Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Метилирование ДНК в норме и при патологии (обзор литературы) 15
1.1. Феномен метилирования ДНК 15
1.1.1. Количество и распределение динуклеотидов CpG в геноме 17
1.1.2. Профили метилирования 19
1.1.3. Ферменты метилирования 20
1.1.4. Метилирование генома как динамический процесс 22
1.1.5. Влияние метилирования ДНК на структуру хроматина 24
1.1.6. Методы анализа метилирования ДНК 28
1.2. Метилирование ДНК и наследственная патология 33
1.2.1. Общие представления об импринтинге 34
1.2.2. Механизмы геномного импринтинга 39
1.3. Эпигенетическая регуляция экспрессии генов и канцерогенез 47
1.3.1. Молекулярные механизмы канцерогенеза 49
1.3.2. Гены-супрессоры опухолевого роста 50
1.3.3. Взаимодействие генов, регулирующих клеточный цикл 53
1.3.4. Двухударная модель канцерогенеза 57
1.3.5. Метилирование генов, вовлеченных в канцерогенез 58
Глава 2. Материалы и методы 65
2.1. Характеристика пациентов 65
2.2. Забор крови и операционного материала 66
2.3. Выделение геномной ДНК 66
2.4. Обработка ДНК эндонуклеазами рестрикции и электрофорез при проведении блот-гибридизации 67
2.5. Гибридизация с радиоактивно меченым зондом 68
2.6. Полимеразная цепная реакция (ПНР) 69
2.6.1. Микросателлитный анализ делеций и ОРД при СПВ и СА 69
2.6.2. Микросателлитный анализ ОРД при СВБ и нефробластоме 70
2.6.3. Микросателлитный анализ делеций и ПГ при ретинобластоме 70
2.6.4. Полимеразная цепная реакция кодирующих районов гена RB1 71
2.6.5. Метил-специфическая ПЦР при СПВ и СА 73
2.6.6. Метил-чувствительная ПЦР CpG-островков генов IGF2 \\LIT1 при СВБ 75
2.6.7. Метил-чувствительная ПЦР фрагментов CpG-островков района X(q27.3-q28) приСМБиНСУО 76
2.6.8. Метод метил-чувствительной ПЦР промоторных районов генов-супрессоров 77
2.7. Детекция точковых мутаций методом SSCP 78
2.8. Анализ гетеродуплексов (НА) 79
2.9. Автоматическое секвенирование 79
2.10. Программное обеспечение компьютерного анализа ДНК 80
Глава 3. Синдромы Прадера-Вилли и Ангельмана как модель изучения патологии импринтинга 81
3.1. Клиническая характеристика синдрома Прадера-Вилли 81
3.2. Клиническая характеристика синдрома Ангельмана 82
3.3. Молекулярная организация хромосомного района 15(ql 1 - ql3) 82
3.4. Формы молекулярной патологии, вызывающие СПВ и СА 85
3.4.1. Делеции критического района 15(qll - ql3) 85
3.4.2. Однородительская дисомия , 87
3.4.3. Мутации центра импринтинга 90
3.5. Гены-кандидаты и их возможное участие в формировании фенотипических проявлений СПВ и СА 97
3.5.1. Гены-кандидаты для СПВ 97
3.5.2. Гены-кандидаты для СА 102
3.6. ДНК-диагностика СПВ и СА 104
3.6.1. Анализ аллельного метилирования локусов хромосомного района 15(ql l-ql3) 104
3.6.1.1. Блот-гибридизационный анализ с использованием метилчувствительных рестриктаз 105
3.6.1.2. Бисульфитная модификация ДНК и метилспецифическая ПЦР 107
3.6.2. Анализ микросателлитного полиморфизма локусов хромосомного района 15(qll-ql3) 110
Глава 4. Синдром Видемана-Беквита и нефробластома как модель потери импринтинга 114
4.1. Клинико-генетическая характеристика синдрома Видеманна-Беквита 114
4.2. Молекулярная организация импринтированного района хромосомы 11р15.5 и гены, вовлеченные в формирование фенотипических признаков СВБ 116
4.3. Тонкая структурно-функциональная организация района, содержащего гены HJ9uIGF2 120
4.4. Молекулярная патология, приводящая к СВБ 122
4.5. Молекулярная диагностика СВБ и нефробластомы 124
Глава 5. Синдром Мартина-Белл, неспецифическая умственная отсталость FRAXE и метилирование районов экспансии тринуклеотидных повторов 130
5.1. Клинико-генетическая характеристика и молекулярно-генетические основы синдрома Мартина-Белл 130
5.1.1. Клиническая характеристика синдрома Мартина-Белл 130
5.1.2. Цитогенетические основы СМБ 131
5.1.3. Особенности наследования СМБ. Парадокс Шермана 131
5.1.4. Молекулярно-генетические основы СМБ 133
5.2. Клиническая характеристика, цитогенетические и молекулярно генетические основы УО FRAXE и FRAXF 137
5.2.1. Клиническая характеристика и цитогенетические основы УО FRAXE и FRAXF 137
5.2.2. Молекулярно-генетические основы УО FRAXE и FRAXF 138
5.3. Роль импринтинга и эффекта положения в развитии СМБ и УО FRAXE 139
5.4. Гиперметилирование амплифицированных CGG-повторов 141
5.4.1. Механизмы гиперметилирования CGG-повторов 141
5.4.2. Реализация эффектов метилирования CGG-повторов 143
5.5. Методы ДНК-диагностики СМБ, УО FRAXE и FRAXF 144
5.5.1. ДНК-диагностика СМБ 144
5.5.2. ДНК-диагностика УО FRAXE и FRAXF 150
