Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 17
1.1.Феномен плюрипотентности клеток млекопитающих in vivo и in vitro 17
1.2. Сигнальные пути, участвующие в поддержании клеточной плюрипотентности 19
1.2.1. LIF-STAT3 19
1.2.2. ВМР4 21
1.2.3. WNT 22
1.3. Транскрипционные факторы и плюрипотентность 23
1.3.1 Транскрипционный фактор ОСТ4 23 1.3.2. Транскрипционный фактор NANOG 26
1.4. Спектр генов-мишеней транскрипционных факторов ОСТ4 и NANOG. Авторегуляция и взаимодействие с другими транскрипционными факторами 28
1.4.1. Гены-мишени транскрипционного фактора ОСТ4 28
1.4.2. Анализ распределения сайтов посадки факторов ОСТ4, NANOG и SOX2 в геномах ЭСК человека и мыши 31
1.5. Структура и хромосомная локализация Oct4 и Nanog. Структура белков
OCT4HNANOG 37
1.5.1. Структура и хромосомная локализация гена Oct4. Структура белка ОСТ4 37
1.5.2. Предшественники гена Oct4 плацентарных млекопитающих 38
1.5.3. Структура и хромосомная локализация гена Nanog. Структура белка NANOG 40
1.6. Динамика экспрессии генов Oct4 и Nanog в онтогенезе млекопитающих 42
1.6.1. Экспрессия гена Oct4 42
1.6.2. Экспрессия гена Nanog 45
1.7. Регуляция экспрессии генов Oct4 и Nanog 46
1.7.1. Регуляция экспрессии гена Oct4 46
1.7.2. Регуляция экспрессии гена Nanog 5 О ЗАКЛЮЧЕНИЕ 53
ГЛАВА 2. Материалы и методы 54
2.1 Объект исследования 54
2.2. Скрининг геномной библиотеки полевки М. rossiaemeridionalis 54
2.3. Выделение ДНК фагов 55
2.4. Микробиологические методы работы 56
2.4.1. Приготовление компетентных клеток Е. coli 56
2.4.2. Трансформация компетентных клеток Е.coli 57
2.5. Методики работы с рекомбинантной ДНК 57
2.5.1. Выделение плазмидной ДНК 57
2.5.2. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции 58
2.5.3. Электрофорез ДНК в агарозном геле 58
2.5.4. Выделение фрагментов ДНК из гелей 58
2.5.4. Субклонирование фрагментов ДНК 59
2.7. Полимеразная цепная реакция 59
2.8. Определение нуклеотидной последовательности ДНК 60
2.9. Контекстный анализ последовательности ДНК 60
2.10. Конструирование репортерных векторов 63
2.11. Временная трансфекция и измерение активности люциферазы 64
2.11. Работа с РНК
2.11.1. Выделение РІЖ из эмбрионов и органов полевки М. rossiaemeridionalis 65
2.11.2. Обработка РНК ДНКазой 66
2.11.3. Синтез кДНК 66
2.11.4. 3'- и 5'-RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) 67
2.12. Работа с культурами эукариотических клеток 68
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 71
3.1. Исследование нуклеотидной последовательности и экзон-интронной структуры гена Oct4 полевки М. rossiaemeridionalis 71
3.2. Сравнительный анализ ортологичных последовательностей гена Oct4 млекопитающих 75
3.3. Анализ активности промотора гена Oct4 полевки 84
3.4. Исследование нуклеотидной последовательности и экзон-интронной структуры гена Nanog полевки М. rossiaemeridionalis 86
3.5. Сравнительный анализ ортологичных последовательностей Nanog гена млекопитающих 91V.
3.6. Анализ экспрессии генов Oct4 и Nanog в онтогенезе полевки M.rossiaemeridionalis 96
Заключение 99
Выводы 102
Список литературы
- Транскрипционные факторы и плюрипотентность
- Спектр генов-мишеней транскрипционных факторов ОСТ4 и NANOG. Авторегуляция и взаимодействие с другими транскрипционными факторами
- Скрининг геномной библиотеки полевки М. rossiaemeridionalis
- Сравнительный анализ ортологичных последовательностей гена Oct4 млекопитающих
Введение к работе
Актуальность. Получение и исследование эмбриональных стволовых клеток различных видов млекопитающих является одной из актуальных проблем современной биологии. Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) получают из внутренней клеточной массы (ВКМ) либо эпибласта предымплантационных эмбрионов млекопитающих. При сохранении оптимальных условий культивирования ЭСК, в течение продолжительного времени могут сохранять ряд свойств, характерных для клеток ВКМ и эпибласта эмбриона (Smith, 2001; Boiani, Sholer, 2005). Одно из основных уникальных свойств ЭСК - плюрипотентность. Плюрипотентность определяет способность ЭСК дифференцироваться, in vitro и in vivo, в производные всех трех зародышевых листков, эктодермы, энтодермы и мезодермы, а также образовывать во время эмбрионального развития клетки предшественники функциональных гамет (Boiani, Sholer, 2005). Это свойство ЭСК делает их перспективным объектом фундаментальных и прикладных исследований (Smith, 2001). ЭСК являются уникальной модельной системой при исследовании процессов, происходящих в раннем эмбриогенезе млекопитающих (Martin, 1981; Evans, Kaufman, 1981; Thomson et al, 1998; Chaumeil et al, 2002; Boiani, Sholer, 2005).
