Введение к работе
Актуальность проблемы. Изучение субтеломерных районов хромосом является актуальной задачей, решение которой позволит расширить современные представления о структурно-функциональной организации и эволюции генома эукариот. Субтеломерные участки хромосом примыкают к теломерам, и выполняют ряд важных функций — отвечают за позиционирование хромосом в интерфазе, оказывают влияние на их поведение и митозе и мейозе (Louis, 1995; Feldman et al., 1997). Особенно важным является изучение структурной организации и дивергенции субтеломерных участков хромосом в процессе эволюции у аллополиплоидов — это представляет огромный интерес для понимания функционирования полиплоидного генома. Виды трибы Triticeae, которая содержит большое количество природных аллополиплоидов с известным происхождением и для которой получен ряд искусственных аллополиплоидов, являются удобным объектом для изучения организации и эволюции полиплоидного генома.
На настоящий момент благодаря реализации проектов по секвенированию геномов детально охарактеризована структура субтеломерных участков хромосом человека (Riethman et al., 2001,2004), некоторых хромосом риса Oryza sativa (Yang et al., 2005) и Arabidopsis thaliana (Kuo et al., 2006). Субтеломерные районы хромосом этих видов имеют ряд характерных особенностей, таких как наличие множественных сегментальных дупликаций, присутствие хромосом-специфичных тандемных повторов и мобильных элементов, а также генов.
О структуре субтеломерных участков хромосом Triticeae и других видов растений с большим размером генома известно гораздо меньше в связи с тем, что в настоящее время полная нуклеотидная последовательность их геномов неизвестна. Однако ряд работ по клонированию и анализу отдельных последовательностей ДНК, локализованных на концах хромосом, показал, что субтеломерные районы у разных таксонов содержат различные семейства высокоповторяющихся тандемных последовательностей ДНК, которые часто являются видоспецифичными и геномспецифичными в аллополиплоидном геноме (Jones, Flavell, 1982; Ohtsubo et al., 1991; Wu, Tanksley, 1993a; Vershinin et al., 1995; Salina et al., 2006). Тандемно организованные субтеломерные повторы чередуются с дисперсными уникальными и низкокопийными последовательностями, образуя специфичные комбинации последовательностей ДНК на концах хромосом (Sykorova et al., 2003; Alkhimova et al., 2004).
Кроме того, показано, что субтеломерные участки хромосом подвержены изменениям в процессе эволюции, сохраняя при этом свою функцию. Например, при образовании природных и искусственных аллопополиплоидов пшеницы отмечены обширные геномные перестройки в этих районах, а именно делеции и амплификации различных семейств субтеломерных тандемных повторов (Jones, Flavell, 1982; Zhang et al., 2002; Salina et al., 2004).
Изучение структурной организации субтеломерной ДНК мягкой пшеницы и эволюции отдельных последовательностей, входящих в ее состав, в ряду диплоидных и полиплоидных видов Triticum и Aegilops, как природных, так и искусственно синтезированных, существенно расширит имеющуюся информацию о структуре субтеломер злаков и позволит определить вклад
различных последовательностей в формирование и дивергенцию этих районов
хромосом.
Цель и задачи работы.
Целью данной работы является: изучение структурной организации субтеломерных участков хромосом и оценка вклада различных последовательностей ДНК, присутствующих в субтеломерных районах, в дивергенцию геномов родов Triticum L. и Aegilops L. В связи с этим были поставлены следующие задачи:
-
Сравнительное исследование структурной организации ВАС-клонов Triticum aestivum, содержащих субтеломерные маркеры Speltl и Spelt52, методами ПЦР-анализа, Саузерн-блот и дот-гибридизации, флуоресцентной гибридизации in situ и субклонирования;
-
Аннотирование и анализ первичной структуры двух ВАС-клонов мягкой пшеницы ВАС_2050О8 и ВАС_2383А24, маркированных субтеломерными повторами Spelt52 и Speltl, соответственно;
-
Проведение филогенетического анализа последовательностей ДНК, которые являются компонентами субтеломерных районов хромосом Triticum и Aegilops;
-
Изучение распределения ДНК-транспозона Caspar и LTR-ретротранспозона Fatima на хромосомах диплоидных и полиплоидных видов Triticum и Aegilops;
-
Поиск маркеров к вариабельным участкам субтеломерных районов хромосом для оценки уровня геномных изменений, происходящих в процессе эволюции и при образовании аллополиплоидов Triticum-Aegilops.
