Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1. История, развитие и характеристика молекулярных маркеров 11
1.1.2. Появление ДНК маркеров 13
1.1.2.1 RFLP (restriction fragment length polymorphism) — полиморфизм длины рестрикционных фрагментов 14
1.1.2.2. Минисателлиты (minisatellites) 15
1.1.3. Молекулярные маркеры, основанные на методе ПЦР 15
1.1.3.1. Микросателлиты (microsatellites) 15
1.1.3.2. RAPD и производные методы 16
1.1.4. Полиморфизм последовательностей ДНК 18
1.1.4.1. Полиморфизм единичных нуклеотидов - SNP (single nucleotide polymorphism) 19
1.1.4.2. Секвенирование ДНК 20
1.1.4.3. Маркеры на основе последовательностей транскриптонов (EST) 20
1.2. Практическое значение молекулярно-генетических маркеров 23
1.2.1 Геномный анализ и селекция растений 23
1.2.2. Поиск «генов-кандидатов» с использованием генетической карты 24
1.2.3. Геномика и eQTL (ExpressQTL) 25
1.2.4. Изучение генетических перестроек, произошедших в процессе эволюции 25
1.2.5. Филогенетические исследования 27
1.3. Филогенетический анализ, основанный на анализе нуклеотидных последовательностей ДНК 28
1.3.1. Методы дифференциального гель-электрофореза 29
1.3.2. Свойства молекулярно-генетического маркера 30
1.3.3. Последовательности хлоропластной ДНК в качестве молекулярно-генетических маркеров 32
1.3.3.1. Хлоропластный геном 32
1.3.3.2. Скорость эволюции хлоропластной ДНК 36
1.3.3.3. Использование хлоропластной ДНК в филогении растений 38
1.3.4. Молекулярно-генетические маркеры, основанные на ядерных последовательностях 41
1.5. Филогения видов рода iris l 46
1.6. Филогения видов рода triticuml. 49
ГЛАВА 2. Материал и методы 55
2.1. Растительный материал 55
2.2. Выделение и очистка суммарной днк из растений 58
2.3. Rapd анализ 59
2.4. Амплификация определенных фрагментов днк методом полимеразнои цепной реакции (пцр) 60
2.5. Электрофорез продуктов пцр в агарозном геле, их выделение и очистка ..61
2.6. Клонирование фрагментов днк, полученных методом пнр 62
2.7. Выделение плазмидной днк 64
2.8. Определение нуклеотиднои последовательности клонированных фрагментов 65
2.9. Филогенетический анализ 65
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 67
3.1. Использование «непрямых» молекулярно-генетических маркеров для реконструкции филогении 67
3.1.1. RAPD анализ сибирских видов рода Iris 67
3.2. Использование в качестве молекулярных маркеров нуклеотидных последовательностей хлоропластной ДНК 73
3.2.1. Поиск ДНК маркера для реконструкции филогении рода Iris 74
3.2.2. TrriT - trnF район хпДНК как маркер для реконструкции филогении 76
3.2.2.1. Филогения рода Iris 76
3.2.2.2. Филогения рода Triticum 83
3.2.3. 7>иАГинтрон с внутренним matK геном хпДНК как маркер для реконструкции филогении 86
3.2.3.1 Построение филогении рода Triticum: анализ нуклеотидных последовательностей 86
3.2.3.2. Анализ топологии филогенетического древа 90
3.3 Использование ядерной днк как молекулярного маркера 96
3.3.1. Специфическая амплификация В генома пшениц 96
3.3.2. Происхождение А генома пшениц 101
3.3.3. Основные дополнения в эволюционном сценарии и происхождении видов рода Triticum 106
Заключение 107
Выводы 109
Список литературы
- RFLP (restriction fragment length polymorphism) — полиморфизм длины рестрикционных фрагментов
- Практическое значение молекулярно-генетических маркеров
- Электрофорез продуктов пцр в агарозном геле, их выделение и очистка
- Поиск ДНК маркера для реконструкции филогении рода Iris
Введение к работе
Актуальность
Проблема построения естественной классификации живых существ, отражающей их филогенетическую историю, всегда была важна для эволюционных биологов, так как нередко возникают спорные моменты, и их разрешение является одной из задач современной филогении. Ранее традиционным было построение филогенетических и классификационных систем на основании сравнения морфо-анатомических признаков и кариологических данных. Но высокий уровень гомоплазии, чрезвычайное разнообразие морфо-экологических характеристик и многочисленные хромосомные вариации приводят к усложнению работы с этими признаками. В настоящее время основным подходом таксономистов становятся многочисленные методы с использованием молекулярных маркеров, а также анализ непосредственно нуклеотидных последовательностей ДНК и построение на основе полученных данных филогенетических деревьев для тех или иных таксонов, что позволяет существенно дополнить и уточнить традиционные классификационные системы. На высоких таксономических уровнях (семейства и выше) применение молекулярных данных для эволюционной реконструкции оказывается наиболее целесообразным, так как корректная оценка гомологичных морфологических характеристик здесь невозможна. Сопоставление количественных данных, полученных при помощи современных молекулярно-биологических методов, с палеонтологическими датировками позволяет проводить временную оценку дивергенции изучаемых таксонов.
