Содержание к диссертации
Введение 7
Глава 1. Обзор литературы
-
Введение 10
-
Организация интерфазного хроматина в ядре 11
-
Структура метафазных хромосом 15
-
Структурные белки семейства SMC 17
-
Молекулярная структура белков SMC семейства 19
-
Организация генов, кодирующих белки семейства SMC 22
-
Сегрегация бактериальных хромосом. Особенности прокариотических 24 представителей семейства SMC
-
Когезия сестринских хроматид 26
-
Сцепление сестринских хроматид происходит при участии комплекса 27 когезин, коровым компонентом которого являются белки SMC1-SMC3
-
Биохимические свойства и архитектура комплекса когезин 28
-
Инициация сцепления сестринких хроматид 3 0
-
Распределение комплексов когезин на хромосомах 32
-
Разделение хроматид в митозе 33
1.8.6. , Когезия сестринских хроматид в мейозе 35
-
Белки SMC участвуют в процессах рекомбинации 35
-
Участие белков SMC5-SMC6 в рекомбинационной репарации 37 двуцепочечных разрывов ДНК
-
Формирование митотических хромосом при участии гетеродимера 38 SMC2-SMC4 в составе комплекса конденсин
-
Регуляция локализации конденсина в клеточном цикле 39
-
Взаимодействие конденсина с хроматином 40 1.11.3." Гетеродимер SMC2-SMC4 дрожжей S.pombe способен ренатурировать 41
\ ДНК
1.11.4. Конденсин вводит положительные супервитки в замкнутую молекулу 42
ДНК in vitro, используя энергию гидролиза АТФ
1.11.5. Конденсин-подобный комплекс у C.elegans отвечает за дозовую 44
4 компенсацию генов
«#
1.12.
1.13.
Глава 2.
2.1.
2.2.
2.2.1.
2.2.2.
2.3.
2.4.
2.4.1.
2.4.2.
2.4.3.
2.5. '
2.5.1.
2.5.2.
2.6.
2.7.
2.8.
2.9.
2.10.
Глава 3.
3.1.
3.2.
-
'
-
' 3.5.
3.5.1. 3.5.2.
Модель инактивации X хромосомы у самок высших млекопитающих 44 при участии SMC содержащих комплексов
Перспективы изучения механизма инактивации Х-хромосом на модели 46 межвидовых гибридов обыкновенных полевок (род Microtus, группа "arvali?)
Заключение 47
Материалы и методы
Объект исследования 49
Микробиологические методы работы 49
Приготовление компетентных клеток Е. coli 49
Трансформация 49
Скрининг геномных фаговых библиотек 50
Методы выделения ДНК 50
Выделение плазмидной ДНК 50
Выделения ДНК и печени полевок 51
Выделение ДНК фагов 51
Методы работы с рекомбинантной ДНК 52
Выделение фрагментов ДНК из геля 52
Получение направленных делеций 52
Полимеразная цепная реакция 53
Саузерн блот гибридизация 53
Гибридизация in situ 54
Определение нуклеотидной последовательности ДНК 55
Контекстный анализ последовательности ДНК 56
Результаты и обсуждение
Скрининг геномной библиотеки 58
Скрининг кДНК клонотеки полевкиM.arvalis 60
Особенности структуры белка MaSMC4 обыкновенной полевки 61
Характеристика гена MaSMC4 полевки М. arvalis 62
Организация генов семейства белков SMC4 у мыши, крысы и 67
человека.
Ген белка семейства SMC4 человека 67
Ген белка семейства SMC4 мыши 68
Ген белка семейства SMC4 крысы 70
Сравнение геномных нуклеотидных последовательностей гена SMC4 71
мыши, крысы, полевки и человека
Анализ кодирующих районов гена SMC4 у мыши, крысы, полевки, 73
человека и шпорцевой лягушки
Анализ структуры интронов гена SMC4 у мыши, крысы, полевки, 78
человека
Анализ 5' области гена белка SMC4 у полевки, человека, мыши и 82
крысы
Гены SMC белков локализуются в синтенных группах у человека, 88
мыши и крысы
Выявление последовательностей ДЕЖ генов белков SMC1,2,3 у 90
обыкновенной полевки
Организация генов семейства SMC в геномах человека, мыши и 91
крысы.
Заключение 95
Выводы 98
Список литературы 99
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
Введение к работе
Актуальность проблемы
Структурные белки хроматина семейства SMC (Structural Maintenance of Chromosomes) играют важную роль во многих процессах, связанных с метаболизмом ДНК в клетке. Это, консервативное у всех организмов семейство белков, содержит пять эукариотических групп и одну бактериальную. Представители SMC семейства эукариот входят в состав биохимических комплексов, отвечающих за когезию сестринских хроматид, рекомбинацию, репарацию, регуляцию экспрессии генов (SMC1/SMC3, SMC2/SMC4, SMC5/SMC6), формирование митотических хромосом (SMC2/SMC4) (Strunnikov & Jessberger, 1999; Hirano, 1999; Jessberger et al., 1998). Анализ литературных данных показывает, что белки SMC являются базовым компонентом ряда систем наследования, изменчивости и реализации генетического материала клеток.
Ранее нами было высказано предположение, что SMC белки могут участвовать в поддержании дозовой компенсации X хромосом у самок млекопитающих (Павлова и др. 2000). Генетическая система этих белков, однако, слабо изучена. Выявление генов семейства SMC в геноме обыкновенных полевок и анализ их функций является первоочередной задачей, стоящей на пути исследования участия белков SMC в процессе дозовой компенсации Х-хромосом у самок высших млекопитающих в целом, и изучения феномена неслучайной инактивации у обыкновенных полевок в частности (Zakian et al., 1987).
Цель и задачи исследования
Целью настоящей работы является изучение последовательностей ДНК генома обыкновенной полевки Microtus arvalis, кодирующих белки семейства SMC.
В конкретные задачи работы входило:
Выявить и установить последовательность гена Masmc4 (Microtus arvalis подсемейства SMC4) в геноме полевки M.arvalis
Выявить и установить последовательность мРНК генаMasmc4 группы.
Определить экзон-интронную структуру rem. Masmc4
Проанализировать промоторную область гена Masmc4
Определить локализацию гена Masmc4 на хромосомах обыкновенных полевок
Выявить и проанализировать методом ПЦР последовательности ДНК, кодирующие белки SMC1, SMC2, SMC3 в геноме полевки.
Проанализировать полученные данные в свете сравнительной геномики
Научная новизна и практическая ценность работы
В нашей работе мы впервые выявили гены структурных белков SMC в геноме обыкновенной полевки M.arvalis и выделили полную копию гена Masmc4 (Microtus arvalis подсемейства SMC4), установили его экзон/интронную структуру, провели анализ 5' регуляторной области. Выявили последовательности 3' районов генов Masmcl, Masmc2, Masmc3 обыкновенной полевки и показали высокую степень их гомологии с известными последовательностями белков SMC.
Проведен сравнительный анализ генов белков семейства SMC4 грызунов (M.arvalis, Mus musculus, Rattus norvegicus), человека, шпорцевой лягушки (Xenopus laevis) и выявлены основные принципы организации и регуляции исследуемых генов.
Последовательности ДНК генов зарегистрированны в базе данных EMBL. Наши данные подтвердили высокую степень гомологии последовательностей белков SMC у разных групп организмов. Они являются несомненным вкладом в изучение генетики семейства структурных белков SMC.
Апробация работы и публикации
По материалам диссертации опубликованы две работы. Результаты работы были доложены на двух международных конференциях.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы.
