Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Гибридизация мягкой пшеницы Triticum aestivum L. и ржи посевной Secale cereale L для создания новых форм растений и методы геномного анализа растений гибридного происхождения (Обзор литературы) 12
1.1. Значение отдаленной гибридизации 12
1.2. Генетический контроль скрещиваемости мягкой пшеницы с рожью посевной 13
1.3. Основные типы реконструкции ядерных геномов при отдаленной гибридизации 15
1.3.1. Пшенично-ржаные амфиплоиды 15
1.3.2. Пшенично-ржаные дополненные линии 16
1.3.3. Пшенично-ржаные замещенные линии 18
1.3.4. Пшенично-ржаные линии с транслокациями и рекомбинантные линии..22
1.4. Методы анализа геномов растений, полученных на основе отдаленной гибридизации 24
1.4.1. Цитогенетические методы геномного анализа 24
1.4.2. Методы дифференциальной окраски хромосом 26
1.4.3. Флуоресцентная in situ гибридизация 28
1.4.4. Биохимический методы геномного анализа 30
1.4.5. Молекулярные маркеры 31
1.4.5.1. RFLP-маркеры 32
1.4.5.2. STS-маркеры 34
1.4.5.3. RAPD-маркеры 34
1.4.5.4. AFLP-маркеры 37
1.4.5.5. SSR-маркеры 38
1.4.5.6. ISSR-маркеры 42
Глава 2. Материалы и методы 44
Глава 3. Результаты 49
3.1 Молекулярный SSR-анализ пшенично-ржаных замещенных линий 49
3.1.1. Определение типа замещений у пшенично-ржаных замещенных линий 49
3.1.2. Изучение генотип ической среды пшенично-ржаных замещенных линий 55
3.1.3. Локализация SSR-маркеров пшеницы на хромосомах ржи замещенных линий 57
Глава 4. Характеристика пшенично-ржаных замещенных линий с использованием
микросателлитных маркеров (Обсуждение) 60
ЧАСТЬ II. Изучение влияния отдельных хромосом ржи на показатели андрогенеза in vitro на примере пшенично-ржаных замещенных
линий 67
Глава 1. Андрогенез in vitro (Обзор литературы) 67
1.1. Значение гаплоидов в генетике и селекции растений 67
1.2. Метод гаплопродюсеров 68
1.3. Метод культивирования пыльников in vitro 70
1.3.1. Последовательность этапов культивирования пыльников in vitro 71
1.3.2. Андрогенез in vitro 73
1.3.3. Факторы, влияющие на показатели андрогенеза in vitro 74
1.3.3.1. Стадия развития микроспор 74
1.3.3.2. Методы температурной предобработки пыльников 76
1.3.3.3. Условия культивирования. Температурный режим 77
1.3.3.4. Особенности минерального и органического состава искусственных питательных сред для культивирования пыльников in vitro 77
1.3.4. Генетические факторы, влияющие на признаки андрогенеза in vitro 81
1.3.4.1. Влияние генетических факторов на эффективность андрогенного эмбриоидогенеза мягкой пшеницы 82
1.3.4.2. Влияние генетических факторов на общую регенерационную способность андрогенных эмбриоидов и регенерацию зеленых и хлорофилл-дефектных проростков у мягкой пшеницы 85
1.3.4.3. Влияние генетических факторов на признаки андрогенеза in vit ro ржи посевной (Secale cereale L) 86
1.4. Гаметоклональная изменчивость и методы ее изучения 88
Глава 2. Материалы и методы 95
Глава 3. Результаты 100
3.1. Изучение особенностей андрогенеза in vitro у пшенично-ржаных замещенных линий 100
3.1.1. Показатели частоты продуктивных пыльников 100
3.1.2. Показатели частоты образования эмбриоидов 101
3.1.3. Показатели частоты регенерации всех проростков 105
3.1.4. Показатели частоты регенерации зеленых проростков 109
3.1.5. Влияние концентрации 2,4-Д в инициальной среде на эффективность андрогенеза in vitro 110
3.1.6. Влияние генотипического разнообразия на показатели андрогенеза in vitro у пшенично-ржаных замещенных линий Саратовская 29/ Онохойская, тритикале и линии пшеницы сорта Саратовская 29 112
3.2. Сравнение эффекта хромосом ржи 1R и 5R на особенности андрогенеза при культивировании пыльников пшенично-ржаных замещенных линий в зависимости от происхождения линий 113
3.3. Изучение особенностей каллусогенеза и регенерации в каллусной культуре незрелых зародышей пшенично-ржаных замещенных линий Саратовская 29/ Онохойская 118
3.4. Характеристика растений-гаметоклонов, полученных при культивировании пыльников замещенных пшенично-ржаных линий Саратовская 29/ Онохойская и линии пшеницы сорта Саратовская 29 123
Глава 4. Обсуждение 126
4.1. Особенности андрогенеза in vitro пшенично-ржаных замещенных линий 126
4.1.1. Влияние хромосом ржи на процесс андрогенного эмбриоидогенеза in vitro у пшенично-ржаных замещенных линий 127
4.1.2. Влияние сортового происхождения хромосом ржи 1R и 5R и типа замещения на показатели андрогенного эмбриоидогенеза у пшенично-ржаных замещенных линий 131
4.1.3. Влияние хромосом ржи на процесс регенерации проростков in vitro у пшенично-ржаных замещенных линий 133
4.2. Независимый генетический контроль признаков андрогенеза и саматического эмбриоидогенеза при культивировании пыльников и незрелых зародышей in vitro 135
4.3 Оценка стабильности гаплоидных и дигаплоидных растении-регенерантов, полученных при культивировании пыльников замещенных пшенично-ржаных линий in vitro 136
Заключение 141
Выводы 143
Список литературы 145
Приложение 174
- Основные типы реконструкции ядерных геномов при отдаленной гибридизации
- Изучение генотип ической среды пшенично-ржаных замещенных линий
- Изучение особенностей андрогенеза in vitro у пшенично-ржаных замещенных линий
- Изучение особенностей каллусогенеза и регенерации в каллусной культуре незрелых зародышей пшенично-ржаных замещенных линий Саратовская 29/ Онохойская
Введение к работе
Актуальность проблемы. Метод культуры пыльников находит широкое применение в генетике и селекции растений с целью ускоренного создания гомозиготных рекомбинантных линий (Bajaj, 1990; Barnabas, 2001). С помощью этого метода получены новые сорта и перспективные линии мягкой пшеницы (De Buyser et al., 1987; Bajaj, 1990; Pauk et al., 1995; Han, 1996).