Научная новизна и практическая значимость работы.
-
Показано, что использование повторяющихся последовательностей Speltl и Spelt52 в качестве зондов позволяет эффективно отбирать ВАС-клоны, содержащие субтеломерные последовательности, из геномных ВАС-библиотек мягкой пшеницы Triticum aestivum.
-
Впервые были получены данные о первичной структуре субтеломерных участков хромосомы ЗВ и длинного плеча хромосомы 4В мягкой пшеницы, содержащих маркеры Speltl и Spelt52.
-
Получены данные о роли ДНК-транспозона Caspar в формировании субтеломерных районов хромосом у видов Triticum и Aegilops.
-
Впервые показан значительный вклад LTR-ретротранспозона Fatima, входящего в состав субтеломерной ДНК, в дифференциацию генома В тетраплоидных и гексаплоидных видов пшениц, и диплоидного предшественника генома В Aegilops speltoides.
-
Впервые охарактеризованы протяженные ряды тандемных повторяющихся последовательностей Speltl и Spelt52 у Triticum aestivum.
-
Получен цитогенетический маркер (ВАС_2383А24), который позволяет выявлять хромосомы или хромосомные транслокации с участием генома В у тетраплоидных и гексаплоидных видов пшениц, и Aegilops speltoides в различном геномном окружении.
Положения, выносимые на защиту.
-
В формирование субтеломерных районов хромосом Triticum и Aegilops внесли вклад как тандемные повторяющиеся последовательности Speltl и Spelt52, так и мобильные элементы - ДНК-транспозон Caspar и LTR-ретротранспозон Fatima.
-
ДНК-транспозоны семейства Caspar являются характерной компонентой субтеломерных районов хромосом диплоидных и полиплоидных видов Triticum и Aegilops за счет того, что содержание элементов Caspar в субтеломерных районах существенно выше, чем в других районах хромосом.
-
Семейство gypsy LTR-ретротранспозонов Fatima внесло существенный вклад в дивергенцию генома В пшеницы за счет появления и амплификации в процессе эволюции геном-специфичных вариантов семейства Fatima у его предполагаемого предшественника Aegilops speltoides.
Апробация работы. Результаты настоящей работы были представлены на XLII Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2004 г.); Международной Конференции «Генетика в России и мире», посвященной 40-летию Института общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН (Москва, 2006 г.); Международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (Томск, 2007 г.); VI Международной конференции по биоинформатике, регуляции и структуре генома (Новосибирск, 2008 г.); XI Международном симпозиуме по генетике пшеницы (Брисбен, Австралия, 2008 г.); Российско-французской конференции "Проблемы и перспективы биотехнологии растений" (Новосибирск, 2008 г.); Объединенном симпозиуме 19* ITMI/ 3rd COST Tritigen (Клермон-Ферран, Франция, 2009 г.).
Публикации по теме диссертации. По теме диссертации имеется 14 публикаций, из них 3 статьи в рецензируемых отечественных и зарубежных журналах и 1 — в сборнике трудов международной конференции. Вклад автора. Основные результаты получены автором самостоятельно. Подготовка препаратов для флуоресцентной гибридизации in situ и анализ препаратов проводились к.б.н. И. Г. Адониной. Отбор ВАС-клонов из геномной библиотеки Triticum aestivum сорта Ренан проводился д.б.н., проф. Е.А. Салиной, определение нуклеотиднои последовательности ВАС-клонов проводилось в лаборатории Б. Шалуба (INRA, Франция).
Структура и объем диссертации: Диссертация содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, заключение, выводы, список цитируемой литературы. Работа изложена на 192 страницах, содержит 28 рисунков, 8 таблиц, 8 приложений, список цитируемой литературы включает 247 ссылок.
