирки с металлическими шариками, погружали в гомогенизатор (рис. 3.6) и доводили до порошкообразного состояния. Время гомогенизации для хвои составляло 25-30 мин., для древесины - 2-2,5 часа, пока ткань не растиралась до порошка.
Высокоэффективная и компактная система гомогенизации SpeedMill Plus (Analytik Jena AG, Германия) предназначена для измельчения образцов для дальнейшего выделения и очистки ДНК. Образцы быстро и эффективно гомогенизируются в лизирующих пробирках, которые содержат металлические шарики-растиратели.
Работая с гомогенизатором SpeedMill, можно использовать уже существующие протоколы или создавать и сохранять собственные. Параметры гомогенизации (скорость, время, количество циклов) легко настраиваются. Объем лизирующих пробирок - 2 мл, с шариками-растирателями из стали.
Как видно из рисунка 3.7, качество препаратов ДНК, полученных как из древесины, так и из хвои с применением гомогенизатора, гораздо выше, чем в ранее рассмотренных вариантах. В обоих случаях наблюдается высокое содержание молекул ДНК и низкая степень деградации.
Для дополнительной проверки качества препаратов ДНК проводили пробные реакции амплификации (рис. 3.8)
Результаты пробных реакций амплификации подтвердили (рис. 3.8), что полимеразная цепная реакция прошла удовлетворительно как с препаратами ДНК, полученными из древесины, так и из хвои. На электрофореграммах четко видны отдельные ампликоны, которые легко можно отделить друг от друга и подвергнуть дальнейшей математической обработке. На каждый анализируемый образец в среднем приходилось 10-15 четко детектируемых lSSR-фрагментов. На изображениях можно наблюдать как мономорфные, так и полиморфные ампликоны. Полученные фрагменты ДНК соответствуют размерам, характерным для ISSR-маркеров (200-2000 пар нуклеотидов). Это свидетельствует об отсутствии фоновой амплификации, которая может искажать результаты анализа.
Разрушение клеточных структур с применением гомогенизатора позволяет получить качественные препараты ДНК сосны обыкновенной независимо от того, что используется в качестве материала для экстракции -древесина или хвоя. Кроме того, разрушение клеточных структур гомогенизацией значительно уменьшает трудоемкость процесса выделения ДНК. Использование сухого материала также позволяет сэкономить место для хранения в морозильных камерах, что особенно актуально при значительном количестве анализируемых образцов.
Таким образом, оптимальным методом разрушения клеточных структур тканей сосны обыкновенной был признан метод с применением гомогенизатора. При его использовании были получены препараты ДНК, превосходящие по качеству аналогичные препараты, полученные с применением жидкого азота и простого механического растирания в присутствии экстрагирующего буфера. В случае использования в качестве источника ДНК древесины только данный метод позволил получить препараты ДНК сосны обыкновенной удовлетворительного качества. Если источником ДНК является хвоя, можно также использовать метод разрушения клеточных структур в жидком азоте. Метод простого механического растирания в присутствии экстрагирующего буфера оказался неэффективным.
Разработка программного модуля Bioimage Geles PCR Analysis v.1.0
Результатом ISSR-анализа ДНК являются изображения гелей-электрофорезов (рис. 3.13, прил. 5-10). В крайние лунки вносится маркер молекулярных размеров с заранее известными размерами фрагментов. В лунки между маркерами вносятся ПЦР-продукты анализируемых препаратов ДНК сосны обыкновенной. Дальнейшая задача анализа состоит в том, чтобы соотнести фрагменты анализируемых образцов с фрагментами маркера молекулярных размеров для определения длины ISSR-фрагментов ДНК. При этом на изображении можно увидеть, что фрагменты ДНК отдельных образцов имеют одинаковую длину с соседними фрагментами и выстраиваются в своеобразные горизонтальные линии. Эти линии представляют собой совокупность ISSR-фрагментов ДНК, которые типичны для всех анализируемых растений. Такие фрагменты называют мономорфными. Однако есть фрагменты, которые типичны не для всех анализируемых образцов - это полиморфные фрагменты (локусы). Каждой линии присваивается определенный молекулярный размер, который рассчитывается как среднее между размерами фрагментов каждого анализируемого образца.
В качестве исходных данных для математической обработки данных ISSR-анализа используется матрица, которая представляет собой совокупность нулей и единиц, где 1 - означает, что у анализируемого образца есть фрагмент, относящийся к определенной линии, а 0 - что он отсутствует.