При культивировании изолированных пыльников на питательной среде в микроспорах происходит переключение с гаметофитной программы развития на спорофитную, в результате чего формируются не пыльцевые зерна, как в условиях in vivo, а эмбриоиды, и получают развитие гаплоидные растения. Этот процесс получил название андрогенеза in vitro (Guha, Maheshvari, 1964).
Андрогенез in vitro разделяют на три основных этапа, контролируемых независимыми генетическими системами: образование эмбриоидов; регенерация проростков; развитие или зеленых растений, или альбиносов (Agache et al., 1988; Charmet, Bernard, 1984). Эффективность получения гомозиготных линий при использовании метода культивирования пыльников определяется частотой регенерации зеленых растений и развитием спонтанных дигаплоидов, что зависит от особенностей каждого из этих этапов андрогенеза in vitro (Першина и др.,1999; Holm et al., 1999).
Установлено, что среди факторов, определяющих особенности андрогенеза, основным является генотип растения-донора (Foroughi-Wehr, Zeller, 1990).
Среди злаков влияние генотипа и отдельных хромосом наиболее полно изучено у риса, ячменя, а так же пшеницы на примере большого разнообразия сортов (Foroughi-Wehr, Zeller, 1990; Holm et al., 1999), анеуплоидных (Zang, Li, 1984; Agache et al., 1989; De Buyser et al., 1992) и замещенных линий (Szakacs et al., 1989; Ghaemi etal., 1994).
Что касается ржи посевной S. cereale L, то в культуре пыльников in vitro большинство генотипов этого вида либо имеют низкие андрогенетические показатели, либо совсем не образуют растений-регенерантов (Wenzel et al., 1977; Rakoczy-Trojanowska et al., 1997; Immonen, Anttila, 1999). Изучение генетического контроля признаков андрогенеза на материале различных генотипов данного вида затруднено.
Работы по изучению влияния хромосом ржи на андрогенез проведены в основном на материале пшенично-ржаных дополненных линий и сортов пшеницы с
7 транслокацией 1BL/1RS (Henry, De Buyser, 1985; Agache et al., 1989; Luckett et al., 1991; Martinez et al., 1994). Наиболее подробно в этом отношении изучено влияние хромосомы 1R. Что касается данных о вкладе других хромосом ржи, то они немногочисленны и неоднозначны. Кроме того, существующие на настоящий момент генетические модели не позволяют четко отделить эффект хромосом ржи на проявление признаков андрогенеза in vitro от влияния генотипической среды пшеницы, а так же выявить зависимость этих признаков от сортового происхождения хромосом ржи. В связи с этим представляется целесообразным привлечение к данным исследования новых генетических моделей, позволяющих адекватно оценить влияние хромосом ржи на проявление признаков андрогенеза и определить хромосомную локализацию генетических факторов, контролирующих этот процесс.
Пшенично-ржаные дополненные и замещенные линии являются удобными модельными объектами в генетических и молекулярных исследованиях, в том числе для определения хромосомной локализации генов и молекулярных маркеров на хромосомах ржи (Sharp at al., 1989; Delaney et al., 1995; Cakmak et al., 1997).
Пшенично-ржаные замещенные линии, полученные сотрудниками ИЦиГ СО РАН Л.А. Кравцовой и А.И. Щаповой на основе гибридизации пшеницы сорта Саратовская 29 и ржи сортов Онохойская, Вятка и Вьетнамская (Кравцова, Щапова, 1980), представляют интерес и как генетические модели (Силкова и др., 1999; Silkova, Shchapova, 2003), и как перспективный материал для селекции (Щапова, Кравцова 1999). При использовании данных линий в качестве генетических моделей для точной интерпретации результатов экспериментов необходима надежная информация об их геномном составе, что позволит избежать ошибок в определении эффекта определенных хромосом ржи в контроле изучаемых признаков.
Необходимость проведения геномного анализа генотипов, используемых в качестве модельных объектов, была продемонстрирована многими исследователями на примере анеуплоидных линий пшеницы, полученных Сирсом (Devos et al., 2000), линий пшеницы с межсортовыми замещениями (Pestsova et al., 2000; Salina et al., 2003) и пшенично-ржаных дополненных линий (Martinez et al., 1994; Alkhimova et al., 1999). Было обнаружено, что многие линии несут хромосомные аберрации, некоторые из них неверно идентифицированы (Martinez et al., 1994; Alkhimova et al., 1999; Devos et al., 2000).
В настоящее время для анализа геномов гибридного происхождения доступны различные методы, в том числе основанные на цитогенетических и молекулярных
8 подходах. Микросателлиты, так же называемые SSR, от английского simple sequence repeats, - сравнительно новый тип ДНК-маркеров, обладающих большим потенциалом в исследованиях генома пшеницы (Roder et al., 1998), ржи (Saal, Wricke, 1999) и других злаков (Becker, Heun, 1995; Panaud et al., 1996), представляют интерес и для изучения пшенично-ржаных геномов гибридного происхождения, в том числе дополненных и замещенных линий.
Проведение SSR-анализа серии замещенных пшенично-ржаных линий позволит уточнить типы замещения, определить геномный состав, что необходимо для широкого использования данных линий как генетических моделей, в том числе при изучении влияния отдельных хромосом ржи на показатели андрогенеза in vitro.
Цель и задачи исследования. Цель работы - охарактеризовать пшенично-ржаные линии по типам замещения и геномному составу с применением микросателлитного анализа и изучить на примере данных линий влияние отдельных хромосом ржи на особенности андрогенеза in vitro.
Объект исследования - дисомные пшенично-ржаные замещенные линии, полученные на основе гибридизации пшеницы сорта Саратовская 29 и ржи сортов Онохойская, Вятка и Вьетнамская.