На сегодняшний день известно, что поддержание плюрипотентного статуса клеток предымплантационных эмбрионов и ЭСК обеспечивается сложной системой клеточно-поверхностных белков, их молекулярных сигнальных путей и транскрипционных факторов, инициирующих или модулирующих транскрипцию генов-мишеней. Подсистема, так называемых «внешних регуляторов плюрипотентности», включает в себя несколько сигнальных путей, основными из которых являются каскады, запускаемые белками LIF, ВМР4 и WNT. Оказалось, что действие данных сигнальных путей происходит in vitro, но носит видоспецифичный характер. Одни и те же молекулы могут поддерживать плюрипотентность ЭСК мыши и не влиять на плюрипотентность ЭСК человека. Более того, одни и те же пути могут иметь противоположное влияние на ЭСК мыши и человека (Xu et al, 2002; Humphrey etal, 2004; Sumi et al, 2004; Boiani, Sholer, 2005).
Другой подсистемой, регулирующей плюрипотентность ЭСК, является подсистема «внутренних регуляторов плюрипотентности» - транскрипционных факторов, действующих в ядрах клеток. К числу ключевых регуляторов в данной подсистеме относятся транскрипционные факторы ОСТ4 и NANOG. Данные факторы участвуют в поддержании плюрипотентности клеток как in vivo так и in vitro. Эмбрионы мыши, гомозиготные по нокауту генов Oct4 и Nanog, гибнут в предымплантоционный период развития вследствие недоразвития ВКМ и эпибласта, соответственно (Nichols et ah, 1998; Chambers et ah, 2003; Mitsui et ah, 2003). Подавление экспрессии генов Oct4 и Nanog в ЭСК мыши и человека вызывает дифференцировку клеток в трофобластные производные и производные примитивной энтодермы и мезодермы, соответственно (Niwa et ah, 2000; Vekey, О'Shea, 2003; Hay et ah, 2004; Hyslop et ah, 2005). Совместно с транскрипционным фактором SOX2 они образуют единую систему регуляции транскрипции генов в ЭСК. Взаимодействие этих факторов приводит к формированию двух регуляторних подсистем: авторегуляторной и подсистемы прямой регуляции широкого спектра генов мишеней, большинство из которых участвует в процессах дифференцировки ЭСК (Boyer et ah, 2005; Loh et ah, 2006). Геномная организация, экспрессия и регуляция генов, кодирующих факторы ОСТ4 и NANOG, подробно исследованы только у человека и мыши - видов, для которых получены стабильные линии ЭСК (Chambers, Smith, 2004). Получение линий ЭСК других видов млекопитающих представляет на сегодняшний день серьезную проблему. Открытым остается вопрос о причинах высокой разницы в эффективности получения плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток у различных видов млекопитающих. Некоторые экспериментальные данные говорят о том, что отрицательный результат экспериментов по получению стабильных линий ЭСК может быть следствием видоспецифичных особенностей регуляции и экспрессии генов системы поддержания плюрипотентности, таких как Oct4 и Nanog (Buehr et ah, 2003).
Исследование структуры, регуляции и экспрессии генов, кодирующих транскрипционные факторы ОСТ4 и NANOG у различных видов млекопитающих важно для формирования представлений о функционировании системы поддержания плюрипотентности в целом и особенностях данной системы у каждого вида в
отдельности. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей регуляторных и кодирующих частей генов Oct4 и Nanog млекопитающих позволяет выявить наиболее эволюционно консервативные последовательности, несущие функциональную нагрузку. Кроме того, сравнение нуклеотидных последовательностей и паттерна экспрессии генов Oct4 и Nanog у различных видов млекопитающих позволяет проследить отличия, которые могут являться причиной неудач при получении ЭСК.