5.5.3. Детекция экспансии тринуклеотидного повтора CGG методом блот-гибридизации 151
5.5.4. Анализ метилирования CpG-островка гена FMR1. 154
5.5.4.1. Совместный анализ метилирования CpG-островка FMR1 и экспансии CGG-повтора 154
5.5.4.2. Изолированный тест на метилирование с использованием блот-гибридизации 155
5.5.4.3. Анализ метилирования с использованием ПНР 156
5.5.5. Совместный анализ метилирования CpG-островков, прилежащих к ломким участкам FRAXA, FRAXE и FRAXF 162
5.5.6. Сравнительный анализ подходов к ДНК-диагностике СМБ и УО FRAXE Современный протокол лабораторной диагностики СМБ 166
Глава 6. Вклад эпигенетических нарушений в генез ретинобластомы 169
6.1. Клинико-генетическая характеристика ретинобластомы 169
6.2. Структура и функция гена RB1 170
6.3. Роль Р В1 в регуляции клеточного цикла 172
6.4. Молекулярная патология в ретинобластомах 175
6.4.1. Структурные мутации TQH&RBI в спорадических ретинобластомах 175
6.4.2. Потеря гетерозиготносте 180
6.4.3. Профиль метилирования генов-супрессоров в ретинобластомах 182
6.5. Алгоритм проведения ДНК-диагностики при ретинобластоме 190
Глава 7. Профиль метилирование генов-супрессоров в спорадических раках молочной железы и эпителиальных дисплазиях шейки матки 192
7.1. Профиль метилирования генов-супрессоров в спорадических раках молочной железы 192
7.2. Профиль метилирования генов-супрессоров в эпителиальных дисплазиях шейки матки 197
7.3. Возможность и необходимость разработки протоколов для ранней ДНК диагностики опухолеобразования 202
Общее заключение 204
Выводы 212
Список литературы 214
- Методы анализа метилирования ДНК
- Гены-кандидаты для СПВ
- ДНК-диагностика СМБ
- Профиль метилирования генов-супрессоров в ретинобластомах
Методы анализа метилирования ДНК
Современные методы анализа метилирования ДНК в геноме можно условно разделить на две группы. К первой можно отнести методы анализа мехижфсванщ. известных генов, которые используются в практической ДНК-диагностике. Эти методы достаточно просты в исполнении, эффективны и экономичны. Вторая группа методов предназначена для анализа статуса метилирования всего генома, для поиска аномалий метилирования генов в определенном типе опухолей или на разных стадиях онкологического процесса и для поиска новых генов, вовлеченных в канцерогенез. Эти методы более трудоемки, капризны, не экономичны и не могут быть использованы, как рутинные. Первая группа методов.
1. Метил-чувствительная полимеразная цепная реакция (МЧ-ПЦР) основана на использовании рестрикционных эндонуклеаз, чувствительных и нечувствительных к метилированию остатков цитозина (такие пары, как НраІІ и МзрІ, Smal и Xmal). Для анализа метилирования конкретных специфических последовательностей можно использовать и другие метилчувствительные рест-риктазы (Hhal, EagI, NotI, SacII и др.), но наиболее эффективными, все-таки, являются часто ще-пящие НраІІ и Hhal, т.к. районы CpG- островков имеют множество сайтов их узнавания, что практически устраняет возможность неполного гидролиза. Если фрагмент ДНК не содержит модифицированных оснований, то гидролиз проходит полностью, ПЦР не идет и, соответственно, ее продукт не определяется (рис. 4). В то же время, если в сайте узнавания рестриктазой вместо цитозина присутствует метил-цитозин, то гидролиз не происходит и в геле выявляется фрагмент определенной длины. Единственным недостатком этого метода является то, что могут быть проанализированы только CpG- динуклеотиды, попадающие в сайт узнавания конкретной рестриктазы (Стрельников и др., 1999).
2. Метил-специфическая полимеразная цепная реакция (МС-ПЦР) - метод, позволяющий оценить статус метилирования индивидуальных CpG-островков (рис. 5). Его большим достоинством является высокая чувствительность, позволяющая анализировать метилированные аллели в присутствии большого избытка аллелей дикого типа. Процедура состоит в предварительной обработке тестируемых ДНК бисульфитом натрия, что при определенных условиях приводит к деза-минированию цитозина с образованием урацила, тогда как метилированные остатки цитозина остаются неизменными. При последующей ПЦР урацил заменяется на тимин.
Таким образом, оказывается возможным конструировать праймеры, избирательно амплифици-рующие последовательности, содержащие или не содержащие метилированные остатки цитозина в CpG-островках (Herman et al., 1996). Чувствительность метода составляет: 1 метилированный аллель на 1000 неметилированных. Преимуществами МС-ПЦР являются: а) возможность анализа на малом количестве ДНК; б) высокая чувствительность и специфичность; в) простота и скорость выполнения диагностики.