Задачи:
1) провести анализ пшенично-ржаных замещенных линий с применением
микросателлитных маркеров пшеницы и ржи для уточнения типов замещения и
определения геномного состава;
2) выявить особенности влияния отдельных хромосом ржи и всего ядерного генома
ржи на отдельные этапы андрогенеза: индукцию андрогенных эмбриоидов,
регенерацию проростков, спонтанную дигаплоидизацию;
3) изучить особенности андрогенеза у замещенных линий в зависимости от
сортового происхождения хромосом ржи и типов замещения;
изучить реакцию пыльников по показателям андрогенеза in vitro на варьирование концентрации 2,4-Д, экзогенного индуктора эмбриоидогенеза in vitro, в культуральной среде и выявить для каждого генотипа оптимальные концентрации;
провести сравнительный анализ влияния отдельных хромосом ржи на признаки андрогенного и соматического эмбриоидогенеза и регенерации in vitro;
6) охарактеризовать растения, регенерировавшие в культуре пыльников с
применением микросателлитного анализа.
9 Научная новизна и практическая ценность. В настоящей работе впервые показано, что микросателлитный анализ является надежным методом для идентификации хромосом ржи и выявления генетической гетерогенности у генотипов, полученных на основе гибридизации мягкой пшеницы и ржи посевной. С применением SSR-маркеров пшеницы и ржи проведено генотипирование пшенично-ржаных замещенных линий, что позволяет использовать данные линии в дальнейших исследованиях в качестве адекватных генетических моделей для локализации на отдельных хромосомах ржи генов и маркеров, а так же важно для дальнейшего применения их в селекционных работах. Впервые определена локализация на хромосомах ржи трех микросателлитных маркеров пшеницы, что позволяет интегрировать данные маркеры в молекулярно-генетическую карту ржи и использовать их наряду с другими маркерами в геномном анализе.
Впервые для изучения особенностей андрогенеза in vitro использована генетическая модель, позволяющая определить эффект отдельных хромосом ржи, функционирующих в единой генотипической среде пшеницы, на отдельные этапы андрогенеза in vitro. Показано, что в генотипической среде сорта Саратовская 29 хромосомы ржи 1R и 3R оказывают стимулирующий, а хромосома 5R -супрессирующий эффект на показатели андрогенного эмбриоидогенеза. Впервые показано положительное влияние хромосомы ржи 2R на частоту регенерации зеленых проростков при культивировании пыльников in vitro. Определено влияние хромосом ржи 1R и 5R на показатели эмбриоидогенеза и регенерации с учетом влияния сортового происхождения и типов замещения. Впервые показано, что наличие отдельных хромосом ржи в геноме пшеницы не подавляет спонтанное образование андрогенных дигаплоидов. Установлено, что влияние хромосом ржи пшенично-ржаных замещенных линий на индукцию андрогенного эмбриоидогенеза in vitro не сопряжено с их влиянием на индукцию соматического эмбриоидогенеза у каллусной культуры незрелых зародышей in vitro.
Впервые определена хромосомная локализация в хромосоме ржи 2R генов, контролирующих образование эмбриоидогенного каллуса в щитковой ткани незрелых зародышей.
Установлено, что изменение концентрации 2,4-Д в инициальной среде позволяет оптимизировать условия для регенерации зеленых растений при культивировании пыльников в условиях in vitro.
10 Апробация работы. Результаты работы были представлены на II Съезде ВОГиС, Санкт-Петербург, 2000, 11ой конференции EWAC, Новосибирск, 2000; Международных конференциях молодых ученых, Харьков, 2001, 2003гг; II конференции МОГиС, Москва, 2003 и обсуждались на отчетной сессии ИЦиГ СО РАН (2001).
Публикации. По результатам исследования опубликовано 9 работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых журналах.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из двух основных частей, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Каждая часть содержит обзор литературы, описание материалов и методов, изложение результатов и их обсуждения. Материал диссертации изложен на 201 странице печатного текста, включая 23 таблицы и 8 рисунков. Список цитированной литературы содержит 377 работ.
Благодарность. Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (номер проекта 02-04-4816-а, руководитель проекта д.б.н. Першина Л.А.; номер проекта 02-04-06747-м ас, руководитель проекта Добровольская О.Б.), Фонда Министерства Сельского и Лесного Хозяйства Германии (руководитель проекта к.б.н. Салина Е.А.). Автор благодарит сотрудников ИЦиГ СО РАН д.б.н. Щапову А.И. и к.б.н. Кравцову Л.А. за предоставление пшенично-ржаных замещенных линий, к.б.н. Силкову О.Г. за совместное изучение андрогенных растений-регенерантов. Автор благодарен сотрудникам ИЦиГ СО РАН Беловой Л.И. и Девяткиной Э.П. за помощь при выращивании растений в условиях теплицы, Стриге В.Н. и Баклановой М.В. - за техническую поддержку. Автор признателен д-ру Родер за возможность использования SSR-маркеров и выполнения работы, связанной с SSR-анализом замещенных линий, в лаборатории картирования генов и геномов растений (ІРК, Гатерслебен, Германия).
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ дНТФ - дезоксинуклеозидтрифосфат ИУК - индолилуксусная кислота НУК - нафтилуксусная кислота
пн - пара нуклеотидов
ПЦР - полимеразная цепная реакция
Трис-HCI - Трис (гидроксиметил) аминометан
ЭДТА - этилендиаминтетрахлоруксусная кислота
2.4-Д- 2.4-дихлорфеноксиуксусная кислота
AFLP - amplification fragments length polymorphism
FISH - fluorescence in situ hybridization
GISH - genomic in situ hybridization
ITMI - international Triticeae mapping initiative
ISSR - inter simple sequence repeats
McFISH - multicolor fluorescence in situ hybridization
MS - Murashige & Skoog
PI I- potato II
QTL - quantitative trait loci
RAPD - random amplified polymorphic DNA
RFLP - restriction fragment length polymorphism DNA
SCAR - sequence characterized amplified regions
SDS - додецил сульфат Na
STS - sequence-tagged sites
SSR - simple sequence repeats
SNP - single nucleotide polymorphism
Xgdm - Gatersleben D-genome Microsatellite
Xgwm - Gatersleben Wheat Microsatellite
Xrms - Rye Microsatellite
Xscm - Secale cereale Microsatellite
12 Часть I. ХАРАКТЕРИСТИКА ПШЕНИЧНО-РЖАНЫХ ЗАМЕЩЕННЫХ ЛИНИЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ МАРКЕРОВ
Основные типы реконструкции ядерных геномов при отдаленной гибридизации
Спонтанные пшенично-ржаные амфидиплоиды (AABBDDRR и AABBRR) возникают очень редко. Причина их появления - слияние нередуцированных гамет при самоопылении у пшенично-ржаных гибридов (Кравцова, Щапова, 1991).
