Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1. Методы анализа организации эукариотического генома в изучении половых хромосом млекопитающих 10
1.1.1. Сравнительный анализ рутинно- и дифференциально-окрашенных хромосом и хромосомный пэйнтинг 1 1
1.1.2. Сравнительное генетическое картирование и сравнительный анализ первичной нуклеотидной последовательности 13
1.2. Развитие представлений об эволюции половых хромосом 20
1.3. Организация и эволюция половых хромосом млекопитающих 25
1.3.1. Консерватизм генного состава Х-хромосомы 25
1.3.2. Эволюционные страты и последовательность эволюционных изменений Х-хромосомы 30
L3.3. Псевдоаутосомиые районы половых хромосом 33
1.3.4. Избегающие инактивации гены дифференцированных районов Х-хромосомы 37
1.3.5. Особенности дифференцированного района Y-хромосомы 42
1.3.6. Генетический и биологический диморфизм 44
1.3.7. Молекулярные механизмы инактивации Х-хромосомы 46
1.4. Группа обыкновенных полевок рода Microtus 49
Итоги обзора литературы 53
ГЛАВА 2. Материалы и методы 54
2.1. Среды, стоковые растворы, ферменты 54
2.2. Экспериментальные животные 54
2.3. Микробиологические методы работы 55
2.3.1.Приготовление компетентных клеток Е.соН 55
2.3.2.Трапсформация E.coli 55
2.4. Скрининг геномной фаговой библиотеки 56
2.5. Методы выделения ДНК 57
2.5.1.Вьілсл сние плазмидной ДНК... 57
2.5.2.Выделение ДНК фагов 57
2.6. Методы работы с рскомбипянтной ДНК 58
2.6.1.Общие методы клонирования 58
2.6.2.Получсние направленных делений 58
2.7. Саузерн блот-гибридизацня фаговых клонов 59
2.8. Выделение тотальной РИК из органов животных и культур клеток , 60
2.9. Синтез первой цепи кДНК 61
2.10. Полимсразная цепная реакция 61
2.11. Флуоресцентная гибридизация in situ 62
2.12. Определение нуклеотидной последовательности ДНК 64
2.13. Контекстный анализ последовательности ДНК 65
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 66
3.1. Получение зондов избегающих инактивации генов 66
3.2. Флуоресцентная in situ гибридизация фаговых клопов на мстафазных хромосомах пяти видов полевок 73
3.3. Контекстный анализ нуклсотилных последовательностей фаговых клонов 79
3.4. Анализ порядка расположения генов и возможных путей эволюции Х-хромосомы полевок группы 'arvatis* 85
3.4.1. Реорганизация Х-хромосом пяти видов полевок рода Microtus 89
3.4.2. Сравнительный анализ Х-хромосом полевок и других видов млекопитающих 94
3.4.3. Анализ расположения избегающих инактивации генов на Х-хромосомах полевок 106
Заключение 109
Выводы 114
Список литературы 115
- Сравнительное генетическое картирование и сравнительный анализ первичной нуклеотидной последовательности
- Избегающие инактивации гены дифференцированных районов Х-хромосомы
- Выделение тотальной РИК из органов животных и культур клеток
- Флуоресцентная in situ гибридизация фаговых клопов на мстафазных хромосомах пяти видов полевок
Введение к работе
Х-хромосома плацентарных млекопитающих, будучи одной из самых изученных во многих аспектах хромосом, еще хранит d себе большое количество загадок. Ее организация, функционирование и эволюция неразрывно связаны с уникальным механизмом регуляции экспрессии генов — инактивацией одной из Х-хромосом у гомогаметных самок (Х-инактивацней). Несмотря на большой прогресс, достигнутый за последнее десятилетие, в понимании того, как разворачивается комплексный процесс инактивации Х-хромосомы, ряд ключевых моментов все еще остается неясным. До сих пор не известен конкретный механизм передачи сигнала инактивации от основного гена центра инактивации Х-хромосомы (Л7С) — XIST (inactive X-chromosomc specific transcript) к ииактивируемым генам. Несмотря на то, что по данным секвенирования геномов человека и мыши для обоих видов установлена почти двукратная разница по составу LINE1 элементов в аутосомах и половых хромосомах, не получено пока никаких конкретных данных о том, каким образом в распространении сигнала инактивации участвуют LINEI элементы.
Выявление избегающих инактивации генов у плацентарных млекопитающих привело к выводу, что Х-ипактивация не носит, как предполагали раньше, тотаїьиого характера. Эти данные добавили новые акценты в картину эволюции половых хромосом и изучение моноаллелыюй экспрессии генов Х-хромосомы. Анализ регуляторних областей избегающих инактивации генов и генов, подверженных ей, показал, что на данный момент не представляется возможным идентифицировать ген как избегающий инактивации, либо инактивирусмый на основе последовательностей промоторов генов. Эволюционные изменения структурной организации Х-хромосомы могут вести к изменению функциональных параметров ее генов, в том числе и статута экспрессии генов на неактивной X-хромосоме. Однако конкретные факторы, влияющие па это, не установлены.
