Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 12
1.1. Гемолизины как группа бактериальных токсинов 12
1.1.1 .Общие сведения о бактериальных токсинах 12
1.1.2. Место гемолизинов в классификации токсинов 12
1.1.3. Гемолизины как факторы патогенности и вирулентности 13
1.1.4. Эволюционная и адаптационная роль гемолизинов 14
1.2. Типы бактериальных гемолизинов 16
1.2.1. Фосфолипазы - цитолизины с ферментативной активностью 16
1.2.2. Порообразующие гемолизины 18
1.2.2.1. Гемолизин Е. coli и семейство RTX 18
1.2.2.2. Гемолизины семейства Proteus/Serratia 19
1.2.2.3. Р-Складчатые каналобразующие цитолизины. Семейство SH-токсинов 20
1.2.2.4. р-Складчатые каналобразующие цитолизины аэролизинового типа: а-Гемолизин S. aureus 22
1.3. Регуляция экспрессии генов бактериальных гемолизинов 24
1.3.1. Общие принципы регуляции 24
1.3.2. Системы, контролирующие гены гемолизинов у Staphylococcus aureus 25
1.3.3. Генетические механизмы, контролирующие экспрессию гемолизинов у Listeria monocytogenes 26
1.3.4. Регуляция экспрессии гемолизинов у Clostridiumperfringens 28
1.4. Гемолизины Bacillus cereus 29
1.4.1. В. cereus как объект для изучения гемолизинов 29
1.4.2. Спектр гемолизинов, продуцируемых Bacillus cereus 31
1.4.2.1. Сфингомиелиназа и цереолизин АВ 32
1.4.2.2. Цереолизин (гемолизин I) 34
1.4.2.3. Гемолизин BL 35
1.4.2.4. Гемолизин III 37
1.4.2.5. Гемолизин IV (токсин CytK) 38
1.4.2.6. Цереолизинподобный гемолизин 39
1.4.2.7. Гемолизин II 39
1.4.3. Регуляция продукции гемолизинов у В. cereus 42
Глава II. Материалы и методы исследования 45
П. 1. Материалы 45
II. 1.1. Штаммы бактерий, фаговые и плазмидные векторы 45
II. 1.2. Среды и основные буферы 45
И. 1.3. Материалы и реактивы 46
II.2. Методы исследования 47
Н.2.1. Выделение тотальной ДНК из микроорганизмов рода Bacillus 47
Н.2.2. Выделение плазмидной ДНК 48
П.2.3. Выделение одноцепочечной ДНК фага М13 48
И.2.4. Препаративное выделение фрагмента ДНК 49
П.2.5. Получение компетентных клеток E.coli и их трансформация 49
П.2.6. Получение компетентных клеток В. subtilis и их трансформация 50
И.2.7. Отбор рекомбинантных клонов по гемолитическому фенотипу 50
И.2.8. Тестирование клонов на наличие активности фосфолипазы С 50
И.2.9. Анализ рекомбинантных клонов 51
И.2.10. Проведение реакций модификации ДНК 51
II.2.11. ПЦР-амплификация ДНК 51
Н.2.12. Плазмидные конструкции 51
Н.2.13. Определение и анализ первичной последовательности ДНК 52
11.2.14. ДНК-ДНК гибридизация 53
11.2.15. Получение миниклеток и анализ их белков, кодируемых плазмидами 53
11.2.16. Получение бесклеточных экстрактов 54 П
2.17. Тестирование гемолитической активности 55
П.2.18. Тестирование влияния холестерина 55 И.
2.19. Фракционирование клеток 56 П.2.20. Определение Р-галактозидазной активности 56 И.