Обыкновенные полевки рода Microtus являются модельным объектом для которого ведутся работы по получению ЭСК (Nesterova et ah, 2001; Шевченко и др., 2006). Использование стандартных протоколов получения ЭСК мыши и человека на полевках не привели к получению стабильных, плюрипотентных ЭСК. Исследование молекулярно-генетических особенностей структуры генов Oct4 и Nanog, их регуляции и экспрессии у полевок может способствовать выявлению видоспецифических особенностей подсистемы «внутренних регуляторов плюрипотентности» и разработке оптимальной стратегии исследования характеристик «генов плюрипотентности», критичных для получения ЭСК. Полученные знания позволят составить модифицированные, более эффективные, протоколы получения эмбриональных стволовых клеток для видов млекопитающих, получение ЭСК у которых затруднено.
Для полноценного решения этой проблемы необходимо ответить на вопрос, справедлива ли для полевок характерная для мыши схема дифференцированной экспрессии Oct4 и Nanog в предымплантационном эмбрионе, т.е. ограничена ли экспрессия Oct4 и Nanog только плюрипотентными клетками эмбриона (ВКМ, эпибласт). Важно проследить, динамику экспрессии генов Oct4 и Nanog в течение развития эмбриона полевки, поскольку от времени начала репрессии этих генов во многом зависит успешность получения ЭСК. Кроме того, необходимы знания об особенностях структуры и регуляции генов Oct4 и Nanog у полевок.
Для решения проблемы, безусловно, были необходимы комплексные исследования, включающие полное секвенирование геномных и кДНК последовательностей генов Oct4 и Nanog полевок, сравнительный анализ структуры
полученных последовательностей, изучение особенностей строения регуляторных областей этих генов с помощью репортерных конструкций, исследование экспрессии генов Oct4 и Nanog в онтогенезе полевок.
Цели и задачи работы.
Цель работы — исследовать структуру, регуляцию и особенности экспрессии генов Oct4 и Nanog у обыкновенных полевок рода Microtus.
Задачи работы:
Определить последовательность нуклеотидов кодирующих и регуляторных частей генов Oct4 и Nanog полевки М. rossiaemeridionalis.
Произвести анализ полученных нуклеотидных последовательностей и сравнение нуклеотидных последовательностей генов Oct4 и Nanog полевки с ортологами этих генов у других видов млекопитающих.
Исследовать экспрессию мРНК генов Oct4 и Nanog в онтогенезе полевки.
Построить репортерные конструкции, содержащие ген люциферазы под контролем различных элементов регуляторной области гена Oct4, и исследовать активность данных конструкций в линиях плюрипотентных и неплюрипотентных клеток.
15 Научная новизна.
Впервые получены геномные нуклеотидные последовательности генов Oct4 и Nanog полевки М. rossiaemeridionalis. Установлена их экзон-интронная структура. Для гена Oct4 установлена нуклеотидная последовательность регуляторной области, размером 4017 п.н. Геномные нуклеотидные последовательности и последовательности кДНК генов Oct4 и Nanog полевки М. rossiaemeridionalis зарегистрированы в базе данных GeneBank под номерами: Oct4 (EF032593 и EF030115, соответственно); Nanog (EU908043 и EU908044, соответственно).
В данной работе впервые исследована экспрессия генов Oct4 и Nanog в онтогенезе и отдельных органах полевки М. rossiaemeridionalis. Показаны сходства и отличия в паттерне экспрессии генов Oct4 и Nanog в онтогенезе мыши и полевки.
Впервые исследована активность репортерных конструкций, содержащих различные части регуляторной области гена Oct4 полевки в линиях плюрипотентных клеток мыши и трофобластных стволовых клетках полевки. Показано, что регуляторная область гена Oct4 полевки активна в клетках мыши и неактивна в неплюрипотентных клетках полевки.
Практическая значимость. Результаты данной работы расширяют знания о функционировании отдельных элементов системы поддержания плюрипотентности клеток у млекопитающих и могут быть использованы при планировании и проведении экспериментов по получению ЭСК.
Апробация работы. Результаты работы представлены в материалах международной конференции «Генетика в России и мире» (Москва, 28 июня - 2 июля 2006 г.), на международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы Молекулярной и Клеточной Биологии» (Томск, 9-12 мая 2007 г.).
По теме диссертации опубликованы две работы. Одна - в рецензируемом зарубежном журнале, другая — в рецензируемом отечественном журнале. Еще две статьи приняты в печать, в рецензируемые отечественные журналы.