Для многих видов плацентарных млекопитающих характерна структура X-хромосомы человека. Являясь самой изученной не только в плане состава и порядка расположения геноп, по и их транскрипционных характеристик, X-хромосома человека служит своеобразным стандартом для сравнения с X-хромосомами других видов. Второй по изученности является Х-хромосома мыши,
которая имеет шансы оказаться самой перестроенной среди Х-хромосом плацентарных. По последним данным эти виды также значительно различаются по количеству генов, избегающих инактивации. Однако не известно, насколько перестроен!гость Х-хромосомы мыши или различие в морфологии Х-хромосом человека и мыши ответственны за отличия в статусе инактивации генов у этих видов. Поэтому необходимо привлечение новых видов в координированные исследования по изменению структурной организации Х-хромосомы и регуляции экспрессии ее генов.
Секвеиирование полных геномов человека и мыши лишь оформило в некие рамки всю невообразимую сложность организации геномов высших организмов. Можно предположить, что в ближайшем будущем внимание исследователей в области сравнительной геномики будет сконцентрировано па изменениях в группах близкородственных видов. Комбинация данных но локализации генов, их хромосомному окружению, нуклеотидиым последовательностям и транскрипционной информации в группах родствсппых видов позволит установить факторы, ответственные за тот или иной механизм регуляции и исключительно детально проследить эволюцию регуляторних элементов генома.
В представляемой работе мы использовали группу обыкновенных полевок {'arvalis') рода Microtits, состоящую из четырех близкородственных видов, и один вид из наиболее близкой к ним группы 'agrestis' для изучения эволюционных преобразований их Х-хромосом с помощью сравнительного картирования методом флуоресцентной ш situ гибридизации (FISH) иа мстафазных хромоосмах. Для сравнительного картирования Х-хромосом полевок были выбраны гены, избегающие инактивации на неактивной Х-хромосоме человека и, в некоторых случаях, мыши. Картирование этих генов позволяет устаповитг. соответствие по порядку генов структуры эухроматииовых районов Х-хромосом полевок базовой структуре хромосомы человека, либо перестроенных хромосом более близких мышевидных родственников (мышь, крыса, некоторые другие грызуны) и оценить в сравнении с ними распределение в Х-хромосомах кластеров или районов, обогащенных избегающими инактивации генами.
s ЦЕЛИ и ЗАДАЧИ исследования. Цель данной работы - выявление степени и характера реорганизации Х-хромосом пяти близкородственных видов полевок (род Microtus) в сравнении с Х-хромосомамн человека и мышевидных грызунов. Для достижения цели были поставлены следующие конкретные задачи:
Получить зонды генов, избегающих Х-инактивации у человека и мыши.
Выделить геномные клопы полевок, содержащие ортологи избегающих инактивации генов человека и мыши.
Осуществить с помощью FISH локализацию клонов полевок, содержащих гепы, ортологичные избегающим инактивации генам человека и мыши, на метафазные хромосомы полевок M.rossiaemeridionalis, M.arvalis, M.kirgisorum, M.transcaspicus и M.agrestis.
Проанализировать порядок расположения генов на Х-хромосомах пяти видов полевок и определить предковый для группы 'arvalis'iwu хромосомы.
Провести сравнение порядка генов предковой Х-хромосомы обыкновенных полевок с порядком генов Х-хромосом человека и мышевидных грызунов (мыши, крысы). Проанализировать распределение избегающих X-инактивации генов па хромосомах этих видов.
Научная новизна. Впервые на хромосомах пяти видов полевок рода Microtus локализованы восемь избегающих Х-инактивацин у человека генов Eif4c, Rab9, Zfx, Crsp2, Utxl, Xel69, Sbl.8, Nap!l3, и два гена второго псевдоаутосомного района человека Sybil и Spry3, Сравнительный анализ локализации десяти новых и пяти картированных рапсе генов у обыкновенных полевок позволил выявить новые перестройки и уточнить границы определенных ранее инверсий, имевших место в ходе эволюции Х-хромосом полевок. Впервые установлено, что по порядку генов Х-хромосомы M.kirgisorum и M.arvalis наиболее близки к предковому для группы 'an'alis' типу Х-хромосомы. Впервые проведено сравнение порядка генов на X-хромосомах обыкновенных полевок с порядком генов на Х-хромосомах мыши, крысы, других грызунов. Выведена предковая Х-хромосома семейства Muridae и предложена схема возможных перестроек, разделивших Х-хромосомы человека, полевок и крысы.