После открытия полиплоидизирующего действия колхицина в конце 30-х годов 20-го столетия начались массовые работы по получению октоплоидных форм амфиплоидов (AABBDDRR, 2п=5б) при скрещивании Т. aestivum (AABBDD) х S.cereale (RR) и гексаплоидных (AABBRR, 2п=42) - при скрещивании T.turgidum (ААВВ) х S. cereale (RR). Такие амфиплоиды получили название тритикале. В настоящее время тритикале выделяют в отдельный род - Triticosecale Wittmack (Гордей, 1992).
Пшенично-ржаные амфидиплоиды, полученные в результате удвоения числа хромосом у гибридов Fi, содержат полные наборы хромосом исходных видов, пшеницы и ржи, и каждая хромосома имеет гомолога. Теоретически наличие пар гомологичных хромосом должно обеспечивать правильную конъюгацию хромосом и правильное протекание мейоза. Однако показано, что во многих случаях амфидиплоиды характеризуются значительным количеством нарушений в мейозе: отставанием хромосом, наличием мостов, микроядер, большим числом унивалентов. Это связано с тем, что геномы пшеницы и ржи функционируют несогласованно, в результате чего возникают гаметы с различным числом хромосом и, как следствие, появляются анеуплоидные растения, что снижает плодовитость популяции в целом (Хвостова, Шкутина, 1975).
Показано, что гексаплоидные формы тритикале являются более стабильными по сравнению с октоплоидыми, но причина этого не в более регулярном мейозе, а в плохой выживаемости анеуплоидов (Шкутина, 1971). Цитологическая нестабильность и невысокие хлебопекарные качества первичных гексаплоидных тритикале - основные причины того, что они долго не использовались в практике.
На основе первичных гексаплоидных тритикале путем скрещивания их с октоплоидными формами получают 42-хромосомные амфидиплоиды, так называемые, вторичные тритикале (Kiss, 1966, цит. по Гордей, 1992). Геномный анализ вторичных тритикале обнаружил, что они имеют сложный геномный состав, при их создании происходят замещения хромосом А- В- и R-геномов хромосомами D-генома пшеницы, транслокации и рекомбинации как между хромосомами пшеницы и ржи, так и между гомологичными хромосомами пшеницы (Taketa et al., 1997; Hohmann et al., 1999).
Среди вторичных тритикале имеются генотипы с высокими агрономическими показателями. Пример тому - полученный в рамках программы CYMMIT, сорт Bronco-90 (Taketa et al., 1997), а так же перспективные отечественные сорта (Корлюк и др., 2003).
Другой путь реконструкции геномов на основе отдаленной гибридизации -добавление к полному набору хромосом одного вида не целого генома другого вида, а только отдельных пар хромосом.
Получение пшенично-ржаных дополненных линий впервые описал в своей работе О Мара (О Мага, 1940), предложивший получать их по следующей схеме:
1) получение амфиплоида между гексаплоидной пшеницей и диплоидной рожью;
2) беккросирование 56-хромосомного амфиплоида гексаплоидной пшеницей;
3) беккросирование гибридов Fi, имеющих 42 хромосомы пшеницы и 7 хромосом ржи, гексаплоидной пшеницей;
4) выделение дисомных дополненных линий в потомстве самоопыленных растений с 42 хромосомами пшеницы и парой хромосом ржи.
Таким способом были получены серии дополненных линий (мягкая пшеница/ рожь посевная) следующих комбинаций: Goldfast /Kingll (Riley, 1960); Харьковская/ Dacold (Evans, Jenkins, 1960); Chinese Spring/ Imperial (Gupta, 1971).
Показано, что дополнение отдельных хромосом ржи изменяет фенотип пшеницы и придает ей новые качества. Дополненные хромосомы влияют на такие признаки, как размер и форма колоса, высота растения, сроки цветения и созревания, устойчивость к заболеваниям (Голубовская, 1971). С использованием дополненных линий впервые провели генетическую идентификацию хромосом ржи, и каждая хромосома была произвольно обозначена римской цифрой. При этом каждый автор давал свое обозначение хромосомам дополненных линий без их цитологической идентификации, так как метода, позволяющего точно идентифицировать каждую хромосому ржи, еще не существовало. К единой номенклатуре пришли позже при изучении гомеологии между хромосомами пшеницы и ржи у пшенично-ржаных замещенных линий.
Пшенично-ржаные дополненные линии оказались удобным модельным объектом, послужившим для изучения влияния отдельных хромосом ржи на проявление определенных признаков (Martinez et al., 1994; Cakmak et al., 1997), локализации на хромосомах биохимических и молекулярных маркеров (Sharp at al., 1989; Delaney et al., 1995), изучения организации субтеломерных районов хромосом ржи (Vershinin et al., 2002).
Несмотря на ряд ценных качеств, которыми обладают 44-хромосомные дополненные линии как модельные объекты, их непосредственное использование в сельскохозяйственной практике затруднено по нескольким причинам, первая из которых - цитологическая нестабильность. Наблюдается частая потеря хромосом ржи, в результате чего число 44-хромосомных растений в популяциях падает, и они замещаются 43-хромосомными растениями и 42-хромосомными эуплоидными генотипами (Голубовская, 1971).
Другая причина - в низкой плодовитости линий. Кроме того, добавление чужеродных хромосом может приводить к появлению таких нежелательных хозяйственных признаков как низкая озерненность, удлинение вегетационного периода, уменьшение кустистости, уменьшение размера колоса, ухудшение хлебопекарных качеств (Голубовская, 1971). Вместе с тем дополненные линии могут служить в качестве исходного материала при интрогрессии ценных признаков ржи пшенице, например, при создании замещенных линий.