Вклад автора. Основные результаты получены автором самостоятельно. Скрининг фаговой геномной библиотеки полевки М. rossiaemeridionalis проводился совместно с к.б.н. А.И. Шевченко, анализ нуклеотидных последовательностей генов Oct4 и Nanog проводился совместно с к.б.н. Е.А. Елисафенко.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 3-х глав, выводов и списка литературы. Работа изложена на 116 страницах, содержит 12 рисунков и 15 таблиц.
Транскрипционные факторы и плюрипотентность
Ген, кодирующий транскрипционный фактор NANOG, впервые описан Вангом (Wang et al, 2003) с соавторами как Епк (по гомологии с генами семейства Nk). Роль данного гена в поддержании плюрипотентности установлена двумя независимыми группами исследователей (Chambers et al, 2003; Mitsui et al, 2003). Ими было дано название данному гену - Nanog в честь кельтского мифа о стране вечной молодости ir пап Og.
В работе Чамберса с соавторами был применен функциональный скрининг кДНК-библиотеки, полученной из ЭСК мыши. Экспрессирующаяся кДНК-библиотека была трансфецирована в ЭСК мыши, гомозиготные по мутации рецептора LIF (Lifi ). Затем осуществлялась пуромициновая селекция клеток, подвергшихся трансфекции, и отбор клеток, сохранивших ЭС-фенотип, благодаря сверхэкспрессии векторов, содержащих различные кДНК. Выделенные из этих клеток вектора были повторно трансфецированы в Lifr 1 ЭС-клетки, чтобы подтвердить их способность поддерживать недифференцированное состояние клеток. Затем из недифференцированных клеток были выделены плазмиды и охарактеризованы индивидуальные кДНК. Оказалось, что это - кДНК ранее неизвестного гомеопротеина, впоследствии названного - NANOG. Важным является тот факт, что для трансфекции использовались ЭСК, мутантные по гену рецептора LIF. Таким образом, было показано, что сверхэкспрессия гена Nanog в ЭСК позволяет поддерживать плюрипотентный статус клеток, независимо от LIF-STAT3 - системы (Chambers et al, 2003). Митсуи с соавторами использовали сравнительный in silico анализ данных по экспрессии генов в эмбриональных стволовых и соматических клетках, а также в дифференцированных и недифференцированных ЭСК. Этот подход позволил выявить гены, избирательно экспрессирующиеся в недифференцированных ЭСК мыши. Одним из которых оказался ген, кодирующий белок NANOG. Мутационный анализ гена Nanog показал, что его экспрессия необходима для нормального развития эпибласта эмбриона и поддержания самообновления ЭСК мыши. ЭСК с генотипом Nanog 1 подвергались дифференцировке в экстраэмбриональные производные (Mitsui et al, 2003).
Возврат соматического генома к плюрипотентному состоянию (репрограммирование), наблюдающийся при слиянии ЭСК с соматическими клетками или трансплантации ядер дифференцированных клеток в энуклеированный ооцит, сопровождается реактивацией гена Nanog. ЭСК, гетерозиготные по нокауту гена Nanog, находятся в лабильном недифференцированном состоянии и самопроизвольно дифференцируются во множество типов клеток (Hatano et al, 2005).
Кроме того, показано, что ген NANOG участвует в поддержании плюрипотентности ЭСК и клеток эмбриональной карциномы человека. Недифференцированные ЭСК человека трансфецировали TV TVOG-специфичной интерферирующей РНК, в результате чего наблюдали падение уровня экспрессии гена NANOG с одновременным увеличением уровня транскрипции генов, ассоциированных с экстраэмбриональной энтодермой: GATA4, GATA6, LAMININ В1, AFP и трофоэкто дермой: CDX2, GATA2, hCG-alpha и hCG-beta. Иммуногистохимическое окрашивание предымплантационных эмбрионов человека антителами к белку NANOG выявило экспрессию данного белка только в клетках внутренней клеточной массы бластоцист, что еще раз подтверждает роль гена NANOG в поддержании плюрипотентности клеток человека (Hyslop et al, 2005).
Сходные результаты получены в экспериментах на ЭСК обезьян циномолгусов (Масасса fascicularis). Сверхэкспрессия Nanog позволяла поддерживать недифференцированное состояние ЭСК обезьян в отсутствии фидера. Нокаут гена Nanog в этих клетках вызывал экспрессию маркеров примитивной энтодермы и трофоэктодермы (Yasuda et al, 2006). В тоже время сверхэкспрессия гена NANOG в ЭСК человека не позволяет поддерживать самообновление и плюрипотентность в течение многих пассажей в отсутствии фидера, однако вызывает активацию генов-маркеров примитивной эктодермы (Darr et al, 2006).