Выбор того или иного метода и молекулярного маркера, вариабельность которого будет положена в основу работы, является одной из важных задач для исследователя. Некодирующие последовательности ДНК имеют большую частоту мутаций по сравнению с кодирующими последовательностями, поэтому они могут использоваться для получения филогенетической информации на внутривидовом и внутриродовом таксономических уровнях (Taberlet et al., 1991, 2006). При помощи алгоритмов, реализованных на базе современных компьютеров, анализ полученных данных проводится быстро и не требует громоздких вычислений "вручную".
Хлоропластный геном представляет собой исключительно удобный объект для исследования филогении растений, благодаря многокопийности и единообразию молекул хпДНК. Более того, хлоропластная ДНК имеет относительно низкий молекулярный вес и при необходимости может быть выделена в чистом виде. Несмотря на небольшую длину ДНК, она содержит достаточное количество как кодирующих, так и некодирующих участков, информативных для молекулярно-эволюционного анализа. В среднем первичная
структура хпДНК имеет меньшую скорость накопления мутаций в ходе эволюции, чем яДЫК. По этой причине, используя хлоропластные маркеры можно анализировать эволюционное родство растений на более высоких филогенетических уровнях. Но, несмотря на низкую скорость эволюции и относительно стабильный нуклеотидный состав генов, с помощью сравнительных молекулярных исследований в хлоропластном геноме обнаружены многочисленные мутационные изменения (Clegg et al., 1994). Все зависит от того, какой участок ДНК выбран для анализа. Поэтому, для достижения необходимого филогенетического разрешения определенного таксономического уровня необходим предварительный анализ и последующий выбор подходящих пластидных и ядерных последовательностей.
Объектами настоящего исследования стали сибирские виды рода Iris L. (семейство Iridaceae Juss. порядок Liliales Perlep. класс Monocotyledons) и виды рода Triticum L. (семейство Poaceae (R.Br.) Barnhart порядок Poales Small, класс Monocotyledons). Оба рода из класса Monocotyledons обладают уникальными качествами для практической селекции, несмотря на то, что цели, которые преследуют исследователи в программах по выведению новых сортов, различны. Для садоводов-любителей, ландшафтных дизайнеров и селекционеров ирисы интересны, прежде всего, своим неисчерпаемым потенциалом в качестве декоративных растений. Виды рода Iris занимают одно из первых мест в мире. среди цветочных культур по количеству сортов. Ценное эфирное масло, получаемое из цветков, идёт на производство парфюмерной продукции высшего качества. Масло очень дорого, поэтому заменяется синтетическим ироном и др: ароматизаторами. Более того, род служит модельным объектом для исследования интрогрессивной гибридизации (Martin et al. 2006). По количеству входящих в него видов род Iris является самым обширным в семействе и при этом не имеет согласованной классификации: Представления об эволюционной истории рода также неоднозначны (Родионенко, 1988; Mathew, 1989). Наряду с накоплением большого количества новых данных, которые не всегда согласуются с ранее полученными результатами о родственных взаимоотношениях на основе морфологических, палеонтологических и цитологических данных, происходит анализ и пересмотр эволюционной истории современной флоры. Обширные базы данных, включающие нуклеотидные последовательности большого количества видов, позволят также посредством сравнения ДНК определять новые дополнения в системе.
Филогения пшениц изучается уже очень давно (Гончаров, 2002; McFadden, Sears, 1946; Mandy, 1970; Jaaska, 1980; Tsunewaki, Ogihara, 1983; Kerby, Kuspira 1986; Feldman, Levy 2005). Различные диплоидные виды пшениц и эгилопсов предлагались на роль доноров геномов полиплоидных видов рода Triticum (Kerby, Kuspira, 1986). Интересны с
эволюционной точки зрения и другие работы, касающиеся реконструкции ранней дивергенции диплоидных пшениц от предка Aegilops speltoides Tauch. и их близкого родства с эгилопсами подсекции Emarginata секции Sitopsis. Наличие двух типов цитоплазмы в полиплоидных видах рода Triticum предполагает возможность их дифелитического происхождения (Tsunewaki et al., 1976; Mori et al., 1995). Эта гипотеза была основана на ранних гибридологических и цитологических анализах (Lilienfeld and Kihara, 1934). Однако существовало и противоположное мнение (Tanaka et al., 1978).
Таким образом, в настоящее время, очевидно, что сравнительный анализ ДНК является одним из наиболее эффективных методов для изучения филогении и эволюции различных таксонов. Используя молекулярные маркеры возможно подтвердить гипотезы происхождения культурных растений и разрешить имеющиеся несоответствия в трактовках эволюционных событий. Только в недавнее время при развитии молекулярных подходов появляется достоверная информация о том, какими же путями шла эволюция у такой сельскохозяйственной культуры, как мягкая пшеница, и в каком направлении? Какие виды пшениц являются наиболее древними, а какие появились сравнительно недавно?
Известно, что эволюция пшениц шла в два этапа: а) накопление нуклеотидных замен
на диплоидном уровне, как у всех других диплоидных организмов, и затем б)
полиплоидия, сыгравшая немаловажную роль в истории злаковых, с последующей
дивергенцией уже на полиплоидном уровне. Такая филогенетическая картина сильно
усложняет стандартные схемы эволюционного анализа, так как требует дополнительного
этапа клонирования, обусловленного наличием нескольких близкородственных геномов в
одном растении. Поэтому хлоропластный геном в данном случае является очень удобным
и часто используется в подобных работах (Yang et al., 2002; Kim et al., 2007).