Было показано, что наличие чужеродной пары хромосом в геноме пшеницы может вызывать геномные перестройки, как в генетическом материале ржи, так и пшеницы. Так, молекулярный RFLP анализ пшенично-ржаных дополненных линий выявил наличие делеций в хромосомах ржи 2R и 3R данных линий, а так же крупную делецию длинного плеча хромосомы 1А пшеницы (Martinez et al., 1994). А.Г. Алхимова с соавторами (Alkhimova et al., 1999), анализируя субтеломерные повторы ржи pSc200 и pSc250 у серии дополненных линий Chinese Spring/ Imperial, выявили, что только две хромосомы ржи дополненных линий - 4R и 6R не отличаются от исходных, остальные же несут делеций целых плеч хромосом или субтеломерных гетерохроматиновых районов. У дополненных линий было выявлено отсутствие одного или двух гомологов хромосом ржи (Alkhimova et al., 1999). Кроме того, у дополненных линий могут возникать транслокации как между хромосомами пшеницы и ржи, так и между различными хромосомами ржи (Lapitan et al., 1988).
Поддержание, так же как и получение дополненных линий - трудоемкий процесс, так как требуется постоянный цитологический контроль, подтверждающий наличие дополненной пары хромосом ржи (Голубовская, 1971).
Получение пшенично-ржаных дополненных линий, а так же наличие анеуплоидных линий у ряда сортов мягкой пшеницы позволили начать работы по созданию пшенично-ржаных замещенных форм.
Впервые полные серии моносомных, нуллисомных и тетрасомных линий были получены Сирсом (Sears, 1954) на основе мягкой пшеницы сорта Chinese Spring. С помощью этих линий впервые была определена принадлежность каждой хромосомы мягкой пшеницы к определенному геному и к определенной гомеологической группе. На основании способности тетрасомиков компенсировать отсутствие пары определенных хромосом у определенных нуллисомиков 21 пара хромосом мягкой пшеницы была разделена на семь гомеологичных групп по три хромосомы в каждой. Высокая степень компенсации в пределах гомеологичной группы указывает на генетическое родство между хромосомами одной группы.
Изучение генотип ической среды пшенично-ржаных замещенных линий
Оценка генотипической среды пшеницы и ржи проводилась на основании сравнения длины микросателлитов, картированных на хромосомах пшеницы и ржи, замещенных линий и контрольных линий пшеницы и ржи. В качестве контроля использовались растения линии сорта пшеницы Саратовская 29 и ржи сорта Онохойская, на основании которых были получены изучаемые замещенные линии.
У линий Л4 и Л6 не обнаружили аллелей SSR-локусов, отличных от локусов контрольной линии пшеницы (Табл. 4, 6 Приложения).
Анализ остальных замещенных линий выявил полиморфизм длины анализируемых SSR-последовательностей, выраженный у разных линий в неодинаковой степени. Так, линия Л1 имеет отличия от контрольной линии пшеницы по двум SSR-локусам (Xgwm 1093, Xgwm 544), что составляет 2.1% от всех анализируемых SSR-последовательностей пшеницы, а линия Л5 - по одному локусу, Xgwm 544 (1.0%).
Между контрольной линией пшеницы и линиями Л2 и ЛЗ обнаружили разницу в длине амплификационных фрагментов соответственно по 13 (13.7%) и по 25 (26.0%) SSR-локусам пшеницы (Табл. 2, 3 Приложения). Между собой две эти линии отличаются по 23 SSR-локусам пшеницы, что составило 24.7%. Таким образом, две линии с однотипным замещением 2R(2D), как следует из результатов SSR-анализа, и не различающиеся по морфологическим признакам, тем не менее, оказались отличимы друг от друга на молекулярном уровне аллельным составом 23 микросателлитных локусов пшеницы.
Кроме изменения длины амплификационных фрагментов по некоторым локусам было обнаружено отсутствие продуктов амплификации маркеров, расположенных на хромосомах пшеницы, не участвующих в замещениях. Так, у линии Л2 не амплифицировались два маркера: Xgwm 508 (5BS) и 617b (5AL), а у линии ЛЗ — три маркера Xgwm 471 (7AS), 508 (5BS), 793 (1DL).
В качестве основных причин отсутствия амплификационного фрагмента, и, следовательно, картированного локуса, можно предположить либо наличие делеции района хромосомы, где расположена соответствующая микросателлитная последовательность, либо наличие нуль-аллеля.
Чтобы проверить эти предположения в работу были дополнительно вовлечены ближайшие SSR-маркеры, расположенные дистально и проксимально по отношению к отсутствующим: Xgwm 1202, 1199, 133, 350, 1258с. Для всех этих маркеров показана амплификация фрагментов в картируемой области (Табл, 2, 3 Приложения), что исключает возможность наличия делеции, распространяющейся до соседних маркированных микросателлитных районов. Вероятно, локусы Xgwm 471, 508, 617b, 793 представлены у линий Л2 и ЛЗ нуль-аллелями, что, как и наличие аллелей ряда локусов отличных от контрольных, отражает высокий уровень генетической гетерогенности между данными линиями и контрольной линией пшеницы сорта Саратовская 29. Амплификация близлежащих маркеров не может полностью исключить наличия микроделеций в маркируемой области.
В целом показано, что 26 из 96 (27.1%) анализируемых микросателлитных маркеров пшеницы, включая дополнительные маркеры, использованные для анализа линий Л2 и ЛЗ, полиморфны в пределах серии замещенных линий. Это отражает высокую степень генетической гетерогенности исходного сорта пшеницы Саратовская 29, на основе которого были созданы замещенные линии, а так же получена "чистая линия" Саратовская 29, послужившая контролем в данном исследовании.
У замещенных линий было так же показано наличие различных аллелей SSR-локусов ржи. Так, по четырем микростеллитным маркерам ржи (Xscm 10, Xscm 43, Xrms 115 и Xscm 121) замещенные линии JHfiRofiD)), Л2(2іч0 (2D)), ЛЗ(ЗР0), Л4(5Р0 (5D)) и Л5(бКо(бА)) отличались от растения сорта Онохойская, взятого в качестве контроля. Это объясняется высоким внутрисортовым полиморфизмом, характерным для ржи, как перекрестно опыляемой культуры.
В результате проведенного SSR-анализа была обнаружена внутрилинейная генетическая неоднородность у отдельных замещенных линий. Так, одно из пяти анализируемых растений линии Л2(2К0(20)) выделялось среди остальных длиной фрагмента, амплифицированного при помощи праймеров Xgwm 456 (3DS), при этом размер продукта амплификации данного растения составил 135 пн, в отличие от продукта размером 131 пн, характерного для остальных растений этой линии (Табл. 2 Приложения). Кроме того, другое растение линии Л2(2Р0(20)) оказалось гетерозиготным по микросателлитному локусу Xgwm 619 (2BL), при этом наблюдалась одновременная амплификация двух фрагментов длиной 148 пн и 152 пн, тогда как у остальных растений длина фрагмента составила 152 пн (Табл. 2 Приложения).