Таким образом, на сегодняшний день убедительно доказана ведущая роль транскрипционных факторов ОСТ4 и NANOG в поддержании плюрипотентности эмбриональных стволовых клеток мыши и человека. Клетки, теряющие активность генов Oct4 и Nanog, претерпевают дифференцировку в производные экстраэмбриональной энтодермы и трофоэктодермы. Кроме того, активность данных генов необходима для нормального эмбрионального развития. Эмбрионы мыши, гомозиготные по мутации Oct4 и Nanog, гибнут в периимплантационный период вследствие нарушения развития плюрипотентного компартмента эмбриона -эпибласта.
Спектр генов-мишеней транскрипционных факторов ОСТ4 и NANOG. Авторегуляция и взаимодействие с другими транскрипционными факторами
Транскрипционный фактор ОСТ4 был открыт и исследовался с 1991 года. После исследования структуры гена Oct4, его хромосомной локализации и регуляции большое внимание было направлено на поиск генов-мишеней транскрипционного фактора ОСТ4 с использованием доступных в то время молекулярно-генетических и биохимических методов. Было выяснено, что транскрипционный фактор ОСТ4 является активатором и репрессором многих генов-мишеней, большинство из которых тем или иным образом участвует в процессе раннего эмбрионального развития: ген Fgf4, Орп, Utfl, гены, кодирующие а- и Р-субъединицы хорионического гонадотропина человека (hCG) (Botquin et ah, 1998; Yuan et ah, 1995; Nishimoto et ah, 1999; Liu, Roberts, 1996; Liu et ah, 1997). Регуляция транскрипции генов Fgf4, Орп и Utfl осуществляется тремя различными способами Ос -зависимой позитивной регуляции (Pesce, Sholer, 2000). Ген Fgf4 экспрессируется в клетках внутренней клеточной массы бластоцист и играет роль в поддержании пролиферации и жизнеспособности клеток ВКМ и клеток примитивной эндодермы (Pesce, Sholer, 2000). Ген Орп, экспрессирующийся в клетках ВКМ и ЭСК, кодирует белок, компонент внеклеточного матрикса, участвующий в процессах миграции и адгезии клеток развивающегося эмбриона. Повышение уровня экспрессии Орп наблюдается в клетках примитивной эндодермы перед их дифференцировкой в клетки париетальной или висцеральной эндодермы (Botquin et ah, 1998). Ген Utfl кодирует коактиватор транскрипции, экспрессирующийся в ЭСК и клетках эмбриональной карциномы, экспрессия Utfl затухает при дифференцировке клеток. В эмбрионе Utfl экспрессируется в ВКМ бластоцисты, а также эмбриональной и экстраэмбриональной эктодерме (Okuda et al, 1998). Было показано, что трансктипционные факторы ОСТ4 и SOX2 способны усиливать пролиферацию и онкогенность ЭСК посредством активации гена Utfl (Nishimoto et al, 2005).
Энхансер, содержащий сайт связывания транскрипционного фактора ОСТ4, расположен в 3 -UTR TQ.YLQ.Fgf4 (Pesce, Sholer, 2000). В эмбрионах мыши, дефицитных по гену Oct4, экспрессия Fgf4 отсутствует либо наблюдается ее низкий уровень (Nichols et al, 1998). Искусственное внесение фактора FGF4 при культивировании ОСТ4-дефицитных эмбрионов усиливает пролиферацию диплоидных клеток трофобласта (Pesce, Sholer, 2000). Энхансер гена Fgf4 содержит октамерный мотив связывания ОСТ4, а также сайт связывания фактора SOX2, содержащего HMG-бокс. ОСТ4/80Х2-зависимая активация Fgf4 определяется белок-белковым взаимодействием этих двух транскрипционных факторов (Yuan et al, 1995; Ambrosetti etal, 1997).
Энхансерный элемент, активируемый ОСТ4, найден в первом интроне гена Орп. Дифференцировка клеток примитивной эндодермы эмбриона сопровождается одновременным повышением уровня экспрессии генов Oct4 и Орп (Palmieri et al, 1994). Убедительным доказательством того, что экспрессия Орп контролируется транскрипционным фактором ОСТ4, могут служить эксперименты по иммунопреципитации хроматина клеток эмбриональной карциномы с помощью антител к белку ОСТ4. Энхансерный элемент Орп содержит палиндромную последовательность, названную PORE (palindromic-oct-regulatory-element), которая включает в себя октамерный мотив ATGCAAAT и через пару нуклеотидов ATTTG. Транскрипционный фактор ОСТ4 связывается с данной последовательностью в виде димера. Именно в димерной форме ОСТ4 способен активировать транскрипцию Орп. Интересно, что сайт связывания фактора SOX2 также обнаружен недалеко от PORE. В отличие от случая с геном Fgf4, трансактивация гена Орп фактором ОСТ4 подавляется фактором SOX2. По всей видимости, взаимодействие с белком SOX2 мешает формированию димера ОСТ4 (Botquin et al, 1998).