Однородность всех молекул хлоропластов (последовательности подвержены процессам
ректификации), их многочисленность, материнское наследование (установлено для всех
синтетических видов, включенных в работу) делает хлоропластную ДНК практически
основным объектом для молекулярных работ с полиплоидными видами. Более того,
полностью установленная нуклеотидная последовательность генома и информация о
скорости эволюции определенных участков позволяет выбирать наиболее подходящие
молекулярные маркеры (Matsuoka et al., 2002,
). Однако наряду с развитием современных технологий и увеличением объема знаний остается еще много вопросов в эволюции злаковых, в том числе хозяйственно важных растений, где процессы эволюции
происходили в тесном контакте с доместикацией. До сих пор до конца не выяснены вопросы происхождения геномов культурных и диких полиплоидов, а также, как происходили процессы доместикации, какие механизмы ответственны за возникновение того или иного хозяйственно важного признака.
Для ответа на такие вопросы необходимо изучать именно ядерные последовательности ДНК пшениц, и использовать геном-специфичные молекулярные маркеры для амплифицирования последовательности того или иного генома. При экспоненциальном росте геномных проектов и появлении в базах данных последовательностей ДНК различных геномов это становится возможным.
Цель и задачи исследования. Цель данной работы — разработка и использование молекулярных маркеров для построения филогении растительных таксонов на внутриродовом уровне.
В конкретные задачи работы входило:
Установление филогенетических взаимоотношений сибирских видов рода Iris на основе двух различных систем молекулярных маркеров: RAPD анализ и молекулярно-филогенетический анализ хлоропластных последовательностей ДНК.
Поиск молекулярных маркеров в хлоропластном геноме для установления родственных взаимоотношений внутри рода Triticum. Построение филогении видов этого рода.
Разработка на основе имеющейся в базе данных информации геном-специфичных ядерных маркеров для амплификации трех геномов пшениц (А, В, G).
Исследование происхождения А генома пшениц на основе вариабельности хлоропластных и ядерных последовательностей.
Научная новизна работы. Впервые с использованием как пластидных, так и ядерных молекулярных маркеров были установлены филогенетические взаимоотношения сибирских видов рода Iris и всех известных к настоящему моменту видов рода Triticum. Среди включенных в работу пшениц 22 вида и подвида рода Triticum охарактеризованы на молекулярном уровне впервые, их кластеризация с остальными изученными видами пшениц соответствует их геномным формулам. Установлен хлоропластный филогенетический маркер, позволяющий различать эволюционные линии Emmer и Timopheevii. Разработаны геном-специфичные ядерные маркеры на основе последовательностей Л ее-1 и Pgk-І генов для амплификации А, В и G геномов пшениц. Использование таких маркеров позволило уточнить происхождение трех различных
геномов пшениц (А,В и G) и выявить полиморфизм А генома у диплоидных видов рода ТгШсит.
Научно-практическое значение. Эволюционная история тех или иных растительных таксонов всегда играла немаловажную роль для селекционеров, генетиков и ботаников. Тщательно и полно разработанные на основе родственных взаимоотношений классификации видов культурных растений важны для сбора, сохранения и оценки биоразнообразия, для прогноза возможности успешной интрогрессии полезных признаков и генов из видов-сородичей, а также для сертификации сортов. Полученные в данной работе молекулярные маркеры, специфичные для определенного генома полиплоидных пшениц могут быть использованы для установления или подтверждения геномного состава у ископаемых растений или ранее описанных видов, в том числе и синтетических.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на 8-ой молодежной и 1(1Х) международной конференциях молодых ботаников (Санкт-Петербург, Россия, 2004, 2006), на 5-ой конференции "Биоинформатика регуляции и структуры генома" (BGRS'2006, Новосибирск, Россия, 2006), на 2-ой центрально-азиатской конференции по злаковым культурам (Чалпан-Ата, Республика Кыргызстан, 2006), на 5-ой европейской конференции по растительной геномике (Венеция, Италия, 2006), на X международной генетико-селекционной школе «Реализация идей Н. И. Вавилова на современном этапе развития генетики, селекции и семеноводства сельскохозяйственных культур» (Новосибирск, Россия, 2007), на международной научной конференции «Современные эволюционные подходы в биологии, медицине и социологии», посвященной 90-летию со дня рождения акад. Д.К. Беляева (Новосибирск, Россия, 2007), на 11-ом конгрессе европейского общества эволюционных биологов (Упсала, Швеция, 2007).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ.
Makarevich I., Golovnina К., Scherbik S., Blinov A. Phylogenetic relationships of the Siberian Iris species inferred from noncoding chloroplast DNA sequences II Int. J. Plant Sci., 2003, V.164, P.229-237.
K.A. Головніша. Молекулярная филогения сибирских видов рода Iris , основанная на анализе нуклеотидных последовательностей некодирующих участков хлоропластной ДНК // Материалы VIII Молодежной Конференции Ботаников в Санкт-Петербурге, 17-21 мая, 2004, с. 243.
Golovnina К., Glushkov S. Molecular phylogeny of the genus Triticum // Proceedings of the I(IX) international conference of young botanists in Saint-Petersburg, May 21-26,2006, P. 39.