3. На основе бисульфитной модификации ДНК разработано несколько вариантов метода, в том числе и картирование всех метилированных цитозиновых остатков в известной последовательности ДНК. Метод, как и предыдущий, основан на превращении всех неметилированных остатков цитозина в урацил в результате обработки ДНК бисульфитом натрия. В результате модификации нити ДНК оказываются некомплементарными друг другу. Амплификация исследуемой последовательности с помощью ПЦР и последующее прямое секвенирование выявляют как цитозин только те цитозиновые остатки, которые в исходной нити были метилированы. Метод позволяет выявлять те динуклеотиды CpG в составе островков, метилирование которых необходимо и достаточно для подавления транскрипции соответствующего гена (Clark et al., 1994).
Вторая группа методов.
4. Амплификация метилированных CpG-островков - основанный на ПЦР метод, позволяющий избирательно амплифицировать CpG-островки, дифференциально метилированные в нормальных и опухолевых клетках. ДНК вначале обрабатывают рестриктазой Smal (сайт узнавания CCCGGG не расщепляется, если он содержит 5-метилцитозин), которая дает фрагменты с «тупыми» концами. Метилированные сайты CCCGGG затем расщепляются рестриктазой Xmal, которая формирует фрагменты с «липкими» концами. Именно последние способны взаимодействовать с адаптерами и быть амплифицирован-ными в последующей ПНР. В сочетании с методом репрезентативного дифференциального анализа этот подход позволяет избирательно амплифицировать CpG-островки, аберрантно метилированные в опухолевых клетках. Метод может быть использован для поиска новых генов, подвергающихся метилированию в опухоли (Toyota et al., 1999). Существенными ограничениями являются: 1) отсутствие соответствующих сайтов рестрикции в островке и 2) неполный гидролиз ДНК.
5. Рестрикционно-ориентированное геномное сканирование позволяет одновременно анализировать статус метилирования в геноме нескольких тысяч CpG-островков. Суть его заключается в разделении двумерным электрофорезом рестрикционных фрагментов, по лученных обработкой геномной ДНК несколькими рестриктазами. Вначале ДНК обрабатывают крупно щепящей рестриктазой NotI, которая расщепляет только неметилиро-ванные CpG. После мечения концов полученных фрагментов радиоактивной меткой, их обрабатывают вторым ферментом (например, EcoRV) для уменьшения их размеров, а продукты гидролиза разделяют в первом направлении - в капилляре с агарозным гелем. Разделенные фрагменты Notl/EcoRV обрабатывают в геле еще одним ферментом (например, Hinfl), после чего проводят электрофорез в полиакриламидном геле во втором направлении. Гель автографируют и в результате выявляют множество пятен, по интенсивности которых судят о степени метилирования соответствующего CpG-островка, т.к. положение пятен строго определено. Интенсивность пятна, принятая за нормальную, свидетельствует о неметилированном статусе обоих аллелей, наполовину сниженная - о метилировании одного из аллелей, исчезновение пятна - о метилировании обеих аллелей, т.к. соответствующий сайт не расщепляется NotI. Метод трудоемок, интерпретация результатов не однозначна и он может быть использован только для поиска новых CpG-островков генов, метилированных в определенном типе опухоли (Costello et al., 2000).
6. Еще одним многообещающим подходом, разрабатываемым в последнее время, является метилспецифический фингерпринтинг (МСФ). Этот метод направлен на выявление аномального метилирования новых генов, вовлеченных в канцерогенез, в различных формах опухолей или на разных стадиях злокачественного процесса. В качестве первого шага проводится гидролиз геномной ДНК с использованием двух ферментов рестрикции, один из которых является метилчувствительным. В первом варианте метода олигонуклеотид-ные праймеры для ПЦР являются неспецифическими, содержащими только цитозин и гуанин, что характерно для CpG-островков промоторных областей генов. Во втором варианте метода могут быть использованы наборы специфических праймеров для CpG-островков определенных генов, но ПЦР проводится в очень мягких условиях. В результате неспецифической амплификации и электрофореза наблюдается набор полос различной молекулярной массы (фингерпринт). Сравнение картины амплификации, полученной на образцах ДНК из нормальных тканей и опухолевого материала позволяет определить необычные фрагменты, которые могут свидетельствовать об аномальном метилировании какого-либо гена/генов при заболевании. Получаемая картина достаточна, сложна, т.к. в опухоли происходит инактивация/активация не только явных генов-супрессоров, но и многих тканеспецифических генов, а новые фрагменты могут, как появляться, так и исчезать. Такие фрагменты клонируют, секвенируют и определяют принадлежность к определенному гену. Если нуклеотидная последовательность не имеет гомологии с уже известными последовательностями в базах данных, можно предполагать наличие нового гена, клонирование и картирование которого является технологическим процессом. В результате такого подхода уже определено несколько новых генов вовлеченных в опухолевый процесс (Huang et al., 1997).
7. В настоящее время предпринимаются шаги по разработке микрочиповой диагностики статуса метилирования про моторных районов генов. Метод будет, применим как для исследовательских работ, так и для рутинной ДНК-диагностики.