Подобные результаты были получены и в отношении растений линии ЛЗ(ЗК0), локусы Xgwm 469 (6DS) и Xgwm 848 (1DS) которых были представлены двумя различными аллелями (Табл. 3 Приложения). При помощи пары праймеров Xgwm 469 на ДНК-матрице растений линии ЛЗ амплифицировались фрагменты длиной 165 и 175 пн. При этом одно из шести растений являлось гетерозиготой 165/175 пн, одно гомозиготой 175/175 пн, а у остальных растений амплифицировался фрагмент длиной 165 пн (Таблица 3 Приложения). Наличие продуктов разной длины, 192 пн и 194 пн, обнаружено так же и при амплификации локуса Xgwm 848 данной линии (Табл. 3 Приложения).
Таким образом, оценка генотипической среды пшеницы замещенных пшенично-ржаных линий показала, что линии Л1, Л4, Л5 и Л7 незначительно отличаются от контрольной линии пшеницы аллельным составом SSR-локусов пшеницы (0 - 2.1% локусов). В то же время для линий Л2 и ЛЗ процент локусов с аллелями отличными от контрольных составил 13.7% у линии Л2 и 26.0% у линии ЛЗ. Между собой эти линии отличаются аллельным составом 24.7% исследуемых локусов, что позволяет отличать между собой эти две линии с однотипным замещением на молекулярном уровне.
В общей сложности тридцать семь микросателлитных маркеров пшеницы амплифицировали фрагменты в геноме ржи сорта Онохойская (Табл. 1). Однако локализовать большинство маркеров на хромосомах ржи у замещенных линий не представлялось возможным из-за амплификации многими праймерами, разработанными для пшеничного генома, большого числа очень слабых фрагментов в геноме ржи или отсутствия полиморфизма длины амплификационных фрагментов между пшеницей сорта Саратовская 29 и рожью сорта Онохойская. Только четыре пары праймеров SSR-маркеров пшеницы {Xgwm 6, 334, 960 и 1016) амплифицировали фрагменты, характерные для ржи и отличные от фрагментов пшеницы, в геномах некоторых замещенных линий.
Маркер Xgwm 6 был картирован ранее на хромосоме 5R (Korzun et al., 2001; Ma et al., 2001) и результаты настоящей работы подтверждают эту локализацию (Табл. 4 Приоложения).
Праймер Xgwm 334 (6AS) амплифицировал четкий ПЦР-фрагмент (118 пн) и в геноме ржи сорта Онохойская, и у всех растений линии Л5(6К0(6А)), в то же время у растений данной линии отсутствует фрагменты длиной 114 пн и 126 пн, характерные для генома пшеницы сорта Саратовская 29 (Рис. 4). Это указывает на локализацию данного маркера на хромосоме ржи 6R.
Праймеры к маркеру Xgwm 960, локализованному в центромерном районе хромосомы 5В, амплифицируют продукт размером 164 пн на ДНК-матрице ржи сорта Онохойская и продукт аналогичного размера у всех растений линии Л4(5(Ч0{5А». Кроме того, в амплификационном спектре присутствуют фрагменты, характерные для 5В хромосомы пшеницы сорта Саратовская 29 (Табл. 4 Приложения).
Изучение особенностей андрогенеза in vitro у пшенично-ржаных замещенных линий
Например, линия 2R(2D)2 достоверно не отличалась от Саратовской 29 по частоте продуктивных пыльников, но отличалась от контроля по показателям частоты образования эмбриоидов, варьировавшей от 7.6% на среде с 0.75 мг/л 2,4-Д до 28.9% на среде с 0.25 мг/л 2,4-Д, что было достоверно выше, чем у Саратовской 29 при любом уровне фитогормонов в среде.
Аналогичные результаты получены и в отношении линий 2R(2D)1 и 6R(6A). Значения частоты образования эмбриоидов у линии 2R(2D)1 на безгормональной среде (Табл. 4) и среде с 0.75 мг/л 2,4-Д (Табл. 6), а у линии 6R(6A) на среде с 1.0 мг/л 2,4-Д (Табл. 7) были достоверно выше, чем у линии сорта Саратовская 29. Однако в других вариантах культивирования, на средах с 0.25 мг/л, 1.0 мг/л 2,4 -Д и безгормональной среде, эти показатели у линий 2R(2D)1 и 6R(6A) были на уровне контроля (Табл. 4-7).
Линия 1R(1D) наряду с высокими показателями частоты продуктивных пыльников продемонстрировала и высокие показатели частоты образования эмбриоидов, достоверно превышающие контроль при всех вариантах культивирования. При этом частота образования эмбриоидов на среде с наибольшим содержанием 2,4-Д (1 мг/л), составившая 74.6%, была выше, чем на средах с меньшей концентрацией 2,4-Д, где эта частота составила 11.8% на безгормональной среде, 32.3% и 35.8% на средах с 0.25 и 0.75 мг/л 2,4-Д, соответственно.
Линия 3R(3B) на безгормональной среде и средах с 0.25 и 0.75 мг/л 2,4-Д так же продемонстрировала высокий уровень эмбриоидогенеза, достоверно превышающий контроль (Табл. 4-6). Величина частоты образования эмбриоидов варьировала при этом в пределах от 42.5% до 52.4%. Однако повышение концентрации 2,4-Д в среде до 1.0 мг/л не только отрицательно сказывалось на частоте продуктивных пыльников, но и приводило у линии 3R(3B) к образованию каллуса и подавляло развитие эмбриоидов. При этом частота образования эмбриоидов у линии 3R(3B) и линии сорта Саратовская 29 на среде с 1мг/л 2,4-Д была на одном уровне и составила 16.3 и 15.3%, соответственно (Табл. 7).
Сравнивая частоту образования эмбриоидов у тритикале и у контрольной линии пшеницы Саратовская 29, следует отметить, что на среде, содержащей 0.25 мг/л 2,4-Д, значительных отличий по частоте образования эмбриоидов обнаружено не было (Табл. 5). В то же время на безгормональной среде и на среде с 0.75 мг/л 2,4-Д показатели частоты образования эмбриоидов у тритикале значительно превосходили линию сорта Саратовская 29 (Табл. 4, 6). Напротив, на среде с 1.0105 мг/л 2,4-Д уровень эмбриоидогенеза тритикале (1.1%) был достоверно ниже, чем у контроля пшеницы (15.3 %) (Табл. 7).