Гончаров Н.П., Кондратенко Е.А., Храброва М.А., Коновалов А.А., Лайкова Л.И., Блинов А.Г., Головнина К.А., Глушков С.А. Рукотворные виды - источник биоразнообразия пшениц. //Агромеридиан, 2006, Т.3(4), С.86-91.
Golovnina К., Glushkov S., Blinov A., Mayorov V., Adkison L., Goncharov N. Molecular phytogeny of the genus Triticum L. II Proceedings of the fifth international conference on bioinformatics of genome regulation and structure - BGRS 2006, Novosibirsk, Russia, July 16-22, 2006, V. 3, P. 147-150.
Golovnina K., Glushkov S., Blinov A., Goncharov N.P. Genome-specific markers for А, В and G Triticum genomes. II Proceedings of the fifth plant genomics european meetings - PLANT GEMS, Venice, Italy, October 11-14, 2006, P. 211.
Golovnina K.A., Glushkov S.A., Blinov A.G., Mayorov V.I., Adkison L., Goncharov N.P Phylogeny of the genus Triticum L. Based on chloroplast TrnL and MatK sequences II Proceedings of the fifth plant genomics european meetings - PLANT GEMS, Venice, Italy, October 11-14, 2006, P. 319.
Н.П. Гончаров, Е.Я. Кондратенко, С.В. Банникова, А.А. Коновалов, К.А. Головнина. Сравнительно-генетический анализ голозерной диплоидной пшеницы Triticum sinskajae и ее исходной формы Т. топососсит // Генетика, 2007, Т.43(11), С.1491-1500.
К. A. Golovnina, S. A. Glushkov, A. G. Blinov, V. I. Mayorov, L. R. Adkison and N. P. Goncharov. Molecular phylogeny of the genus Triticum L. II PI. Syst. Evol., 2007, V.264,P.195-216.
10. N.P. Goncharov, K.A. Golovnina, B. Kilian, S. Glushkov, A. Blinov, V.K. Shumny.
Evolutionary history of wheats - the main cereal of mankind II In. N. Dobretsov et al.
(eds.), Biosphere Origin and Evolution, part VI,_Springer 2008, P. 407-419. (DOI
10.1007/978-0-387-68656-1_29).
11. Kseniya A. Golovnina, Sergey A. Glushkov, Nikolay P. Goncharov, Alexander G.
Blinov. The origin of А, В and G Triticum genomes based on molecular data II
Proceedings of the XI Congress European Society for Evolutionary Biology - ESEB
2007, Uppsala, Sweden, August 20-25, 2007, P.351.
RFLP (restriction fragment length polymorphism) — полиморфизм длины рестрикционных фрагментов
Данный класс молекулярных маркеров включает, RAPD (randomly amplified polymorphic DNAs) - полимеразная цепная реакция со случайными праймерами, DALP (direct amplification of length polymorphism) - прямая амплификация фрагментов, имеющих полиморфизм длин, ISSRs (inter - simple - sequence repeats) - полиморфизм последовательностей простых повторов, IRAPs (inter - retrotransposon amplified polymorphisms) - полиморфизм последовательностей амшгафицированных ретротранспозонов и AFLP (amplified fragment length polymorphism) - полиморфизм длины амплифицированных фрагментов.
Перечисленные методы молекулярных маркеров основаны на использовании ПЦР праймеров, которые могут отжигаться с большим количеством сайтов в геноме. Такое событие может быть достигнуто несколькими способами: использованием коротких ПЦР праймеров - RAPDs (Williams et al., 1990), длинных ПЦР праймеров - DALP (Desmarais et al., 1997) или ПЦР праймеров, комплиментарных повторенным участкам генома: микросателлитам - ISSRs (Zietkiewicz et al., 1994), ретротранспозонам - IRAPs (Kalendar et al. 1999), микросателлитам с одной стороны и LTR ретротранспозонов с другой - REMAR (Kalendar et al., 1999), интрон - экзонным соединениям (Weining, Langridge, 1991), генам тРНК (Welsh, McCelland, 1990), 5sPHK (Kolchinsky et al., 1991), а также генам, кодирующим белки с Zn пальцами (Unkles et al., 1992). Альтернативным методом является AFLP, где рестрикционные фрагменты после лигирования с линкером могут быть селективно амплифицированны (Vos et al., 1995). Во всех случаях различия между индивидами будут определяться по наличию или отсутствию соответствующей полосы (бэнда) в паттерне амплификации каждого организма. RAPDs, ISSRs и AFLPs маркеры не требуют предварительных знаний о последовательностях исследуемых видов, и их анализ может быть автоматизирован, что является принципиальным преимуществом перед гибридизационными методами. Так, для организмов с большим или недостаточно изученным геномом AFLP анализ был успешно применен при конструировании генетических карт (Cervera et al., 2001; Parsons, Shaw, 2002). Однако и эти маркеры могут быть не надежны.