Гены-кандидаты для СПВ
СПВ сопровождается потерей функции генов критического района 15(qll - ql3), которые в норме экспрессируются только на хромосоме отцовского происхождения (SNRPN, NDN, IPW, ZNF127, MAGEL2), однако точковых мутаций, приводящих к СПВ, ни в одном из этих генов показано не было. На сегодняшний день имеются единичные сообщения о случаях сбалансированных транслокаций у пациентов с СПВ, при которых в разных сочетаниях нарушалась функция отдельных генов на отцовской хромосоме (Соп-roy et al., 1997; Kuslich et al., 1999). Однако до сих пор неизвестно, какой именно ген ответствен за все (или большинство) фенотипических проявлений СПВ. Гены расположены в центромерной части критического района 15(qll -ql3) и занимают примерно половину его протяженности. Среди локусов, активных исключительно на отцовской хромосоме, на сегодняшний день известно 4 белок-кодирующих гена: SNRPN (small nuclear ribonucloprotein polipeptide N), NDN (necdin), ZNF127 (zinc finger protein) и MAGEL2 (Lee et al., 2000), а также 7 локусов, кодирующих нетранслируемые мРНК: ZNF127AS, PAR5, PARSN, IPW, PWCR1, C15orf2 и PARI.
SNURF-SNRPN
Моноаллельная экспрессия на отцовской хромосоме первоначально была показана для гена SNRPN, кодирующего полипептид N малого ядерного рибонуклеопротеина (мяРНП) (Ozceliket al., 1992). Впоследствии было сделано предположение о возможной роли локуса SNRPN в регуляции экспрессии импринтированных генов критического района, а также более детально изучена структура, функция и молекулярная эволюция этого локуса (Gray etal., 1999).
Ген SNRPN состоит из 10 экзонов и имеет необычную для эукариот бицистронную структуру, т.е. его мРНК-транскрипт содержит 2 неперекрывающиеся рамки считывания для двух различных белковых продуктов (Reed et al., 1994). Один из них - белок SNURF (SNRPN upstream reading frame) - состоит из 71 аминокислоты и кодируется экзонами 1 -3. Второй продукт этого гена - полипептид N (SmN) состоит из 240 аминокислот и кодируется экзонами 4 -10 (Gray et al., 1999) (рис. 11).
Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей каждого из этих белков у представителей разных групп млекопитающих выявил их высокую консервативность в эволюции, что позволяет предполагать их участие в важнейших клеточных процессах. У пациентов с СПВ отсутствует экспрессия обоих продуктов гена SNRPN, поэтому каждый из них может быть вовлечен в патогенез этого синдрома.
Анализ экспрессии гена SNURF-SNRPN на уровне транскрипции методом Нозерн блот-гибридизации показал присутствие бицистронного SNURF-SNRPN-транскрипта во всех исследованных тканях человека (сердце, мозг, плацента, легкие, печень, скелетные мышцы, почка, поджелудочная железа). Помимо двойного SNURF-SNRPN-транскрипта, в тканях почки и мышц человека обнаружена укороченная мРНК, которая соответствует 1-3 экзонам гена SNURF-SNRPN. Это указывает на возможность автономной транскрипции SNURF-цистрона у человека благодаря наличию дополнительного ЗЬ-экзона, содержащего сигнал полиаденилирования ААТААА. В отличие от человека, у мыши SNURF-ыРИК обнаруживается только в составе бицистронного SNURF-SNRPN-транскрипта (Gray at al., 1999). Функциональное назначение белка SNURF пока неизвестно.
Второй продукт гена SNRPN - полипептид N (SmN) является компонентом малых ядерных рибонуклеопротеинов (мяРНП). Малые ядерные рибонуклеопротеины (мяРНП) представляют собой комплексы малых ядерных РНК (мяРНК) с белками. Они участвуют в построении сплайсосомы и обеспечивают механизмы вырезания интронных последовательностей из первичных транскриптов эукариотических генов.
Поскольку центр импринтинга перекрывает про моторную область и 1-й экзон гена SNURF-SNRPN, и, следовательно, SNURF-цистрон является единственной белок-кодирующей последовательностью в составе центра импринтинга, возникает предположение о возможном участии SNURF-белка в регуляции экспрессии импринтированных генов на отцовской хромосоме.
Роль SNURF-цистрона в патогенезе СПВ подтверждается наблюдением двух пациентов с классической клинической картиной заболевания, имеющих сбалансированные транслокации с вовлечением отцовской хромосомы 15, при которых точка разрыва находится внутри цистрона SNURF, а экспрессия всех импринтированных локусов на отцовской хромосоме, кроме SNURF, сохранена (Kuslich et al., 1999). Кроме того, у экспериментальных мышей с нарушенной рамкой считывания Snrpn-полипептида наблюдали отсутствие каких-либо изменений фенотипа, характерных для мышиной модели СПВ (Shemer et al., 1997). Однако были также описаны два других случая сбалансированных транслокаций у пациентов с нетипичными проявлениями СПВ, когда точка разрыва не затрагивала SMJRF-цистрон, а находилась дистальнее локуса SNURF-SNRPN (Conroy et al., 1997, Schulze et al., 1996). Следовательно, причиной развития СПВ нельзя считать нарушение экспрессии одного только SNURF-цистрона.