Анализ изображений является трудоемким процессом, который не может быть выполнен компьютерными программами в автоматическом режиме без ошибок. Это обусловлено тем, что линии на изображении часто искривлены в произвольном направлении, что вызвано различным действием электрического поля в разных точках геля при электрофорезе. Это вынуждает обрабатывать изображения либо вручную, распечатав на бумаге, либо с использованием компьютерных программ в интерактивном режиме.
Ручная обработка изображений занимает значительное время (2-3 часа на одно изображение). В то же время при распечатке на бумаге ампликоны, имеющие малую интенсивность окраски, могут быть пропущены и не отмечены, что приведет к искажению результатов анализа.
Возникла необходимость в разработке алгоритма и программного инструментария для анализа и обработки изображений в генетических исследованиях, который сократит время обработки одного изображения и повысит точность анализа за счет того, что на мониторе ПК можно различить даже малоокрашенные фрагменты ДНК. В результате был разработан программный модуль Biolmage Geles PCR Analysis (рис. 3.14).
На основе комплексного анализа цифровых изображений гелей полимеразной цепной реакции (ПЦР), можно сделать следующие обобщающие выводы о пространственной структуре интересующих нас объектов.
Зарегистрированная сцена имеет четко выраженную периодическую структуру вдоль ширины, а также случайным образом расположенные маркеры в слотах вдоль вертикальной её составляющей.
Изображение содержит аддитивную и мультипликативную составляющую шума (Гонсалес, 2005), поэтому может быть представлено математической моделью:
После устранения всех видов шумов можно перейти к синтезу алгоритма нахождения основных объектов на изображении, к таким объектам относятся координаты начала и конца всех слотов, а также координаты маркеров. Усреднение яркостей вдоль высоты изображения позволяет получить точные горизонтальные координаты всех слотов. На рисунке 3.15 представлены одномерный сигнал, где максимумы советуют искомым значениям. Вертикальные координаты задаются оператором в диалоговом режиме, поскольку таких значений всего два. Таким образом, получаются пространственные координаты начала - А(х,у) и конца - В(х,у) для каждого слота.
Имея точное месторасположение вертикальных линий с маркерами и используя аппарат согласованной фильтрации с заданной импульсной характеристикой фильтра (Прэтт, 1982), определяем точные координаты для каждого маркера. В программном комплексе реализован инструментарий, который позволяет зарегистрировать и сформировать данные для последующего анализа, при минимизации человеко-машинных операций. Программа позволяет в интерактивном режиме относить фрагменты к той или иной линии. При этом автоматически фиксируется положение «О» или «1» и ведется подсчет молекулярного размера линии. В результате получаем матрицу, которая в дальнейшем используется для подсчета показателей генетической изменчивости, кластерного анализа и построения популяционной структуры анализируемых растений (рис. 3.16).
Данная программа предназначена для быстрой и эффективной обработки больших массивов данных по цифровым изображениям электрофоретического разделения продуктов полимеразной цепной реакции. Использование в методе ISSR позволило повысить точность и скорость исследований в среднем в 1,5-2 раза, по сравнению с существующими подходами.
В результате разработаны алгоритмы и программный инструментарий для анализа и обработки изображений в генетических исследованиях. Предлагаемый программный модуль может быть использован при проведении исследований в области ДНК анализа для повышения их достоверности и производительности. Получено свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ №2012619172 Biolmage Geles PCR Analysis v. 1.0 от 11.10.2012 г (прил. 19).
Разработанная программа анализа и обработки изображений в генетических исследованиях Biolmage Geles PCR Analysis v. 1.0 позволяет повысить точность и снизить трудоемкость работ при анализе электрофореграмм, рекомендуется к использованию при различных видах фрагментного анализа (RAPD, DAF и ШАР), в результате которого получаются изображения электрофорезов, сходных с ISSR-профилями.
ISSR-анализ плюсовых деревьев сосны обыкновенной из различных географических районов
В данной главе рассматриваются исследования по оценке генетической дифференциации (степени выраженности различий между сравниваемыми выборками, группами особей, выделенных по тому или иному признаку, или отдельными особями). В настоящее время только молекулярные методы позволяют оценивать как запас изменчивости, так и ее распределение в пространстве и времени. Проведенные во многих странах, в том числе и в России, исследования позволили выявить географическую приуроченность молекулярно-генетической изменчивости видов основных лесообразующих хвойных и лиственных пород к географическим регионам. Эти данные, при условии использования большого числа разнообразных маркеров, отражают интегральные оценки генетических различий и могут быть использованы в дополнение к традиционному подходу (оценка скорости роста географических культур) при уточнении схем лесосеменного районирования (Политов, 2008). Ключевая задача исследования - сравнительный анализ генетического разнообразия плюсовых деревьев сосны обыкновенной из разных географических районов.