RAPD анализ - это один из первых молекулярных методов оценки генетического полиморфизма (Williams et al., 1990). При наличии в популяции двух или более аллелей со значительными частотами (обычно более процента) говорят о внутрипопуляционном генетическом полиморфизме по данному локусу. В его основе лежит случайная амплификация геномной ДНК с использованием коротких олигонуклеотидных праймеров (длиной около 10 нуклеотидов) произвольно выбранной последовательности. При малой длине праймера вероятность нахождения в геномной ДНК двух сайтов на небольшом расстоянии друг от друга и противоположных по ориентации достаточно велика. Продукты ПЦР длиной примерно 400-2000 п.н., как правило, анализируются в агарозном геле. Вариации в паттернах амплификации зависят от произошедших в ДНК мутациях, нарушающих сайт праймера. Если такое изменение ДНК произошло, фрагмент до следующего праймера может быть слишком велик, для того чтобы успешно амплифицироваться. Это вызовет отсутствие определенного фрагмента для данного образца или изменение его размера.
RAPD маркеры позволяют легко и с небольшими затратами времени производить идентификацию даже близко родственных видов и классификацию филогенетических взаимоотношений между видами (Welsh, McCleland, 1990; Svitashev et al., 1998; Klaas, 1998; Sun et al., 1999; Bartish et al., 2000; Blattner et al., 2001). Однако использование RAPD маркеров в филогенетических исследованиях имеет ряд ограничений. Во-первых, для обоснованности (законности) интерпретации данных, полученных на основании RAPD анализа, необходима строгая гомологичность фрагментов ДНК одного и того же размера. Во-вторых, стабильные и надежные результаты получаются в том случае, когда исследуются сравнительно близкородственные виды, и различия в нуклеотидных последовательностях не превышают 10% (Clark, Lanigan, 1993; Espinasa, Borowsky, 1998). В-третьих, как показывает практика, амплификация фрагмента возможна даже при нескольких несовпадениях в нуклеотидных последовательностях праймера и матрицы. К тому же результаты могут быть невоспроизводимы. Поэтому данные RAPD анализа нуждаются в уточнении и дополнении с помощью более надежных методов.
В настоящее время RAPD маркеры используются рядом исследовательских групп, но не являются популярными в виду сложности воспроизведения полученных результатов (Schierwater, Ender, 1993). На основе этого метода созданы другие более совершенные и воспроизводимые маркеры.
Например, SCARs (sequence characterized amplified regions for amplification specific band), этот подход использует последовательности охарактеризованных RAPD маркеров для амплификации специфического бэнда с более длинными праймерами (22-24 п.н.) (Michelmore et al. 1991, Martin et al., 1991). Наличие или отсутствие соответствующего бэнда говорит о существовании вариабельности по данному локусу. Эти маркеры являются, как и RAPD, доминантными, однако могут быть использованы и в качестве кодоминантных, если провести рестрикцию полученных фрагментов мелкощепящей рестриктазой и зафиксировать полиморфизм в денатурирующем гель - электрофорезе или методом SSCP (single strand conformation polymorphism). Это свойство позволяет использовать их в физическом картировании, скринировании геномных библиотек, установлении локус — специфичности, то есть сравнительном картировании и исследованиях гомологии среди близкородственных видов (Filho et al., 2002; Ye et al., 2006).
CAPS (cleaved amplified polymorphic sequences). При использовании данного метода полученные PCR продукты подвергаются рестрикции, и затем определяется полиморфизм рестрикционных фрагментов (Konieczny, Ausubel, 1993). Праймеры для первого этапа ПЦР в данном случае выбираются исходя из существующих последовательностей в банках данных. Это могут быть как геномные, так и кДНК последовательности, а также RAPD маркеры с установленной нуклеотидной последовательностью. То есть, чтобы получить CAPS кодоминантные маркеры и легко детектировать полиморфные сайты, можно провести секвенирование ампликонов группы индивидуумов и, если повезет, обнаружить полиморфный сайт содержащий сайт рестрикции (Laporte, Charlesworth, 2001). Преимуществом данной техники является высокая воспроизводимость, легкость проведения, предсказуемость позиции соответствующего фрагмента, что не требует точного контроля условий электрофореза.