ZNF127
В 1992 г. были обнаружены два других локуса с дифференциальным метилированием на отцовской и материнской хромосомах - D15S63 (PW7I) и D15S9 (ZNF127), которые расположены проксимальнее локуса SNRPN, в центромерной части критического района 15(qll - ql3). Впоследствии выяснилось, что локус D15S9 (ZNF127) кодирует два перекрывающихся гена ZNF127 и ZNFJ27AS, причем оба транскрибируются только на отцовской хромосоме в противоположных направлениях (Jong et al., 1999). Белковый продукт обнаружен только для гена ZNF127, a ZNFI27AS (antisense) кодирует антисмысловой по отношению к ZNF127 транскрипт. Ген ZNF127AS занимает 5 т.п.н. геномной ДНК, содержит 2 экзона (X и Y) и единственный интрон протяженностью 2 т.п.н. Открытая рамка считывания для белка из 507 аминокислот, продукта ZiVF727-reHa, обнаружена на антисмысловой цепи ZNFI27AS-KJJ K. В 5 -части гена ZNF127 найден типичный для млекопитающих CpG-островок длиной 0,7 - 1,0 т.п.н. с содержанием C+G 60%. Именно в этом CpG-островке показаны различия метилирования на двух родительских хромосомах. Кроме того, в 5 -районе гена ZNF127 обнаружены мотивы, распознаваемые некоторыми транскрипционными факторами: РЕАЗ, SRE, SRYn HMG. Ген ZNF127 не содержит интронов, но имеет З -нетранслируемую область. Вся кодирующая последовательность и CpG-островок гена ZNF127 соответствуют экзону Y гена ZNF127AS, а 3 -концевая часть расположена в интроне ZNF127AS. Таким образом, D15S9 представляет собой комплексный локус для двух генов, транскрибирующихся на разных цепях ДНК (Jong et al., 1999).
Экспрессия гена ZNF127 на уровне транскрипции показана методом Нозерн-блот гибридизации во всех тканях взрослого человека, с максимальным уровнем ZNF127-MPHK В семенниках. Максимальный уровень содержания ZNF127ASpaHCKpnnra наблюдается в мозге и легких, а в большинстве других тканей взрослого человека транскрипция этого гена методом Нозерн-блот гибридизации не выявляется.
При изучении экспрессии генов ZNF127 и ZNF127AS в фибробластах кожи методом RT-PCR г№і27-специфичньш продукт обнаруживался только в фибробластах нормальных людей и пациентов с С А, но отсутствовал в случае СПБ. Следовательно, ген ZNF127 экспрессируется в фибробластах кожи моноаллельно на отцовской хромосоме (Jong et al., 1999).
Продукт гена ZNF127 - белок, состоящий из 507 аминокислот, который содержит нескольких мотивов типа «цинковых пальцев», принадлежащих к разным классам, обеспечивает ему возможность специфических взаимодействий с большим количеством различных молекул и предполагает многообразие выполняемых функций.
Поскольку полное метилирование и импринтинг для гена ZNF127 показаны только в мозге и в гаметогенных тканях, высказывается мнение, что потеря экспрессии отцовского аллеля именно в этих органах критична при развитии таких симптомов СПВ, как ожирение, гипогонадизм, психические расстройства, бесплодие (Jong et al., 1999). Однако делегирование гена Znfl27 у экспериментальных мышей не сопровождалось ожирением и бесплодием, поэтому окончательные выводы об участии гена ZNF127 в патогенезе СПВ, делать преждевременно.
NDN
Некдиновый ген NDN локализован в критическом районе 15(qll-ql3) с З -стороны от гена ZNF127. Ген МЖне содержит интронов и кодирует белок протяженностью 321 аминокислоту. В 5 -части гена, рядом с сайтом инициации транскрипции, обнаружена CpG-богатая промоторная область и установлено метилирование сайтов узнавания эндонук-леазы Eagl в промоторной области на неактивном материнском аллеле. Транскрипционная инактивация материнской копии гена NDN, подобно другим импринтированным локусам SNRPNn ZNF127, обусловлена метилированием промоторной области (Jay et al., 1997).
Продукт гена NDN является супрессором роста нейронов и функционирует подобно ре-тинобластомному белку RB1, одному из наиболее изученных супрессоров опухолевого роста. Как и RB1, некдин связывает транскрипционный фактор E2F1 и задерживает переход Gl-стадии клеточного цикла в стадию S. В эксперименте также показано, что некдин подавляет рост RB1-дефицитных SAOS-2 клеток остеосаркомы. Таким образом, некдин является супрессором нейронального роста (Jay et al., 1997).
Поскольку среди всех изученных отделов мозга мыши максимальное содержание некди-новой мРНК обнаружено в нейронах гипоталамуса, а клиническая картина СПВ у человека в значительной степени представлена симптомами дисфункции именно этого отдела мозга (ожирение, гипогонадизм), можно предполагать, что патогенез СПВ, по крайней мере, частично, обусловлен нарушением дифференцировки нейронов гипоталамуса (Muscatelli et al., 2000).
В связи с тем, что никаких точковых мутаций в генах-кандидатах не выявлено, а на модельных животных показано, что отсутствие любого из этих генов приводит к определенным аномалиям, СПВ можно охарактеризовать как синдром последовательности имприн-тированных генов, имеющих отцовскую экспрессию, а сам критический район - как комплекс импринтинга (contiguous gene imprinting complex).