Практическая ценность. Полученные в работе результаты лягут в основу для изучения статуса Х-инактивации картированных генов и механизма
осуществления регуляции экспрессии этих генов. Проведенный анализ предоставил дополнительную информацию о консервативных кластерах на X-хромосомс, и позволил более точно оценить степень реорганизации Х-хромосомы у близкородственных видов полевок, что в целом, вносит вклад в понимание закономерностей эволюции половых хромосом и всего генома.
Лпроьлция работы. Материалы диссертации были представлены на 6-ой Путинской школе-коиференции молодых ученых "Биология — наука XXI века", Пушимо, 2002, Международном симпозиуме по проблемам мейоза, Санкт-Петсрбург, 2003, семинарах и отчетных сессиях Института цитологии и генетики СО РАН.
Публикации. По материалам диссертации автором опубликовано две научные статьи в отечественной и зарубежной печати.
Вклад автора. Основная часть экспериментальных работ и анализ полученных данных проводился автором самостоятельно. Л.Кэррол (UMMS, Worcester, USA), М.Матараззо (IGB, Naples, Italy) и С.Павловой были выбраны и предоставлены праймеры для части генов. Скрининг геномной библиотеки, анализ полученных клонов, их субклонировапие и частичное секвенировапие проводились совместно с Л.И. Шевченко. Препараты для FISH получены Н.В. Рубцовой. Основная часть гибридизациониых in situ экспериментов проведена П.Л. Мазурок. Совместно с Н.А. Мазурок автором проводилась обработка данных FISH экспериментов. Контекстный анализ нуклеотидных последовательностей проводился совместно с Е.А. Елисафенко.
Сравнительное генетическое картирование и сравнительный анализ первичной нуклеотидной последовательности
Первая генетическая карта была построена в 1913 году Стертсвантом и состояла из 5 генов, расположенных в линейном порядке вдоль Х-хромосомы плодовой мушки Drosophila melanogaster. Следующее столетие ознаменовалось завершением проекта "Геном человека", в результате которого не только была прочитана нуклеотидпая последовательность всей ДНК человека, но и получили развитие многие быстрые и эффективные методы анализа генома.
Два тина генных карт строятся у млекопитающих: (1) генетические карты (карты сцепления или рекомбинации), основанные на частоте мейотических обменов между сцепленными полиморфными маркерами у гибридных потомков; (2) физические (цитогеистические) карты. Последние основаны на хромосомной локализации с использованием гибридных панелей соматических клеток и RH (radiation hybrid) панелей, гибридизации in situ, транслокациопно-дслецнонного анализа и молекулярных карт перекрывающихся клонов (clonc-contig maps). При построении карт используют три типа маркеров. Для межвидовых исследований, особенно изучения преобразований хромосом эволюционпо далеких видов, используют высокогомологичные последовательности первого типа, к которым относятся кодирующие гены. Маркеры второго и третьего типов — это различные типы повторенных последовательностей, которые используют для построения родословных в семейных, популяционпых и внутривидовых исследованиях.
Каждый метод картирования имеет свою область применения и свои ограничения. Так, при картировании с помощью RH панелей и панелей гибридов соматических клеток получают ограниченную информацию о порядке генов и возникают ошибки из-за перестроек в хромосомах, вызванных облучением. При создании коптигов бактериальных (ВАС), Р1-фаговых (РАС) дрожжевых и (YAC) хромосом некоторый уровень химеризма тоже становится причиной возникновения ошибок. Поэтому такие большие клоны желательно предварительно нанести на цитогенетическую или генетическую карты вида. Цитогепстическое картирование с помощью флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) имеет преимущество визуализации интактных хромосом, хотя и ограничено степенью их конденсации и размером сигнала гибридизации. В последнее время высокий уровень разрешения позволяет картировать такие небольшие уникальные зонды как фрагменты кДНК размером около I тип. Однако оптимальным, очевидно, являются большие последовательности, например, обычные фаговые клоны на основе Х-векторов с размером вставки 10-20 тин. Метод позволяет предсказывать небольшие перестройки в переделах одного—двух бэндов и является идеальным для сравнительного картирования видов с небольшим количеством локализованных маркеров.