Практическое значение молекулярно-генетических маркеров
Молекулярные маркеры на основе EST последовательностей могут быть использованы и при исследовании структурных и функциональных изменений в геноме, которыми сопровождается полиплоидизация в растительных системах, представленных родами Arabidopsis и Brassica семейства крестоцветных Cruciferae Juss. (Brassicaceae Burnett) (Song et al., 1995), Aegilops L. и Triticum из злаковых Graminae Juss. (Poaceae Bernh.) (Liu et al., 1998). Наиболее важные перестройки, описанные в этом контексте, это обширные дупликации, происходящие в процессе эволюции некоторых видов, в том числе Arabidopsis thaliana (Blanc et al., 2000). В результате аллоплоидизации в некоторых случаях часто наблюдаются такие изменения, как потеря генов, их инактивация или наоборот активирование, иногда за эти процессы ответственны эпигенетические изменения (Kashkush et al., 2002). В эволюционных перестройках четырех элементарных, геномов пшениц (А, В, D, G) большую роль играют мобильные генетические элементы (Dvorak et al., 2004). Детальное изучение синтении гомеологичных хромосом у гексаплоидной пшеницы {Triticum aestivum) с помощью Southern гибридизации EST маркеров набора линий с делециями показало наличие множественных генетических перестроек, касающихся дупликации и делеции локусов (Dvorak et al., 2004). Степень синтении гомологичных хромосом уменьшалась от центромеры к теломерным районам (Dvorak, Akhunov, 2005). Среди 155 исследованных локусов обнаружено 26 делеций, которые произошли в процессе эволюции полиплоидных пшениц. Хромосомы пшеницы были разделены на проксимальный участок, обладающий низкой степенью рекомбинации, и на дистальный - с высокой рекомбинационной способностью, где и было обнаружено большинство делеций (Dvorak et al., 2004). Однако показано, что основные изменения произойти у предков мягкой пшеницы на диплоидном уровне и лишь незначительная часть после аллоплоидизации (Akhunov et al., 2003). Более того, видообразование у растений подвержено процессам популяционного «бутылочного горлышка», что является причиной передачи потомкам только той части полиморфизма (в частности делеций и дупликаций), которая встречалась в популяции предковой формы с наибольшей частотой. Ген На (Hardness), контролирующий твердозерность у мягкой пшеницы и родственных ей видов, является классическим примером, когда вариабельность признака появилась за счет потери генов после аллоплоидизации (Gautier et al., 2000). Было показано наличие множественных генетических перестроек в этом районе в процессе эволюции геномов в полиплоидном организме. Среди них потеря генов Ріпа и Pinb у тетраплоидной твердой пшеницы Triticum durum Desf., произошедшая в результате большой делеции, которая, вероятно, появилась независимо в геномах А и В. Район Hardness гена в геноме D мягкой пшеницы также на 29 kb короче по сравнению с предковым геномом Aegilops tauschii Coss. (син. Ае. squarossa L.). Основным механизмом возникновения всех генетических перестроек полагается неравная (незаконная) рекомбинация (Chantret et al., 2005).
С разработкой методов, генетического картирования на основе молекулярных маркеров появилась уникальная возможность для изучения взаимодействия дифференцированных генов и геномов в гибридном генетическом окружении. Использование молекулярных маркеров в данном случае возможно менее эффективно, но более многостороннее. Практически любая степень дивергенции может быть проанализирована и даже очень небольшой сегмент (результат интрогрессии) может быть детектирован. Более того, этот сегмент может быть отслежен в результате изменения количества и локализации проанализированных маркеров, а размер этого участка подлежит теоретическому анализу, так как основан на определении частоты рекомбинации.
Большинство ранних эволюционных теорий было основано на морфологических и кариологических различиях между организмами. Однако с развитием науки стало очевидным преимущество молекулярных методик, позволяющих изучать детальную генетическую структуру популяций. RFLP маркеры, ДНК секвенирование, множество маркеров, основанных на методе ПЦР, интенсивно используются для реконструкции филогении различных видов. Современные методы позволяют определять спектр генетической вариабельности между организмами, точное время дивергенции различных таксонов, а также произошедшие генетические изменения в процессе видообразования. Усилия современных ученых направлены на установление эволюционной истории различных таксонов и их адекватную классификацию, что особенно важно в случае некорректных морфологических маркеров.
Вследствие доместикации растений, их генетическая вариабельность продолжает сокращаться под давлением отбора по специфическим признакам. Это может приводить к-появлению потомков более уязвимых к болезням, нападениям насекомых и подверженных опасности возникновения продолжительных генетических перестроек в течение длительного времени. С такой ситуацией впервые столкнулись в 1970 году в США, где урожай злаковых был существенно сокращен в виду вспышки эпифитотики листовой ржавчины (Harlan, 1987). Причиной очень широкого распространения данного заболевания послужило интенсивное использование единственного гена, детерминирующего ядерную мужскую стерильность, которая была связана с восприимчивостью к болезни. Таким образом, исследования генетического материала современных с-х растений в сравнении с их предками и родственными видами являются чрезвычайно важными для анализа и расширения биоразноообразия. Такие работы позволят не только установить филогенетические взаимоотношения, но и дадут возможность поиска новых полезных генов, так как ДНК профили отдаленных видов могут содержать новые аллели.
Электрофорез продуктов пцр в агарозном геле, их выделение и очистка
С помощью RAPD маркеров были проанализированы 12 видов рода Iris, принадлежащие к различным филогенетическим группам. В работу также были включены Pardanthopsis dichotoma и Belamcanda chinensis из близкородственных родов. Две наиболее распространенных классификационные системы различаются в положении видов рода Ms, включенных в настоящее исследование (рис. 3.1).
Согласно Родионенко (1988) эти виды принадлежат к 4 подродам - Limniris (Tausch) Spach, Xyridion (Tausch) Spach, Iris и Pardanthopsis (Hance) Baker. Mathew (1989) выделяет Pardanthopsis в отдельный род, а виды подрода Xyridion помещает внутри подрода Limniris. Поэтому вид Pardanthopsis dichotoma был включен в исследование для того, чтобы уточнить его статус и таксономическое положение. Belamcanda chinensis, принадлежащий близкородственному роду, был использован в качестве внешней группы.