ДНК-диагностика СМБ
За годы, прошедшие со времени открытия гена FMR-1 и характеристики мутации при СМБ, было предложено несколько концепций ДНК-анализа при этом заболевании. В настоящее время наиболее широко распространены протоколы, основанные на использовании метода гибридизации по Саузерну с использованием различных систем ДНК-зондов. ДНК-зонды для диагностики СМБ представляют собой фрагменты 1-го экзона гена FMRJ, расположенные вблизи гипервариабельной области гена. Гибридизация с этими зондами образцов ДНК, обработанных соответствующими эндонуклеазами рестрикции, позволяет не только определить размеры амплифицированного участка, т.е. число CGG повторов, но и оценить степень метилирования CpG-островка промоторной области гена. Предложенные системы ДНК-зондов уже широко используются как для дифференциальной диагностики СМБ, в т.ч. и пренатальной, так и для выявления бессимптомного носи-тельства, т.е. состояния премутации гена FMR1.
Впервые такой подход был продемонстрирован Oberle и др., разработавшими систему ДНК-зондов на основе клонов StB12 (StB 12.1 -StB 12.5) и StA22 (рис. 23). Авторы предложили использовать систему ВапУ StB12.3 для выявления мутаций в гене FMR-1 и систему ВапУ StA22 для анализа метилирования прилегающего CpG-островка (Oberle et al., 1991).
Учитывая индивидуальные различия длины вариабельной части гена в норме (от 2 до 54 CGG-повторов), метод блот-гибридизации по Саузерну в системе EcoRI+Eagl/StB12.3 позволяет идентифицировать в контрольных образцах ДНК один фрагмент длиной 2,7-2,8 т.п.н. у мужчин и два фрагмента длиной 2,7-2,8 и 5,1-5,2 т.п.н. у женщин. Рисунок 24 объясняет выявление фрагментов указанных длин при использовании системы EcoRI+Eagl/SiBl2.3. Эта же система выявляет фрагменты длиной (2,7-2,8 т.п.н.)+т, где т - приращение длины повтора CGG при премутации в каждом конкретном случае, выраженное в т.п.н. У больных мужчин в этой системе выявляется фрагмент длиной (5,1-5,2 т.п.н.)+М, где М - длина инсерции CGG-повтора при полной мутации. Увеличение постоянной составляющей в этой формуле с 2,7-2,8 т.п.н. до 5,1-5,2 т.п.н. связано с неспособностью фермента Eagl распознавать сайт рестрикции, метилированный у больных с полной мутацией.
В случае больных женщин и женщин - носительниц премутации получаемые гибриди-зационные сигналы более сложны и разнообразны, что обусловлено, в частности, неоднозначностью процесса случайной Х-инактивации (Rousseau, 1994). В наиболее простом случае у женщины - носительницы премутации выявляются четыре полосы (рис. 25, дорожка 3), две из которых имеют нормальную длину, а длины двух других описываются формулой Nx+m, где Nx - длины каждого из двух нормальных фрагментов. Что же касается больных женщин, у них наиболее простая гибридизационная картина представляет собой три полосы - две нормальные, и одна, длина которой равна ]МИНакт.+М (здесь NHHaicr.-длина фрагмента, соответствующего инактивированной Х-хромосоме).
Гибридизационная картина может осложняться мозаицизмом, как по метилированию, так и по числу CGG-повторов; неоднозначностью процессов Х-инактивации и рядом других факторов. Некоторые, наиболее распространённые, варианты представлены на рис.22 .
Несмотря на то, что использование системы EcoRl+EagVStB 12.3 приводит к получению столь разнообразных результатов, она остаётся самой популярной системой молекулярной диагностики СМБ. По данным Rousseau (1994), во всём мире с её помощью тестируется приблизительно вдвое больше пациентов, чем с помощью всех остальных предложенных на настоящий момент систем ДНК-диагностики СМБ (Rousseau, 1994). Привлекательность её обусловлена двумя основными причинами. Во-первых, использование EcoRl+EagL StB12.3 позволяет оценивать в одном тесте не только размер гипервариабельного участка гена FMR1, но и статус метилирования прилегающего CpG-островка. Во-вторых, длина фрагментов, получаемых после обработки геномной ДНК рестриктазами EcoRI+EagI, видимо, является оптимальной для выявления мутаций экспансии в гене FMR1,
Длина исследуемых фрагментов ДНК играет огромную роль при постановке диагноза мозаикам, в клетках периферической крови которых экспрессируется широкий спектр мутационных и премутационных аллелей различной длины. Гибридизационная картина в таких случаях может представлять собой сильно размытый шмер, который будет тем менее чётким, чем короче анализируемые фрагменты ДНК, поскольку короткие фрагменты лучше разделяются в агарозном геле. По этой причине в настоящее время практически не используются для постановки диагнозов пациентам с подозрением на СМБ такие системы, как РяЯ/ргхаЗ, PM/StB12.XX и т.п., обладающие более высоким разрешением, чем EcoRl+Eagl/StB\2.3. Некотрые авторы считают, что выявление слабовыраженного шмера системой EcoRl+Eagl/StBl2.3 служит показанием к применению систем с ещё более низким разрешением. Так, при гибридизации зонда StB12.3 с более крупным фрагментом ДНК после рестрикции образца эндонуклеазой BglR можно получить более определённую картину, т.к. это позволяет "сжать" шмер и сделать его более отчётливым.