Нишимото с соавторами (Nishimoto et al, 1999) описан другой пример взаимодействия факторов ОСТ4 и SOX2 при активации генов-мишеней. Эти авторы нашли, что энхансерный элемент, расположенный в З -UTR гена Utfl, активируется совместным действием факторов ОСТ4 и SOX2. Другие POU-транскрипционные факторы, такие как ОСТІ и ОСТ6, также могут связываться с энхансером Utfl, однако только ОСТ4 может формировать активный комплекс с SOX2 (Nishimoto etal., 1999).
Кроме того, ОСТ4 может выступать как модулятор активности других транскрипционных факторов. Представители семейства транскрипционных факторов FOX (Forkhead Box) принимают участие в ранней дифференцировке тканей эмбриона, особенно они важны для развития эндодермы и эндодермального органогенеза. Относящийся к данному семейству транскрипционный фактор FOXD3 способен связываться и активировать промоторы генов других представителей данного семейства, например, таких как FoxAl и FoxA2. Эксперименты, проведенные Гуо с соавторами (Guo et ah, 2002), показывают, что транскрипционный фактор ОСТ4 способен подавлять экспрессию FoxAl и FoxA2 путем взаимодействия с ДНК-связывающим доменом их активатора - FOXD3 (Guo et ah, 2002).
Подавление экспрессии гена х-интерферона (Ifn-x) также связано с модулирующим действием ОСТ4. Ген Ijh-т экспрессируется исключительно в трофоэктодерме эмбрионов крупного рогатого скота и активируется транскрипционным фактором ETS2. Белки ОСТ4 и ETS2 способны образовывать комплекс за счет взаимодействия POU-домена ОСТ4 и ДНК-связывающего домена ETS2, в результате чего происходит подавление трансактивационной активности фактора ETS2. В трофоэктодермальных клетках уровень экспрессии ОСТ4 снижается, в результате чего возобновляется активность фактора ETS2, и, как следствие, начинается экспрессия трофоэктодермальных генов, таких как Ifn-x (Ezashi et ah, 2001).
Таким образом, можно сказать, что большинство известных на настоящий момент генов-мишеней транскрипционного фактора ОСТ4 тем или иным образом участвуют в дифференцировочных событиях, происходящих в раннем развитии эмбриона. Приведенные выше факты убедительно показывают определяющую роль фактора ОСТ4 в поддержании плюрипотентности клеток in vivo и in vitro.
Скрининг геномной библиотеки полевки М. rossiaemeridionalis
Геномная библиотека полевки М. rossiaemeridionalis (Nesterova et ah, 2001), скринирована в соответствии со стандартной методикой (Sambrook et ah, 1989). Геномную библиотеку полевки М. rossiaemeridionalis, построенную на основе фагового вектора Lamda DASH II (Stratagene), разводили до концентрации 25000 БОЕ/мкл в SM-буфере (ОД М NaCl; 10 mM MgS04; 50 тМ Tris-HCl, рН7,5; 0.01% желатин). Для посева на каждую чашку Петри диаметром 132 мм брали 2 мкл разведения геномной библиотеки и 600 мкл суспензии клеток E.coli XLlBlue MRA (суспензия O.Deoo = 0,5 в 10 мМ MgS04), смесь клеток с фагами инкубировали 30 мин в термостате при 37С. Затем смесь помещали в пробирку с 7 мл среды LB (1% бактотриптон; 0,5% дрожжевой экстракт, 1% NaCl, 0,75% агароза, 10 мМ MgS04) (верхняя агароза). Верхнюю агарозу быстро выливали на заранее залитые чашки Петри с нижним агаром (1% бактотриптон; 0,5% дрожжевой экстракт, 1% NaCl, 1,5% агар, 10 мМ MgS04), стараясь чтобы верхний агар растекся по поверхности нижнего агара равномерно. Библиотеку рассеивали на 14 чашек диаметром 132 мм. Общее количество бляшек составило около 750000, что соответствует двум геномам полевки М. rossiaemeridionalis. Чашки Петри инкубировали в термостате при 42С 12 часов. На следующий день чашки выдерживали не меньше часа при 4С. ДНК фагов переносили на нейлоновые мембраны (BDH, Electran optymised nylon). С каждой чашки снимали по две реплики. Первую реплику выдерживали на чашке 1 мин., вторую 2 мин. Реплики последовательно проводили через