В 1961 году Родионенко описал у дальневосточного ириса вильчатого (/. dichotoma) и беламканды китайской (В. chinensis) сходные особенности нектаровыделения. Основываясь на этом факте и некоторых других признаках строения, он высказал предположение о близком родстве этих двух представителей разных родов и возможности получить между ними гибридные формы (Родионенко, 1987). Однако климатические условия Ленинграда не дали возможности исследователю выполнить гибридизацию, она была выполнена Лензом в 1972 году в калифорнийском ботаническом саду (Lenz, 1972). А сам ирис вильчатый был обособлен в самостоятельный род Pardanthopsis Lenz. Обоснованность выделения данного рода до сих пор не подтверждена. В настоящей работе мы провели исследование RAPD маркеров и нуклеотидных последовательностей хпДНК Pardanthopsis dichotoma и представителей рода Iris, которое показало, что этот вид действительно более близок к виду Belamcanda chinensis, чем к другим представителям изученного рода Iris. P. dichotoma (- I. halophila I. ludwigii I. laevigata
При проведении RAPD анализа наиболее принципиальным моментом является выбор случайных праймеров, используемых для амплификации ДНК. Праймеры OPD08, OPD11, OPD13, ОРВ12 успешно использовались ранее для изучения таксономических взаимоотношений дальневосточных видов рода Iris, они давали стабильные, хорошо воспроизводимые, видоспецифичные наборы фрагментов для видов рода Iris при отсутствии внутривидовой и внутрипопуляционной пользу.
RAPD анализ проводился вариабельности (Журавлев и др. 1998), что и определило наш выбор в их по меньшей мере дважды с каждой парой праймеров. Паттерн RAPD фрагментов оставался достаточно стабильным при различной температуре отжига праймеров (36-39 С) и количестве ДНК (10-50 нг на реакцию). Оптимальной температурой отжига была выбрана 36С, исходя из воспроизводимости четкого патгерна бэндов и их интенсивности.
Для оценки индивидуального полиморфизма RAPD фрагментов, амплифицируемых с помощью использованных нами случайных праймеров на генотипах сибирских видов рода Iris, мы анализировали несколько образцов для каждой изучаемой популяции. Во всех случаях наборы амшшфицированных фрагментов были строго специфичны для каждой из популяций. Для исследования межпопуляционного полиморфизма мы включили в анализ образцы из трех различных популяций вида I. lactea и из двух популяции каждого из видов /. biglumis, I. halophila и Z laevigata. Наборы амплифицируемых фрагментов разных популяций мало отличались между собой. Некоторые отличия были обнаружены только между RAPD паттернами, полученными на праймере OPD08 для популяций /. biglumis и на праймере ОРВ12 для популяций /. halophila и /. lactea. RAPD паттерны популяций /. laevigata не отличались для всех четырех праймеров. Таким образом, амплифицируемые с помощью выбранных нами праймеров наборы фрагментов действительно видоспецифичны для сибирских видов рода Iris, а значит, использование этих праймеров отвечает требованиям настоящего исследования.
Оптимизированные условия реакции использовались для анализа генетической вариабельности всех 14 видов растений. Общее количество полиморфных фрагментов, полученных с четырьмя парами десятипуклеотидных праймеров, было большим, однако только четко отличимые на гель-электрофорезе бэнды были учтены в дальнейшей работе, тусклые и нечеткие бэнды не принимались во внимание. На основе этого критерия общее число идентифицированных и использованных для дальнейшего статистического анализа полиморфных фрагментов составило 56. Размер данных фрагментов варьировал от 0.2 до 4 kb. (рис. 3.2).
На основе специфичных RAPD маркеров, полученных после амплификация ДНК ирисов с соответствующими парами праймеров, выявлена высокая степень генетического полиморфизма среди исследованных растений. Для всех 14 видов с помощью используемых в данной работе произвольных праймеров были получены разные паттерны амплификации и установлена межвидовая и межродовая вариабельность. Это говорит об успешном использовании выбранных RAPD маркеров и их высокой разрешающей способности. В результате амплификации ДНК /. ludwigii с праймерами OPD13 получен мономорфный фрагмент (видоспецифичный маркер, рис. 3.2D). Были обнаружены также несколько других специфичных маркеров для различных таксонов. На рис. 3.2С показан фрагмент около 700 п.н. специфичный для бородатых ирисов подрода Iris. В результате амплификации с праймерами ОРВ12 получен фрагмент специфичный для всех ирисов кроме видов подродаXyridon (рис. 3.2В).
Поиск ДНК маркера для реконструкции филогении рода Iris
В настоящем исследовании были определены последовательности trnL интрона и trnLrtrnF межгенного спейсера хлоропластной ДНК для всех 22 сибирских видов ирисов, а также для определения спорной позиции Paradonthopsis dichotoma, последовательности trnLrnF района этого вида также были включены в исследование (Reeves et al. 2001; Genbank-AJ409612). Полученные участки генома соответствовали ожидаемой длине около 500 нп (рис. 3.4а, 3.46).
Полученные фрагменты ДНК были секвенированы.прямым методом. Фрагменты trnL интрона и trnLrnF межгенного спейсера хпДНК /. laevigata, I. sanguinea, І. poianini были проклонированы в плазмиде pBlueScript и потом были установлены их нуклеотидные последовательности, как описано в главе 2. Все полученные последовательности имели отличия. В результате выравнивания последовательностей trnL, интрона были обнаружены 13 делеций и инсерций от 1 до 101 нуклеотида длиной; после выравнивания последовательностей trnLrnF межгенного спейсера - 8 делеций и инсерций от 1 до 15 нуклеотидов длиной (таблица 7, приложение 2). Предположение о произошедших генетических перестройках (инсерциях или делециях) делалось на основе сравнения с последовательностью внешней группы.