Линия 5R(5D) наряду с низкими показателями частоты продуктивных пыльников продемонстрировала и низкую частоту формирования эмбриоидов, значение которой составляло 0.35% при культивировании пыльников на среде с 0,25 мг/л 2,4-Д (Табл. 5) и 0.7% на среде с 0,75 мг/л 2,4-Д (Табл. 6), что было достоверно ниже по сравнению с контролем.
В процессе работы, было установлено, что изменение содержания 2,4-Д в инициальной среде неодинаково сказалось на показателях эмбриоидогенеза у разных линий.
Так, на частоту продуктивных пыльников, и на частоту образования эмбриоидов линии 5R(5D) наличие и концентрация индуктора эмбриоидогенеза, 2,4-Д, не оказали влияния. Линия 5R(5D) продемонстрировала самый низкий эмбриоидогенный потенциал при культивировании пыльников на средах с разным уровнем содержания 2,4-Д. У замещенных линий 1R(1D), 2R(2D)\ 2R(2D)2 и 6R(6A), как и у контрольной линии пшеницы, наблюдается некоторое увеличение эмбриоидогенного потенциала при повышение концентрации 2,4-Д в индукционной среде. Значительно отличаются от остальных линий по показателям эмбриоидогенеза линия 3R(3B) и тритикале: при повышении концентрации 2,4-Д в инициальной среде показатели эмбриоидогенеза у этих линий снижаются.
Вместе с тем среди всех изучаемых генотипов следует выделить линию 1R(1D), у которой показатели частоты образования эмбриоидов достоверно превышали не только контроль - линию сорта Саратовская 29, но и другие замещенные линии как на безгормональной среде, так и на средах содержащих 2,4-Д в различной концентрации.
Эмбриоиды, сформировавшиеся на инициальной среде с различным уровнем фитогормона 2,4-Д, пассировали на безгормональную регенерационную среду. При культивировании эмбриоидов на регенерационной среде часть их проявила способность к регенерации проростков, которые представляли собой зеленые или хлорофилл-дефектные растения (Рис. 7). Эмбриоиды линий 1R(1D), 2R(2D)1 и 3R(3B), сформировавшиеся на инициальной среде, не содержащей фитогормонов, проявили практически одинаковую способность к регенерации проростков: частота
На среде с 0.25 мг/л 2,4-Д у всех замещенных линий, за исключением линии 5R(5D), сформировались эмбриоиды с регенерационной способностью, близкой контрольной линии пшеницы. Эмбриоиды линий 5R(5D) и тритикале по регенерационной способности значительно уступали контролю (Табл. 9).
Значения частоты развития всех проростков из эмбриоидов, индуцированных на средах с более высоким содержанием 2,4-Д, у пшенично-ржаных замещенных линий были достоверно ниже, чем у линии сорта Саратовская 29. Частота развития проростков варьировала от 24.5% у линии 3R(3B) до 33.7% у линии 2R(2D)1 на среде с 0.75 мг/л и от 19.3% у линии 6R(6A) до 42.3% у линии 3R(3B) на среде с 1 мг/л 2,4-Д (Табл. 10, 11). Эти значения у линии сорта Саратовская 29 составили 66,7% на среде с 0.75 мг/л 2,4-Д и 77,8% - на среде с 1.0 мг/л 2,4-Д.
Эмбриоиды тритикале, развившиеся на среде с 1.0 мг/л 2,4-Д, не проявили способности к регенерации растений, а эмбриоиды, сформировавшиеся на среде с 0.75 мг/л 2,4-Д, развивались в проростки с частотой 31.4%. Значения показателей частоты регенерации проростков из эмбриоидов, индуцированных и на среде с 0.75 мг/л 2,4-Д, и на среде с 1.0 мг/л 2,4-Д. у тритикале были достоверно ниже, чем у линии сорта Саратовская 29 (Табл. 10,11).
Проявившиеся различия между линией пшеницы сорта Саратовская 29, замещенными линиями и тритикале обусловлены тем, что у эмбриоидов линии
Практически во всех вариантах культивирования эмбриоидов на регенерационных средах происходило развитие как зеленых проростков, так и альбиносов. Исключение составили эксперименты по культивированию эмбриоидов линии 2R(2D)2, индуцированных на среде с 0.75 мг/л, и линии 3R(3B) - на среде с 0.25 мг/л 2,4-Д. В этих случаях у линии 2R(2D)2 все семь регенерантов, а у линии 3R(3B) - два регенерировавших растения были альбиносами (Табл. 9, Значения частоты регенерации зеленых проростков из эмбриоидов линий 1R(1D), 2R(2D)2 и 3R(3B), развившихся на безгормональной среде, достоверно не отличались между собой (Табл. 8). Эмбриоиды контрольной линии пшеницы Саратовская 29, сформировавшиеся в тех же условиях, не были способны к регенерации ни зеленых проростков, ни альбиносов.
У всех замещенных линий, за исключением линии 2R(2D)2 и тритикале, частота регенерации зеленых растений к общему числу растений из эмбриоидов, индуцированных на среде с 0.25 мг/л 2,4-Д, достоверно не отличалась от линии сорта Саратовская 29. У линии 2R(2D)2 в этом эксперименте 90% от всех регенерировавших проростков были зелеными. Частота регенерации зеленых проростков этой линии составила 40.9% и значительно превысила контроль. У тритикале регенерировало всего два проростка, которые оказались зелеными (Табл.
9).На среде с 0.75 мг/л 2,4-Д более высокие значения частоты регенерации зеленых проростков к их общему числу по сравнению с линией сорта пшеницы Саратовская 29 (14.2%) были у эмбриоидов линии 6R(6A) и тритикале, составившие 75.0% и 68.8%, соответственно. У остальных замещенных линий эти показатели варьировали от 11.5% у линии 1R(1D) до 35/7% у линии 2R(2D)1 и были на уровне линии сорта Саратовская 29, у которой это значение составило 9,5% (Табл. 10).