С помощью более точных методов картирования было показано, что при сохранении определенного набора генов в Х-хромосоме млекопитающих in to(o их порядок не столь консервативен. В то же время было подтверждено, что для многих видов характерна базовая структура Х-хромосомы человека (O Brien et al,, 1999). Сравнительное картирование Х-хромосом отдаленных видов таких, как мышь и человек, привело к выделению консервативных по порядку генов сегментов (Amar et al., 1988; Blair et al., 1994; DcBry and Seldin, 1996). С увеличением количества локализованных генов в хромосомах разных видов и с увеличением числа исследованных видов размеры консервативных сегментов в X-хромосомах млекопитающих постепенно уменьшаются. Число
внутрихромосомных перестроек, изменивших порядок генов относительно такового в Х-хромосоме человека, у представителей разных таксонов неодинаково. Среди исследованных видов в большей степени положение генов изменилось в Х-хромосоме мышей (род Mits), и некоторых представителей парнокопытных из семейства Bovidea. В некоторых случаях число перестроек п Х-хромосоме не коррелирует с уровнем реорганизации кариотипа в целом. Так, в кариотнпах парнокопытных семейства Bovidea при относительной консервативности аутосом Х-хромосома весьма перестроена (Hayes, 1995; Hassanane et al., 1998), у собачьих (сем. Canidae) и гиббоновых (сем. Pongidae) наблюдается обратная ситуация (Yang ct al., 1999; Everts et al., 2002; Jauch ct al., 1992; Nic ct al., 2001). Х-хромосома крысы, в отличие от мышиной Х-хромосомы, в болыпси степени сохранила порядок генов Х-хромосомы человека при значительной реорганизации относительно человеческого кариотипа аутосом у обоих представителей подсемейства Muridae (DeBry, Seldin, 1996; Kuroiwa ct al., 1998; 2001; Stanyon, 1999; Yang et al., 2000; Cavagna et al., 2002). В настоящее время трудно сказать, что стоит за этими фактами. Однако, в связи с многочисленными данными о роли повторенных и мобильных элементов в возникновении перестроек, а также данными о разнице количества L1NE-элсментов и аутосомах и половых хромосомах человека и мыши (Mouse Genome Sequence Consortium (MGSC), 2002), представляет интерес исследование состава и распределения подобных повторенных последовательностей в аутосомах и X-хромосомах вышеназванных видов.
До недавнего времени обсуждение вопроса природы эволюционного консерватизма ассоциаций или сцепления аутосомных генов носило достаточно спекулятивный характер. Ряд авторов считал, что наличие крупных аутосомных консервативных районов синтсниых генов у многих филогенетически далеких видов больше свидетельствует в пользу участия естественного отбора в поддержании этих генных ассоциаций, чем просто стохастических процессов (Rabin et al., 1986; Serov et al., 1991). Однако для подтверждения этих гипотез необходима более обширная информация, как о консерватизме той или иной группы сцепления у представителей разных таксонов, так и о поддержании ее среди видов одной таксономической группы.
Вопросы онтогенетических или функциональных взаимодействий практически никогда не обсуждаются в аспектах одной пары хромосом. 13 определенной степени половые хромосомы представляют здесь исключение, хотя, возможно, и благодаря своей большей изученности (Lahn, Page, 1997; Wu, Xu, 2003). Было установлено, что половина всех генов человека, специфически экспрессируюшихся в сперматогониях, локализована в Х- или Y-хромосомах (Wang ct al., 2001). Х-хромосома в целом обогащена так называемыми SRR (sex-and reproduction-related) генами (Saifi, Chandra, 1999). По, в общем, принципы, объясняющие объединение генов в хромосомы, до сих пор не выяснены. И на данный момент хромосомы представляются набором в лучшем случае крупных кластеров генов (таких как МНС и Нох кластеры) с очень разной онтогенетической регуляцией. Пионерные работы по анализу транскрипции у дрожжей и человека показали, что в целом по геному прилегающие гены координировано регулируются гораздо чаще, чем это можно было бы ожидать на основе случайного распределения (Kruglyak and Tang, 2000; Lercher et al., 2002).
Очевидно, что более детальную информацию о структуре, возможной функции или эволюционном изменении функциональной специфичности какого-либо компонента генома можно получить па уровне сравнения пуклеотидных последовательностей генов, геномных фрагментов или целых геномов интересующих организмов. К 2000 году было секненировано более 30 геномов разных представителен царств бактерий, архсбактерий и эукариотичсских организмов. В 2002 году был завершен "черновой" вариант емкпепса генома мыши (MGSC, 2002). Трудно переоценить значение гигантской работы по секвестрованию и сравнению геномов человека, мыши и других организмов для понимания закономерностей эволюционных изменений наследственной информации живых организмов.