Недостатком всех систем зондовой ДНК-диагностики СМБ, основанных на использовании одной рестриктазы (Psfl/pfxa3, PstVStB12.XX, EcoRIflindttl /StB12.3, EcoRl,Hindill/Oxl .9, EcoRi,Hmdill/pP2 и др.) является невозможность с их помощью оценить состояние метилирования CpG-островка. В то же время одноферментные системы, использующие EcoRl или Hindi.ll, визуализируют фрагменты ДНК, длина которых оптимальна для выявления премутаций (5,1-5,2 т.п.н. в норме). Кроме того, эти системы проще и дешевле систем двойной рестрикции, что делает их удобными для скрининга больных.
Структурные повреждения гена FMR1, не связанные с экспансией тринуклеотидного повтора CGG, такие как делеции и точковые мутации, как правило, не выявляются методом блот-гибридизации по Саузерну, хотя в литературе описаны крупные делеции области CGG-повтора, обнаруженные именно этим методом (Gedeon et al, 1992; Wohrle et al., 1992).
В последнее время в литературе публикуется множество протоколов использования ГЩР-анализа в качестве диагностического метода при СМБ. Его преимуществом является использование малых количеств ДНК. Однако большинство протоколов с использованием ПНР не избавляет от необходимости проведения последующего блоттинга по Саузерну или использования радиоактивно меченых праймеров. Это обусловлено исключительными техническими трудностями, возникающими при амплификации протяжённого CG-богатого участка ДНК. Низкий выход продукта ПЦР и высокое содержание в нём специфического реактива (7-deaza-dGTP), облегчающего амплификацию этого района, делают невозможным его выявление традиционными нерадиоактивными методами. Кроме того, короткие фрагменты ДНК амплифицируются лучше, что может приводить к гиподиагно-стике СМБ методами ПЦР. Спорными с этой точки зрения можно считать результаты ПЦР-анализа в случаях женщин с полной мутацией (имеющих нормальную Х-хромосому) и мозаиков обоего пола, у которых могут проявляться лишь премутационные аллели, ам-плифицирующиеся значительно эффективнее, чем аллели с полной мутацией. Наконец, ПЦР-анализ не позволяет оценить метилирование CpG-островка, что необходимо для различения крупных премутаций от небольших полных мутаций.
Профиль метилирования генов-супрессоров в ретинобластомах
В результате аномального метилирования блокируется образование белковых продуктов, необходимых для нормальной регуляции клеточного цикла, процессов дифференци-ровки и апоптоза. Происходит, так называемая, функциональная инактивация генов, что может привести к опухолевой трансформации клетки. К настоящему времени определено достаточное количество генов, для которых эпигенетические нарушения являются преимущественным механизмом их инактивации при опухолеобразовании. Это такие гены, как ингибитор циклинзависимых протеинкиназ р16, для которого метилирование промо-торной области является одним из главных механизмом инактивации при меланоме, раке легкого и различных формах лейкозов (Palmisano et al., 2000); Е-кадгерин, продукт которого участвует в формировании межклеточных контактов, и который активно метилируется в опухолях молочной железы и мочевого пузыря. Ген MLH1, участвующий в репарации неспаренных участков ДНК, подвергается метилированию почти в 70-80% случаев опухолей толстого кишечника и т.д.
Аномальное метилирование промоторного района, как механизм инактивации, приводящий к развитию опухоли был описан и для гена-супрессора RB1. Показано, что аномальное метилирование составляет около 10% нарушений, приводящих к развитию ретинобластомы (Lohmann et al., 1997; Stirzaker et al., 1997).
Для оценки статуса метилирования промоторного района гена RB1 нами был выбран метод анализа посредством МЧ-ПЦР, как наиболее эффективный и удобный метод, позволяющий выявить единичные модифицированные нуклеотиды в цепи метилированной матрицы.
Исследуемый CG-богатый фрагмент промоторной области гена RB1 содержит 4 сайта узнавания для метил-чувствительной рестриктазы Hpall (CCGG) и 4 сайта - для рестрик-тазы Hhal (CGCG). Для проведения анализа состояния метилирования RB1 были использованы образцы ДНК 56 образцов спорадической ретинобластомы. По результатам МЧ-ГШР после гидролиза ДНК метил-чувствительными рестриктазами, гиперметилирование промоторной области определено в 14 образцах опухоли (25%) из 56 РБ, что составляет гораздо больший процент, по сравнению с данными литературы (10-15%). Возможно, это обусловлено использованием более чувствительного метода выявления метилирования или особенностями выборки больных. Из 22 случаев с полной структурной инактивацией обеих копий гена в 3 - определено аномальное метилирование промоторной области гена RB1, что указывает также на функциональную инактивацию. В 6 образцах метилирование промоторной области определено совместно с ПГ, а в 2 случаях метилирование сочеталось с мутациями, что приводит к полному экспрессионному молчанию гена RB1, к отсутствию его белкового продукта, и как следствие, развитию ретинобластомы. В трех случаях никаких других событий, приводящих к инактивации гена RB1, кроме метилирования промоторной области, выявить не удалось.
В процессе исследования было показано, что гиперметилирование промоторной области гена RB1, наряду со структурными нарушениями, является важным событием, приводящим к инактивации гена RB1 и к развитию ретинобластомы. Таким образом, были установлены причины инактивации обоих аллелей гена для 30 из 56 обследованных случаев спорадической ретинобластомы. Еще для 21 образца было показано повреждение хотя бы в одном аллеле гена RB1, произошедшее в опухоли. В 6 образцах удалось определить только мутации, в 12 - только потерю гетерозиготносте, и в 3 случаях удалось показать метилирование промоторной области. В оставшихся 5 случаях РБ никакой молекулярной патологии гена RB1 обнаружено не было (табл. 9).