Изучение особенностей каллусогенеза и регенерации в каллусной культуре незрелых зародышей пшенично-ржаных замещенных линий Саратовская 29/ Онохойская
Это следует и из данных по оценке частоты зеленых проростков по отношению к общему числу регенерантов (Табл. 15). У линии 1Ro(1D) из 108 регенерантов только 25 проростков (23.1%) были зелеными, в то время как у линии 1Ro(1A) из 62 проростков зелеными были 60 (96.7%). Очевидно, 1D хромосома пшеницы оказывает стимулирующее влияние на процесс регенерации зеленых проростков, и отсутствие этой хромосомы у линии 1Ro(1D) не компенсируется влиянием 1R хромосомой ржи сорта Онохойская.
Таким образом, показано, что стимулирующее влияние хромосомы ржи 1R и супрессирующее - хромосомы ржи 5R на процесс эмбриоидогенеза в культуре пыльников не зависит от замещения этих хромосом в А или D геномах пшеницы. Выраженность признака "частота эмбриоидогенеза" в культуре пыльников под влиянием 1R хромосомы зависит от ее сортовой принадлежности. Наряду с хромосомой ржи 1R на регенерацию всех проростков так же оказывает значительное влияние хромосома пшеницы 1А, а на регенерацию зеленых проростков существенно влияют и 1R хромосома ржи, и 1D хромосома пшеницы.
Для проведения сравнительного анализа влияния отдельных хромосом ржи на признаки андрогенного и соматического эмбриоидогенеза и регенерации in vitro незрелые зародыши замещенных пшенично-ржаных линий Саратовская 29/ Онохойская культивировали в одинаковых условиях на среде MS с добавлением 2 мг/л 2,4-Д (Рис. 8).
При культивировании незрелых зародышей в течение первых трех-четырех суток наблюдалось начало каллусогенеза, что было связано с заметным увеличением базальной части экспланта за счет ее обводнения. При дальнейшем
Как следует из данных, приведенных в Таблице 16, значения частоты образования каллусов при культивировании зародышей во всех экспериментах были высокими и в среднем варьировали от 90.9 % у линии 3R(3B) до 100 % у линий 2R(2D)2 и 6R(6A). При этом статистически достоверная разница по сравнению с контролем, линией сорта пшеницы Саратовская 29, по этому показателю была только у линии 3R(3B).
По характеру каллусогенеза при культивировании незрелых зародышей наиболее близка контролю, линии сорта пшеницы Саратовская 29, оказалась линия 5R(5D). По показателям частоты образования каллусов, проявивших способность к регенерации проростков, замещенная линия 5R(5D) также достоверно не отличалась от контроля (Табл. 16).
Линии 2R(2D)\ 2R(2D)2 и 3R(3B), характеризовалась преимущественным образованием эмбриоидогенного каллуса. Данные линии имели достоверно более высокую частоту образования каллусов, у которых происходила регенерация проростков, по сравнению с контролем, линией пшеницы сорта Саратовская 29 (Табл. 16). При этом обе линии с замещением 2R(2D) превосходили линию 3R(3B) по уровню образования эмбриоидогенного каллуса более чем в 2 раза. По регенерационной способности эмбриоидогенных каллусов эти три линии не отличались ни между собой, ни по сравнению с контролем. Однако максимальное число регенерантов на один каллус у этих замещенных линий был наиболее высоким по сравнению с контролем и другими линиями и варьировал от 23 проростков на каллус у линии 2R(2D)2 и линии 3R(3B) до 27 проростков у линии 2R(2D)1. У линии сорта пшеницы Саратовская 29 развивалось не более 12 проростков на один продуктивный каллус (Табл. 16).
У линий 1R(1D) и 6R(6A) при культивировании изолированных зародышей происходило образование преимущественно медленно растущего обводненного каллуса с очень редкими включениями более плотного эмбриоидогенного каллуса. В целом каллусные культуры линий 1R(1D) и 6R(6A) имели по сравнению с другими замещенными линиями и линией сорта Саратовская 29 самую низкую регенерационную способность. Так, у линии 1R(1D) значение частоты образования каллусов с проростками было достоверно ниже, чем у контроля. У линии 6R(6A) этот показатель также был низким, но достоверно от линии Саратовская 29 не отличался (Табл. 16).
Таким образом, при культивировании изолированных зародышей пшенично-ржаных замещенных линий обнаружено варьирование показателей образования каллуса, проявившего способность к регенерации проростков. Определенная изменчивость наблюдалась и между значениями среднего числа проростков на один продуктивный каллус.
Сравнивая данные по культивированию изолированных зародышей с результатами, полученными при культивировании in vitro пыльников замещенных пшенично-ржаных линий, обнаружили, что линия с самым высоким андрогенетическим потенциалом, 1R(1D), характеризуется низкими показателями частоты образования эмбриоидогенного каллуса и частоты регенерации проростков при культивировании незрелых зародышей, значительно уступая контролю.
Линия 5R(5D), пыльники которой не проявили способности к андрогенезу in vitro, по способности к формированию эмбриоидогенного каллуса и регенерации проростков при культивировании in vitro незрелых зародышей не уступала контролю, линии пшеницы сорта Саратовская 29.
В то же время, линия 3R(3B), которая характеризуется высокой способностью к андрогенному эмбриоидогенезу in vitro, оказалась высокопродуктивной и по показателям соматического эмбриоидогенеза и регенерации при культивировании in vitro изолированных зародышей, достоверно превышая контроль.
Линии 2R(2D)1 и 2R(2D)2, оказались наиболее продуктивными по показателям частоты эмбриоидогенных каллусов и частоты регенерации проростков при культивировании in vitro незрелых зародышей. Отличий по показателям изучаемых признаков между двумя этими линиями обнаружено не было. При анализе андрогенетических показателей данных линий обнаружили достоверное повышение частоты образования зеленых проростков у линии 2R(2D)2 по сравнению с контролем и остальными замещенными линиями.
Из полученных результатов следует, что наличие хромосомы 2R в геноме замещенных линий стимулирует образование соматических эмбриоидов с высокой регенерационной способностью в каллусной культуре незрелых зародышей, а так же оказывает положительное влияние на частоту регенерации зеленых проростков в культуре пыльников in vitro.
Таким образом, сравнительный анализ влияния отдельных хромосом ржи на проявление признаков андрогенного и соматического эмбриоидогенеза и регенерацию зеленых проростков в культуре изолированных пыльников и незрелых