Избегающие инактивации гены дифференцированных районов Х-хромосомы
Первыми обнаруженными генами Х-ДР, избегающими инактивации оказались гены человека, расположенные вблизи ПАРІ, в частности, в районе Хр22.3. Для многих было показано наличие Y-гомологов, что, как уже обсуждалось, является свидетельством остаточной гомологии прото-ПЛР. Некоторые из них были перечислены при рассмотрении эволюционного стратифицирования Х-хромосомы. Здесь обозначим некоторые детали. В районе Хр22.3 кроме гена STS, частичное избегание инактивации которого было установлено с помощью анализа белкового полиморфизма еще в 1979 году, два других гена - KALP, участвующий в манифестации синдрома Кальмана и GS1X - ген с неизвестной функцией -избегают инактивации (Shapiro ct.al. 1979, Franco et al., 1991, Yen et al., 1992). Bee три гена имеют гомологичные последовательности на Y-хромосомс, по для генов STS и KALP — это нефункциональные псевдогены. Ген ZFX, кодирующий белок Х-хромосомы, содержащий домен "цинковые пальцы", локализован несколько дальше от ПЛР1 в районе Хр22.1, имеет функциональный Y-гомолог и тоже избегает инактивации (Schneider-Gadickc ct al., 1989). Ген RPS4X- рибосомальиый белок S4 на Х-хромосоме - один из немногих избегающих инактивации генов, локализованных на длинном плече Х-хромосомы в районе Xql3, также имеет функциональный Y-гомолог (Fisher ct al,, 1990). Однако Y-гомологи двух последних генов отличаются от Х-партнсров по нуклеотидным последовательностям колирующих областей. Для пары генов ZFX/ZFYустановлена повсеместная экспрессия гомологов, но не известно насколько они функционально взаимозаменяемы (Disteche, 1995). Продукт гена RPS4Y у мужчин, как и ожидалось, является компонентом рибосом, но его вклад в совокупный продукт RPS4X/RPS4Y меньше, чем 50% (Watanabc ct al., 1993). Еще ряд генов, избегающих Х-пактивацни и имеющих гомологи на Y-хромосоме, был обнаружен на коротком плече Х-хромосомы. Однако были найдены гены, избегающие инактивации, и без Y-гомологов, например, ген UBE1, кодирующий убиквитин-активирующий фермент I, и ген SBL8 - белок семейства SMC, участвующий в сегрегации хромосом (Brown, Willard, 1989; Miller, Willard, 1998). Складывается впечатление, что па Х-хромосоме человека, кроме двух нетипичных представителей ПАР2, нет генов, которые бы имели полноценные Y-гомологи и при этом инактивировались. Эти факты свидетельствуют в пользу модели эволюции половых хромосом с первоначальным событием мутации па Y-хромосоме и последующим подключением Х-гена к системе инактивации.
Гены, ииактивируемые на Х-хромосоме и имеющие гомологи в Y-хромосоме, были выявлены у мыши. Кроме того, неожиданно оказалось, что некоторые человеческие гены, избегающие Х-инактивации, у мыши ипактивируются (Табл. 1.2). Мышиные гены Zfx и Ubel инактиваируются и имеют Y- гомологи, причем UbeYI, находится между Zfyl и Zfy2. Однако, вес три Y-гена - это специфические трапскрипты, экспрессирующиеся в семенниках (для гена UbeYI позже была показана экспрессия в мозге) и, следовательно, не являющиеся эквивалентными своим Х-гомологам (Kay ct al., 1991; Mitchell ct al., 1991; Xu ct al., 2002). Таким образом, мутация Y-аллеля привела в случае этих генов к функциональной диверсификации Х- и Y-гомологов. Для них, как обсуждает Грэйвс, возможны оба
Масштабная оценка статуса экспрессии генов иа неактивной Х-хромосоме человека стала возможна благодаря успеху в секвенироваиии генома человека и некоторым особенностям методического подхода (Carrel ct al., 1999). Первый "профиль Х-ииактивации" включал данные о статусе инактивации 224 X-специфических транскриптов, которые с учетом информации еще по 23 генам представляли анализ экспрессии более 10% всех генов хромосомы. Для 34 транскриптов было установлено избегание инактивации на неактивной X-хромосоме. Их распределение по хромосоме оказалось неслучайным — 31 траискрипт локализован на малом плече Х-хромосомы. Даже сели исключить из оценки кластер генов, которые составляли прото-ПАР современных плацентарных, количество генов избегающих инактивации в малом плече (—21%) оказывается значительно больше, чем в большом ( 3%).
У мыши пока известно семь избегающих Х-ипактивании генов (Рис. 1.2) (Disteche ct al., 2002). В целом создастся впечатление, что у мыши Х-хромосома более инактивировапа. Интересно, что один из избегающих инактивации генов мыши - Smcx(Xcl69) изначально инактивирустся, а затем в онтогенезе реактивируется. Вероятно, это объясняется отсутствием специфических последовательностей, необходимых для поддержания неактивного состояния (Lingenfeltcrctal., 1998).
По сравнению с последовательным расположением эволюционных страт в X-хромосомс человека, а также многих других млекопитающих, имеющих аналогичную базовую структуру (O Brien et al., 1999), порядок соответствующих районов в хромосоме мыши значительно изменен (Рис. 1.2). Насколько этот факт объясняет меньшее количество генов, избегающих инактивации, можно будет с уверенностью сказать только после систематического изучения статуса генов, аналогичного тому, которое было проведено для человека. Тем не менее, данные о том, что избегающих инактивации генов у мыши может быть действительно меньше, находят подтверждение в том факте, что по сравнению с тяжелой формой проявления Х0-генотипа у человека, Х0-самки лабораторных мышеи фенотипически нормальны и плодовиты, хотя средний размер помета у них в два раза меньше обычного (Ashworth et al., 1991; Zinn ct al., 1993).