В качестве объекта исследований были взяты 98 плюсовых деревьев сосны обыкновенной из разных регионов Среднего Поволжья (Кировская область, Республика Марий Эл, Пензенская область, Чувашская Республика). ДНК этих деревьев была проанализирована ISSR-методом с использованием 6-ти ранее выбранных полиморфных праймеров.
Используемые праймеры позволили идентифицировать широкий диапазон ISSR-фрагментов ДНК исследуемых деревьев (табл. 3.10). Количество ампликонов варьировало от 22 до 37, а длины фрагментов ДНК -от 130 до 2300 пар нуклеотидов. Общее число полученных локусов составило 179, из которых 90% (161) оказались полиморфными.
При этом количество полиморфных локусов, полученных от одного праимера, не зависело от общего количества идентифицированных фрагментов (рис. 3.24).
Согласно рисунку 3.19 наибольшая доля полиморфных фрагментов ДНК характерна для праймера (AG)8YT , а для праймера (AG)gT -наименьшая.
Доля полиморфных фрагментов ДНК по отношению к общему количеству полученных ампликонов по анализируемым регионам также была неодинакова (рис. 3.20).
Наибольший процент полиморфных фрагментов ДНК характерен для группы плюсовых деревьев из Пензенской области (73,2%) и Чувашской Республики (73,1%), а наименьший - для Республики Марий Эл (60,1%).
На основе анализа полученных электрофореграмм были рассчитаны частоты встречаемости аллелей обнаруженных локусов для анализируемых совокупностей плюсовых деревьев из разных географических районов. Полученные частоты ISSR-фрагментов использовались для оценки основных параметров генетической изменчивости деревьев сосны: эффективное число аллелей (Ne), общее генетическое разнообразие (Н) и индекс Шеннона (I) (табл. 3.11) (Lewontin, 1972; Kimura, 1964).
В соответствии с таблицей 3.11 наивысшие значения параметров генетической изменчивости характерны для плюсовых деревьев из Чувашской Республики, у которых эффективное число аллелей составило 1,447, общее генетическое разнообразие - 0,260, и индекс Шеннона - 0,387. Самые низкие показатели генетического разнообразия характерны для плюсовых деревьев из Республики Марий Эл, у которых данные параметры составили 1,334; 1,991 и 0,302 соответственно. В целом для всей анализируемой совокупности плюсовых деревьев значения параметров оказались выше, чем по отдельно взятым регионам.
Если сравнить полученные данные по параметрам генетической изменчивости с плюсовым насаждением в Республике Марий Эл, то в целом можно увидеть, что уровень генетической изменчивости плюсового насаждения превышает уровень генетической изменчивости плюсовых деревьев по отдельно взятым регионам. В то же время значения параметров для всей совокупности плюсовых деревьев превышают значения, полученные для плюсового насаждения.
Для оценки степени генетической дифференциации плюсовых деревьев из разных географических районов была рассчитана генетическая дистанция (табл. 3.12) и на основании невзвешенного парно-группового метода кластерного анализа (UPGMA) была построена дендрограмма (рис. 3.21).
Было установлено, что все четыре группы плюсовых деревьев генетически дифференцированы друг от друга. Наибольшая генетическая дистанция наблюдается между плюсовыми деревьями из Чувашской Республики и Кировской области (0,141), а наименьшая между деревьями из Республики Марий Эл и Кировской области (0,024). Однако статистически достоверных различий по значениям показателя достоверности различия (tj между показателями генетической изменчивости изучаемых групп деревьев выявлено не было. Как видно из таблицы 3.13, ни в одном случае значение критерия t не превысило даже единицы, поэтому различия в показателях генетической изменчивости анализируемых выборок нельзя назвать достоверными (табл. 3.13).
Анализируя дендрограмму (рис. 3.21), можно также увидеть, что исследованные группы плюсовых деревьев разделяются на два кластера. В первый кластер входят деревья из Кировской области и Республики Марий Эл, во второй - деревья из Пензенской области и Чувашской Республики. Возможно, это объясняется тем, что регионы первой и второй групп находятся на разных берегах р. Волги, поэтому длительное развитие популяций происходило без влияния друг на друга, что и выражено в их значительной генетической дифференциации.
Для плюсовых деревьев из Пензенской области и Республики Чувашия были обнаружены ISSR-фрагменты, которые не идентифицированы у остальных изучаемых групп (табл. 3.14). Для плюсовых деревьев из Кировской области и Республики Марий Эл таких участков обнаружено не было. Эти фрагменты ДНК могут быть маркерными для определенных географических районов.