денатурирующий раствор (0,5 М NaOH, 1,5 М NaCl), выдерживая 10 мин, затем дважды по 5 мин через нейтрализующей раствор (1,5 М Tris-HCl рН 8,0; 1,5 М NaCl), по 5 мин в каждой, и споласкивали в 2Х SSC (300 мМ NaCl, 30 мМ цитрат натрия, рН 7,0). ДНК на фильтрах фиксировали обработкой ультрафиолетом (мощность облучения 120 Дж/см ). Гибридизацию проводили в минимальном объеме раствора, содержащего 50% формамид, 5х раствор Денхарта, 5х SSPE (900 мМ NaCl; 50 мМ, NaH2P04, 5 мМ ЭДТА, рН 7,4); 0,1% SDS, при 42С в течение ночи. Гибридизационную смесь, содержащую радиоактивно меченый зонд (ТЩР-продукт размером 631 п.н., полученный с использованием праимеров: Oct2F 5 -ccaagctgctgaagcagaaga-3 и Oct5R S ttgaatgcatgggagagccca-S ), использовали при дальнейших рескринингах и блот-гибридизации выделенных клонов. Фильтры отмывали в сменах растворов SSC (от 2х до 0.2х) и 0,1% SDS при увеличении температуры от 37С до 65С. Фильтры с первичным скринингом экспонировали с радиоавтографической пленкой AGFA 2-3 суток. Для выделения индивидуального фагового клона проводили до 3-х процедур рескринига (Sambrook et at, 1989).
Выделение ДНК фагов проводили согласно методу описанному Забаровским и Туриной с некоторыми модификациями (Забаровский, Турина, 1998). Индивидуальную фаговую бляшку размером приблизительно 1 мм в диаметре вырезали из агара, переносили в 0,5 мл SM-буфера и инкубировали в термостате при 37С 30-60 мин. для диффузии фаговых частиц в буфер. Для получения фагового лизата в колбу с 75 мл среды LB (с добавлением MgS04 до конечной концентрации 10 шМ) помещали 25 мкл фагового стока и 5-7 мл ночной культуры клеток ТАР-90 и выращивали ночь на качалке при 39С. Затем, если наблюдали избыток клеток и отсутствие лизиса, суспензию разводили средой в два раза и выращивали еще 2-3 часа. Если лизат был очень светлым и клеток практически не было, то добавляли 20-50 мл ночной культуры клеток и также инкубировали 2-3 часа до оптимального лизиса. Получив лизат, к нему добавляли 3 мл хлороформа и инкубировали 15 мин при сильном перемешивании. Лизат центрифугировали при 8000 об/мин на центрифуге Beckman в роторе JA17 10 мин. Супернатант переносили в чистые пробирки и центрифугировали при 17 000 об/мин 20 мин в том же роторе. Осадок суспендировали в 600 мкл SM-буфера и переносили в пробирку Eppendorf. Центрифугировали 1 мин при 14000 об/мин на центрифуге Eppendorf. Супернатант переносили в новую пробирку, добавляли SDS до конечной концентрации 0,12%, ЭДТА до 8 мМ и РНКазу А до 200 мкг/мл. Инкубировали 30-60 мин при 65С. Добавляли равный объем насыщенного водой фенола, рН 8.0, энергично встряхивали в течение минуты, центрифугировали 10 мин. Водную фазу отбирали и дважды обрабатывали хлороформом аналогичным образом. ДНК осаждали добавлением 0,1 объема раствора ЗМ CH3COONa (рН 4,8) и 0,8 объема изопропанола. Затем ценрифугировали 10 мин при 14000 об/мин на центрифуге Eppendorf, осадок промывали 70% этанолом, подсушивали и растворяли в необходимом количестве воды. Для первичного анализа проводили гидролиз фаговых клонов рестриктазой ЕсоШ с последующей блот-гибридизацией по Саузерну (Забаровский, Турина, 1998).
Сравнительный анализ ортологичных последовательностей гена Oct4 млекопитающих
Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов Oct4 семи видов млекопитающих (полевки, мыши, крысы, человека, шимпанзе, быка и собаки), проведенный с помощью программы PipMaker, показал наличие высокого уровня гомологии в экзонах генов Oct4 (Рис. 4). Кроме того, в регуляторной области генов Oct4 обнаружены участки высокой гомологии, соответствующие проксимальным и дистальным энхансерам генов Oct4. В первом интроне и 3 -области наблюдаются районы низкой гомологии (ниже 50%), что обусловлено наличием видоспецифичных SINE элементов (Рис. 4; Таб. 7).