В Х-хромосоме человека в отличие от мышиной хромосомы центр X-инактивации, содержащий ген XIST, отделен от малого плеча центромерой. Эксперименты на полевках рода Microtits, хромосома которых содержит большие блоки гстсрохроматипа, показали, что Л75Т-РНК не распространяется на них (Duthic ct al., 1999). Центромера мышиной Х-хромосомы также не связывается с РНК. Однако в случае транслокационных соединений мышиной Х-хромосомы с аутосомои и в случае локализации renzXist на аутосомс у трансгенпых мышей Xist-РПК распространяется по аутосомс (Duthie et al., 1999; Lee, Jaenisch, 1997). К сожалению, показать распределение XIST по человеческой Х-хромосоме не удается, так как эта РНК не остается связанной с мстафазными хромосомами человека. Пока вопрос о том, представляет ли цептромерпый гстсрохроматип своеобразный барьер для полноценного распространения сигнала инактивации или
Выделение тотальной РИК из органов животных и культур клеток
РНК выделяли с помощью набора RNAzol В (Biogenesis Ltd) согласно протоколу фирмы производителя. Процедура основана на методе с использованием гуанидин-изотиоцианата и кислого фенола (Chomczynski Р and Sacchi N. 1987). Все процедуры проводились в одноразовой стерильной лабораторной посуде. Выделение включает следующие этапы. Ткань гомогенизировали с суспензией RNAzol В из расчета 2 мл суспензии па 100 мг ткани. Клетки, растущие в монослос, можно лизировать непосредственно в культу рал ьной емкости добавлением RNAzol В из расчета 1мл на 10см2. Аггрегировавшне кусочки разбивали несколькими пипетированиями. К суспензии добавляли 0.2 мл хлороформа на 2мл гомогената. Пробирку закрывали и интенсивно перемешивали (без вортекса) около 15 секунд. Образец оставляли на льду па 5 мин. Затем центрифугировали на 12000g (4С) 15 мин. Отбирали верхнюю водную фазу, добавляли равный объем изопропанола и выдерживали па льду 15 мин. РНК осаждали центрифугированием на 12000g (4С) 15 мин. Верхнюю фазу сливали. Желто-белый осадок РНК промывали 75% этанолом (0.8 мл этанола на 50-100мг РНК), разбивая осадок вортексом. Затем центрифугировали 8 мин на 7500g (4С). Осадок подсушивали на воздухе 10-15 мин не до полного высыхания. РНК растворяли в обработанной диэтилпирокарбоиатом Н20. В некоторых случаях инкубировали 10-15 мин при 60С. Концентрацию РНК определяли на спектрофотометре в микрокювете. Соотношение оптического поглощения 260/280 должно быть больше, чем 1.9.
ПЦР-продукты для скрининга геномной библиотеки М. rossiaemeridionatis получали с использованием праймеров, предоставленных Л.Кэррол (L.C.); М.Матараззо (М.М.) предоставил зоны для генов ПАР2 района; Павловой Софьей (П.С.) были выбраны и предоставлены нары вложенных праймеров для гена SB1.8; праймеры для остальных генов были выбраны по известным последовательностям генов человека и мыши, опубликованных в базе данных http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cntrez (Табл. 2.1) Цитогенетнческне препараті.! метафазпых хромосом готовили из клеточных липни и первичные культуры фибробластон легкого. Клетки получали методом ірипсипизацин от одно- или двухмесячных животных (Nesterova ct al„ 1994) и поддерживали п срслс Хамса F12 с 10% FCS в атмосфере 5% углекислого газа. За іри часа перед приготовлением препаратов к клеткам добавляли этидиум бромид 63 (до концентрации 1.5мг/мл), а за 40 минут - колхицин (до конечной концентрации 0.1 мг/мл). Мстафазпыс хромосомы фиксировали в смеси мстаиол/уксусиая кислота в объемном соотношении 3:1. Препараты хранили при 4С в течение нескольких месяцев. Перед использованием препараты высушивали в вакууме при комнатной температуре в течении 4 дней.