Длина trnL интрона варьировала от 371 (/. loczyi, I. tenuifolid) до 508 (/. sibirica, I. sanguined) нуклеотидов, множественное выравнивание состояло из 557 нуклеотидных позиций. Длина trnLrnF межгенного спейсера варьировала от 392 (/. glaucescens, I. ivanovae I. tigridid) до 409 нуклеотидов (Iris biglumis I. laevigata I. lactea I. pseudacorus), множественное выравнивание состояло из 424 нуклеотидных позиций.
Среди всех изучаемых видов выравнивание последовательности интрона показало 92 вариабельных характеристики (79 нуклеотидных замен и 13 делеций и инсерций), из которых 53 являются парсимонно информативными позициями, 280 нуклеотидных позиций оставались инвариантными. Выравнивание последовательности межгенного спейсера показало 191 вариабельных характеристики (183 нуклсотидные замены и 8 делеций и инсерций), из которых 167 парсимонно информативньтх позиции, 191 позиция оставалась инвариантной.
Соотношение транзиций к трансверсиям = 1.57 для интрона, = 1.04 для межгенного спейсера.
Исследованные районы хлоропластной ДНК были AT - богатыми (нуклеотидный состав: А - 39.1%, С - 16.1%, G - 19.5%, Т - 25.3% для последовательностей trnL интрона и А - 29.6%, С - 20.1%, G - 15.7%, Т - 34.5% для последовательностей trnLrnF межгенного спейсера).
Попарные нуклеотидные различия последовательностей, исключая делеций- и инсерций, были посчитаны с помощью программы MEGA 3.1 (Kumar et al., 2004). Для trnL интрона они составили от 0,25% (/. lactae, I. pallasii) до 15.17% (/. humilis, I. sibirica), в среднем составляя 4.65%. Для межгенного спейсера нуклеотидные различия варьировали от 0.74% (/. lactae, I. pallasii) до 38.81% (Z ivanovae, I. sibirica) в среднем составляя 19.38%.
Филогенетический анализ
Филогенетический анализ был проведен с использованием нуклеотидных последовательностей каждого района отдельно вследствие возможно различной скорости эволюции и разного нуклеотидного состава. Инсерций и делеций не были включены в анализ либо учитывались как единичная нуклеотидная замена. В дальнейшем они использовались для подтверждения топологии дерева. Топологии деревьев, построенные с помощью метода максимальной парсимонии, максимальной вероятности и метода соединения ближайших соединений, были совместимы, т.е. каких - либо значительных отличий в топологии деревьев обнаружено не было. Коэффициент поддержки внутренних ветвей (Felsenstein, 1985), вычисленный на основе 1000 реплик, был высок даже в анализе отдельных последовательностей. Топологии деревьев, полученные на основе сравнения последовательностей trnh интрона и trriLrnF межгенного спейсера, были подобны с некоторыми исключениями в позиции видов внутри отдельных ветвей. Опираясь на полученные филогенетические деревья и распределение инсерций и делеций, предполагая мало вероятным событие, что одна и та же инсерция или делеция произойдет несколько раз в различных ветвях независимо, все виды на филогенетических деревьях можно сгруппировать в 8 кластеров (рис. 3.5): 1 - Z bloudowii, I. potanini, I. humilis; 2-І. ivanovae, I. tigridia, I. glaucescens; 3-І. tenuifolia, I. loczyi, I. ventricosa; 4-І. halophila, I. ludwigii; 5 -I. ruthentica, I. uniflora; 6-І. laevigata, I. pseudacorus; 7-І. pallasii, I. lactea, I. biglumis; 8 -I. sibirica, I. setosa, и I. sanguinea.
Схема группирования изученных видов в кластеры соответствует существующим классификациям. Виды растений всех кластеров, кроме кластера 1 имеют суперкластерспецифическую инсерцию в 4 п.н. в trnLrnF районе межгенного спейсера. Виды ирисов, входящих в кластеры 3-8, имеют 2 специфические делеций размером 6 п.н. в последовательности trriL интрона. Сибирские ирисы кластеров 6-8 объединяются наличием специфической делеций размером 2 п.н. в последовательности trriLrnF межгенного спейсера. Каждый из кластеров 2, 3, 5, 6, 7, 8 имеет от одной до шести кластерспецифичных делеций или инсерций в анализируемых последовательностях. Виды ирисов /. tigridia, I. glaucescens, I. halophila имеют от одной до двух видоспецифичных делеций или инсерций (таблица 7).
Только две делеций либо инсерций были общими для видов из различных кластеров (не показаны в таблице 7). Виды рода Iris, составляющие кластеры 1,3,4, имеют одну специфическую инсерцию размером 1 нуклеотид в районе trnLrnF межгенного спейсера, однако, виды кластера 2 такую инсерцию не имеют (приложение 2). /. glaucescens из кластера 2 имеет делецию в 6 п.н., специфичную для кластеров 3-8. Она, вероятно, появилась независимо, возможно, вследствие специфической структуры последовательности района. В случае, когда некоторые последовательности имели меньшую инсерцию или делецию в районе, где у других видов эта перестройка больше, полагалось, что вторые имеют .только большую перестройку, а не две - меньшую и большую.