В связи с этим фактом возникла необходимость поиска дополнительных причин приводящих к злокачественной трансформации клетки. Известные факты кооперативного взаимодействия генов в процессе канцерогенеза, позволили предположить возможное участие других генов в ходе развития ретинобластомы.
Ядерный белок р16 является одним из основных регуляторов активности белка RB1, он препятствует образованию функционально активных комплексов циклинзависимых киназ (Cdk4/6) с циклинами D, которые фосфорилируют RB1 и высвобождают фактор транскрипции E2F из комплекса RB1-E2F (Lukas et al., 1995). В результате нормального функционирования р16, RB1 обладает способностью связывать регуляторы транскрипции и препятствует переходу клетки в S-фазу клеточного цикла. Таким образом, изменение активности р16 влияет на функциональные свойства RB1. Кроме того, была показана важная роль совместной инактивации генов-регуляторов клеточного цикла RB1 и pl6/CDKN2A в развитии рака простаты (Jarrard et al., 1999), а также продемонстрировано влияние этих генов на теломеразную активность - существенную для иммортализации опухолевых клеток (Kiyono et al., 1998).
Принимая во внимание функциональное влияние р16 на активность RB1 в ходе регуляции клеточного цикла, нами было выдвинуто предположение о влиянии инактивации гена ріб на развитие ретинобластомы. Для ряда опухолей было показано, что преимущественным механизмом инактивации ріб является метилирование промоторной области этого гена (Belinsky et al., 1998). Поэтому, нами было проведено исследование CpG-островка, расположенного в 5 -области гена/?/б в образцах ретинобластомы методом МЧ-ПЦР. CG-богатый фрагмент промоторной области генаріб содержит 5 участков узнавания для ме-тилчувствительной рестриктазы НраІІ. В процессе исследования был разработан метод совместной оценки статуса метилирования генов ріб и RB1 в образцах ретинобластомы -мультилокусная МЧ-ПЦР (рис. 36).
В ходе исследования, впервые было показано аномальное метилирование промотора гена ріб в ретинобластоме. При изучении статуса метилирования 56 образцов РБ, нами было выявлено 27 случаев (48%) метилирования CpG-островка, расположенного в 5 -области гена р16, что в 2 раза превышает выявленное гиперметилирование промоторной области гена RB1. В 14 образцах ретинобластомы метилирование промоторной области р16 было выявлено наряду с молекулярной патологией в обоих аллелях renaRBl. В 10 образцах спорадической ретинобластомы гиперметилирование гена ріб было определено при неполной инактивации гена RB1, т.е. мутационное событие зарегистрировано только водном аллеле гена. В 2 случаях гиперметилирование промоторной области/?/6 сочеталось с мутациями, определенными в гене RBJ, в 6 - с ПГ по локусу, в котором расположен ген RBJ, а в двух случаях с гиперметилированием гена RB1. В трех оставшихся случаях метилирование промоторной области гена ріб не сочеталось с другими событиями, приводящими к инактивации гена RB1. Совместное метилирование ріб и КВ1 было продемонстрирована в 8 опухолях, в трех случаях - в сочетании с мутацией, в четырех - с ПГ, в одном случае кроме совместного метилирования не было выявлено ни мутаций, ни ПГ.
По-видимому, еще рано говорить об аномальном метилировании р16, как одной из возможных причин развития ретинобластомы, но уже сейчас становится очевидным участие инактивации этого гена в процессе опухолеобразования при РБ. Эти данные позволяют предположить непосредственное влияние инактивации гена р16 на развитие опухолевого процесса в клетках сетчатки, которое опосредуется через снижение активности RB1 и дальнейшее нарушение процессов пролиферации, дифференцировки и апоптоза.
Особого внимания заслуживает факт определения метилирования промотора ріб при полной инактивации обоих аллелей гена RB1. Учитывая влияние одного гена на активность другого, становится трудно удержаться в рамках двухударной модели канцерогенеза, потому что инактивация каждого из этих генов может служить достаточной причиной для развития опухоли. Конечно, можно предположить, что метилирование ріб является следствием уже начавшегося процесса канцерогенеза, но пока достаточно трудно правильно определить причинно-следственные отношения во взаимодействии этих генов.
Изменение клеточной регуляции вследствие инактивации одного из генов-супрессоров резко увеличивает вероятность появления быстро пролиферирующих клонов, в которых постепенно накапливаются и другие онкогенные мутации, ведущие к опухолевой трансформации. Структурные нарушения гена RB1 были обнаружены кроме ретинобластомы и при других злокачественных новообразованиях, например остеосаркомах, опухолях легких (Hensel et al., 1988; Weichselbaum et al., 1988). Кроме того, было показано, что метилирование служит одной из причин инактивации гена RB1 не только в ретинобластомах, но и в некоторых других типах опухолей, таких как нефробластома и хондросаркома (Земля-кова и др., 2002; Lohman et al., 1997). Эти данные подтверждают важную функционально-регуляторную роль гена RB1 в развитии процесса злокачественной трансформации клеток различных тканей организма.