Флуоресцентная гибридизация in situ была выполнена на основе метода Pinkel et at., 1986 и Lichter ct al., 1988. Гибридизацию зондов с препаратами хромосом проводили 16 часов на водяной бане при 37С в гибридизациопиой смеси следующего состава: 50% формамид; 2х SSC; 1% Twecn-20; 1% декстран сульфат, 200нг меченого зонда. Препараты после гибридизации последовательно отмывали при 44С в 50% формамиде и 2х SSC, затем при 40С в 2х SSC и при 60С в 0.1х SSC. Затем препараты помещали в блокирующий буфер - 4х SSC; 5% обезжиренное сухое молоко. Для детекции зонда использовали коиыогат авидии-флюорисцин и антитела к дигоксигсиину, меченые родамином. Анализ препаратов проводили через интерференционный фильтр на флюоресцентном микроскопе NIKON Х100. Обработку изображения проводили с помощью программного обеспечения фирмы Imstar и программы Adobe Photoshop (Adobe Systems 1989-2000). С месі, распределяли по 9 мкл в четыре пробирки и добавляли: в первую - 1мкл 0.2 мМ ddGTP, во вторую - 1мкл 1.25 мМ ddATP, в третью - 1 мкл 2мМ ddTTP, в четвертую - 1 мкл 1.25 мМ ddCTP. После этого реакционную смесь покрывали минеральным маслом и проводили полимеразную цепную реакцию в ДНК амплификаторе типа Роботосайклер. Условия реакции - 20 циклов: 94С - 70 сек, 55"С - 70 сек, 72С - 80 сек. После окончания амплификации реакционные смеси переносили в планшет с U-образиыми лунками, в которые было предварительно внесено по 4 мл стоп-раствора (деиопизоваиный формамид, 0.025% ксиленцианол). Перед нанесением образцов на ссквенирующий гель реакционные смеси упаривали до объема 4-6 мкл. В каждую лунку геля наносили 2-3 мкл упаренной реакционной смеси,
Электрофорез проводили в 5.5% полиакриламидпом секвенируютцем геле, содержащем 8М мочевину, в электрическом поле 30-50 В/см. Толщина геля составляла 0.2 мм, длина - 80 см. Гель фиксировали в 7% растворе уксусной кислоты в течение 15-30 мин, выдерживали в дистиллированной воде 30 мин и высушивали 1 час при 80С. Затем гель экспонировали с рентгеновской пленкой AGFA CP-BU и течение 12-36 часов. 2.13. Контекстный анализ последовательности ДНК. Компьютерный анализ последовательности выполнен с помощью пакетов программ BLAST (Altschul et a!.,t 1990, http://www.ncbt.nlm.nih.gov/), RepeatMasker (A. Smit, http://wwvv.genomc.washington.edu/UWGC/anaIysistools/ rcpcatmask.htm), FASTA (Pearson, Lipman, 1988), DNASTAR (DNASTAR Inc.) а также программ на серверах http://genome.ucsc.edu/, http://www.cnscmbl.org/. Поиск гомологичных последовательностей проводился по базам данных иуклеотидных последовательностей на BLAST-сервсре NCBI. Для выравнивания двух последовательностей использовали программа LALIGN (Huang and Miller 1991) из пакета программ FASTA, а также программа Seqman из пакета DNAstar, Для выявления повторяющихся элементов использовалась база данных повторов в геномах человека и грызунов (Jurka et at, 1992; Jurka, 1995). Выбор олигонуклеотндов осуществлялся с помощью программы PnmerSclcct из пакета DNAstar. При выборе генов-кандидатов для картирования на Х-хромосомах полевок мы принимали во внимание в первую очередь данные по статусу экспрессии генов на неактивной Х-хромосоме человека или мыши. Во вторую очередь учитывалась локализация генов на базовой хромосоме человека и значительно перестроенной X-хромосомс мыши и, следовательно, принадлежность генов к разным эволюционным стратам.
Флуоресцентная in situ гибридизация фаговых клопов на мстафазных хромосомах пяти видов полевок
FISH проводилась с зондами, меченными двумя флюорохромами. В некоторых случаях это позволяло уточнять взаимное расположение находящихся рядом сигналов. На хромосомах M.rossiaemcridionalis и, в последующем, других видов полевок для каждой пары зондов анализировали от 20 до 50 мстафазных пластинок с целью установления наиболее точной локализации предполагаемых генов. Небольшое количество пластинок анализировалось в том случае, если клон выявлял сигнал гибридизации, характерный для повторенных последовательностей и вычленить уникатьный сигнал не представлялось возможным. На рисунке 3.5 и в таблице 3.2 приведены результаты FISH па мстафазных хромосомах A/, rossiaemeridion alts.
В результате проведенной in situ гибридизации была установлена локализация на Х-хромосоме M.rossiaemeridionaUs фаговых клонов для 11 генов: EJF4C, ZFX, UTX1, MIDI,ХЕ169, SB 1.8, CRSP2, NAP1L3, RAB9, SYBL1 и SPRY3. Фаговые клоны трех из этих генов — ХЕ169, CRSP2 и SYBLI одновременно с локализацией на X-хромосоме выявили аутосомпую локализацию. Только аутосомпую локализацию выявили фаговые клопы гена ПАРІ человека — МІС2 и генов ПЛР2 - IL9R и CXYorfl. Анализ и локализация клонов генов ПАР на хромосомах других видов полевок в данной работе не проводились и будут целесообразны, иа наш взгляд, после выполнения экспериментов по хромосомному пэйптингу кариотипов полевок.