Произведено выравнивание полученной последовательности гена Oct4 полевки с последовательностями генов Oct4 шести видов млекопитающих (мыши, крысы, человека, шимпанзе, быка и собаки), взятых из баз данных. Числовые значения гомологии нуклеотидной последовательности пяти экзонов Oct4 млекопитающих, вовлеченных в сравнительный анализ, отражены в таблице 9. Наибольшее сходство во всех парах сравниваемых видов наблюдается во втором и третьем экзонах, которые кодируют основную часть ДНК-связывающего POU-домена белка ОСТ4 (Таб. 9). Наибольшее среднее значение гомологии кодирующей части гена Oct4 полевки наблюдается с мышью и крысой, наименьшее — с собакой (Таб. 9). Высокий уровень гомологии (75-95%) характерен в основном только для экзонов. В интронах, 5 и 3 области гомология ниже (55-70%), особенно в участках, где локализуются видоспецифические мобильные элементы (Таб. 9).
При сравнении аминокислотной последовательности гена Oct4 на высоком уровне во всех парах сравниваемых видов сохраняется сходство POU-домена (Рис. 5; Таб. 9). Наибольший уровень гомологии наблюдается между полевкой и быком, человеком и собакой (94 %), наименьший — между полевкой и мышью (91 %). Таким образом, гомология аминокислотной последовательности POU-домена более эволюционно далеких видов (полевка - бык, полевка - человек, полевка - шимпанзе, полевка - собака), оказалась несколько более высокой, чем в парах эволюционно близких видов, относящихся к одному отряду (полевка - мышь, полевка - крыса). Однако, на уровне общей гомологии белков ОСТ4 анализируемых видов млекопитающих подобная ситуация не повторяется. Наибольший общий уровень гомологии белков ОСТ4 обнаружен между полевкой и крысой (87 %) (Таб. 9).
Регуляторная область гена Oct4 была исследована на предмет наличия консервативных элементов, которые могут быть задействованы в регуляции гена Oct4. Детально проведено сравнение проксимального энхансера, содержащего мотив GGGAGGG, дистального энхансера, включающего мотив СССТССС, и минимального промотора, имеющего в составе мотив GGGGGCGGGG (Рис. 6; Рис. 7 А, Б). Эти три мотива регуляторной области Oct4 в эмбриональных стволовых клетках и клетках эмбриональной карциномы мыши по результатам in vivo футпринтинга являются сайтами связывания транскрипционных факторов. При обработке клеток ретиноевой кислотой наблюдается потеря способности связывания транскрипционных факторов с этими мотивами, что вызывает подавление экспрессии гена Oct4 и дифференцировку клеток (Minucci et al, 1996). Кроме того, установлена консервативность еще ряда сайтов, находящихся в регуляторной области, которые имеют сходство с данными мотивами, и предполагается, что они тоже могут принимать участие в регуляции экспрессии Oct4. Сходство минимального промотора у разных видов млекопитающих составляет 83-98%. Последовательность GGGGGCGGGG (позиции -126/-117 у полевки) у полевки и других млекопитающих, находящаяся в его составе, сохраняется практически в неизмененном состоянии. Она является потенциальным сайтом связывания транскрипционных факторов семейства Sp, частично перекрывает гормон-чувствительный элемент (HRE) (позиции -119/-101 у полевки), чувствительный к ретиноевой кислоте, и опознается рядом ядерных рецепторов (Okazawa et al, 1991; Sylvester, Scholer, 1994; Minucci et al, 1996; Yeom et al, 1996; Nordhoff et al, 2001). Однако не все элементы базального промотора гена Oct4 проявляют одинаковую степень консервативности. Мотив GGGTGGG (-98/-92) гомологичен на 100% в последовательностях всех видов, кроме собаки. Мотив СССАССС (-159/-153) полностью идентичен в последовательностях мыши, коровы и собаки, в то время как у крысы, человека и шимпанзе он изменен. Сайт GGGAGGG (позиции -76/-71 в последовательности мыши), идентичный у шести сравниваемых видов, у полевки частично изменен и представлен последовательностью GGGAAGG. Через один нуклеотид от этого сайта в последовательности полевки расположен другой GC-богатый сайт GGGCGGG (-79/-73), отсутствующий в последовательностях других видов (Рис. 6).