В некоторых случаях сразу было отмечено несоответствие установленной локализации фагового клона предполагаемой локализации соответствующего гена Х-хромосомы, дополненное, в ряде случаев другими данными. Фаговые клопы для генов VBE1 и RPS4X давали сигналы гибридизации только на аутосомах. Несмотря на существование исключений, соблюдение "закона Оно" установлено для подавляющего большинства генов Х-хромосомы плацентарных млекопитающих, и это позволяет заключить, что фаговые клопы не содержат последовательностей истинных генов Ubcl и Rps4x полевок. Вызвала удивление локализация клона для гена MIDI около маркера гена Hprt полевок. Ген Midi мыши локализован в исевдоаутоеомлом районе, а у человека находится вблизи ПАРІ. На некотором расстоянии от гена IIPRT на Х-хромосоме человека локализован ген MID2 - гомолог гена MIDI. Этот факт заставил с особым вниманием отнестись к проверке нуклеотидной последовательности этого клона. Тем не менее, сильный уникальный сигнал на Х-хромосоме M.rossiaemcridionalis позволяет использовать его как маркер при сравнении Х-хромосом нашей группы полевок.
Фаговый клон для гена XEI69 выявлял слабый сигнала гибридизации на X-хромосоме M.rossiaemeridionalis, Кроме того, еще несколько дополнительных сигналов детектируются и на Х-хромосоме, и на аутосомах (Рис. 3.5). Поэтому был сделан вывод, что клон может содержать либо результат сегментной дупликации, либо псевдогенпую последовательность. Локализация сигнала гибридизации ис в районе, соответствующем человеческому и мышиному синтеиным кластерам, а в районе локализации гена Gla полевок, подтверждает такой вывод. Ген XEI69 у человека принадлежит небольшому кластеру избегающих инактивации генов, в котором также находится ген SBI.8. У мыши эти гены также расположены в одном кластере. С клоном этого гена была проведена FISH на хромосомах всех видов, однако он не выявил даже слабого сигнала гибридизации у M.agrestis. Его локализация на хромосомах остальных видов даже при поверхностном взгляде не вносила никаких уточнений в прогноз возможных перестроек, произошедших в X-хромосомах полевок. Поэтому в дальнейшем анализе он не учитывался.
Таким образом, FISH на хромосомах полевок M.kirgisorum, M.arvalis, M.transcaspicus и M.agrestis была проведена с 11 фаговыми клонами, выявившими сигнал гибридизации на Х-хромосоме M.rossiaemeridionaiis (Рис. 3.6, Табл. 3.3). Для гена XEI69 в качестве зонда при скрининге геномной библиотеки использовалась мышиная кДНЬС размером 2.3 тпн. Такой размер позволяет использовать клоп кДПК в качестве самостоятельного зонда для FISH. Удовлетворительный сигнал FISH получен па Х-хромосоме M.agrestis (Рис. 3.7). Локализация гена Хе169 установлена в районе ХрЗ.5 Х-хромосомы M.agrestis в котором картирован также клон гена SB1.8. Для подтверждения наличия в фаговых клонах гомологичных генам последовательностей и локализации соответствующих генов в определенных районах Х-хромосом было проведено частичное секвенирование клонов. Нуклеотидная последовательность, в основном, определялась для фрагментов гибридизации фага с соответствующим зондом при Саузерн блот-гибридизации. Если нужный фрагмент оказывался большого размера, то он подвергался субклонированию, последующей блот-гибридизации и секвенированию гибридизущегося фрагмента меньшего размера. В некоторых случаях определялась нуклеотидная последовательность геномного фрагмента по концам встройки в фаговом клоне. Последовательности анализировали с помощью программ на серверах http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, http://genome.ucsc.edu/,
http://www.ensembl.org/. Фрагменты для 9 генов (кроме гена MIDI) содержали гомологичные соответствующим генам Х-хромосомы человека и мыши последовательности. Для 8 генов (кроме Eif4c) были выявлены фрагменты, содержащие белок-кодирующие последовательности. Секвенированный субклон для гена Eif4c содержал район, гомологичный 5 -нетранслируемой области транскрипта. Высокая степень гомологии с соответствующими генами, была установлена для большинства кодирующих и некодирующих последовательностей (Рис. 3.8, Табл. 3.4). Все кодирующие последовательности содержали непрерывные рамки считывания. Сиквенсы, не выявлявшие значимой гомологии с последовательностями мыши или человека, в основном содержали специфические для полевок SINE повторы.