2.21. Экспрессия и очистка до гомогенного состояния рекомбинантного белка N6His-HlyIIR. 56
П.2.22. Электрофорез в ПААГ 57
П.2.23. Тестирование связывания N6His-HlyIIR с ДНК 57
Н.2.24. «Фут-принтинг» 58
И.2.25. Реакция удлинения праймера 58
Глава III. Результаты и обсуждение 60
ПІЛ. Клонирование и идентификация генетической детерминанты гемолизина II 60
III. 1.1.Получение рекомбинантных гемолитических клонов и их фенотипический анализ 60
III. 1,2.Физическое и делеционное картирование рекомбинантных плазмид 60
III. 1.3. Идентификация гемолизина, кодируемого клонированным фрагментом ДНК 63
III. 1.3.1. Способы идентификации 63
III. 1.3.2. Гибридизационный анализ 64
III. 1.3.3. Идентификация с использованием функциональных и биохимических тестов 64
III. 1.3.4 Гемолизин II и цереолизинподобный гемолизин 72
Ш.2. Некоторые свойства гемолизина II, продуцируемого рекомбинантными клетками Е. coli и В. subtilis 73
Ш.2.1. Оценка молекулярной массы гемолизина II 73
Ш.2.2. Действие гемолизина II на эритроциты различных видов млекопитающих 74
Ш.2.3. Продукция гемолизина II рекомбинантными клетками Е. coli и В. subtilis: локализация, влияние температуры 76
Ш.2.4. Температурная инактивация гемолизина II 79
Ш.З. Анализ нуклеотидной последовательности гена гемолизина. cereus и выведенной аминокислотной последовательности 80
Ш.З Л. Локализация гена гемолизина II в пределах клонированного фрагмента ДНК 80
Ш.3.2. Анализ первичной структуры гена Ыу II 81
Ш.3.3. Анализ выведенной аминокислотной последовательности гемолизина II 85
Ш.3.3.1. Общий заряд белка 85
Ш.З.3.2. Анализ предполагаемого сигнального пептида 86
III.3.3.3. Гомология гемолизина II с а-токсином S. aureus и с другими белками 87
Ш.З.3.4. Участие С-концевой области гемолизина II в обеспечении его гемолитической функции 96
Ш.4. Распространение гемолизина II среди представителей Bacillus цереусной группы 97
Ш.4.1. Тестирование штаммов на присутствие последовательностей ДНК, гомологичных участку, содержащему hlyll 98
Ш.4.2. Тестирование гемолитической активности штаммов 99
III.4.3. Клонирование и идентификация генетической детерминанты гемолизина II В. thuringienssis 102
III.5. Регулятор экспрессии гена гемолизина II В. cereus 107
Ш.5.1. Анализ нуклеотидной последовательности области ДНК, прилежащей к 3'-концу гена hlyll: обнаружение hlyllR 108
Ш.5.2. Влияние гена МуІШ на гемолитическую активность, обусловленную экспрессией hlyll 109
Ш.5.3. Анализ выведенной аминокислотной последовательности HlyllR 111
Ш.5.4. Влияние hlyllR на экспрессию р*-галактозидазы, осуществляемую с промоторной области hlyll 113
Ш.5.5. Вьщеление рекомбинантного белка 6HisHlyIIR 114
Ш.5.6. Выявление операторного участка для HlyllR 115
Выводы 119
Литература
- Гемолизины как группа бактериальных токсинов
- Штаммы бактерий, фаговые и плазмидные векторы
- Клонирование и идентификация генетической детерминанты гемолизина
- Тестирование штаммов на присутствие последовательностей ДНК, гомологичных участку, содержащему hlyll
Введение к работе
Актуальность работы. Возникновение и эволюция патогенности микроорганизмов является одной из фундаментальных проблем современных микробиологии и медицины. Исследование молекулярных основ этого процесса - ключевой подход к решению данной проблемы. В настоящее время известно, что патогенные бактерии вырабатывают вещества, как непосредственно повреждающие или убивающие клетки и структуры макроорганизма, так и способствующие их проникновению в организм, преодолевая его защитные системы. Эти вещества играют главную роль в развитии заболеваний, вызываемых бактериями (McDonel et al., 1986).
Среди многообразия таких веществ немаловажная роль в патогенезе принадлежит цитолитическим токсинам. Характерными примерами, подтверждающими этот тезис, являются такие цитолизины, как фосфолипаза С Clostridium perfringens - основной фактор, ответственный за развитие газовой гангрены (Stevens et al., 1988), тиол-активируемый токсин Listeria monocytogenes, нарушение продукции которого приводит к потере вирулентности (Cossart et al., 1989), альфа-токсин Staphylococcus aureus, ответственный за целый ряд клинических эффектов при стафилококковых инфекциях (Freer, 1988; Дерябин, 2000).
Не секрет, что патогенные свойства того или иного штамма в значительной мере определяются как спектром его структурных генов, кодирующих факторы патогенности, так и механизмами, обеспечивающими регуляцию этих генов. Отсюда возрастающее внимание медиков и биологов к системам, контролирующим экспрессию генов токсинов. На сегодняшний день описаны сложные регуляторные системы для многих микроорганизмов, например, для С. perfringens (Rood and Lyristis, 1995; Bahein et al., 1996), S. aureus (Heinrichs J.H. et al., 1996; Deora et al., 1997; Chien Y. et al., 1998), L. monocytogenes (Sheehan et al., 1994; Huillet et al.,1999), Vibrio cholerae (DiRita, 1995; Pfau and Taylor, 1998) и ряда других распространенных патогенов.
Интерес к исследованиям цитолитических токсинов не ограничивается лишь медицинской сферой. Изучение этих белков стимулируется и тем, что цитолизины стали ценными инструментами при исследовании клеточной физиологии и функционирования клеточных мембран (Ahnert-Hilger and Weller, 1998; Hucho, 1995), а также являются превосходными модельньми объектами для выяснения связи между структурой и функцией белка (Bayley, 1994; Gouaux, 1998).
Таким образом, изучение цитолитических токсинов и их генетических детерминант, включающее в себя клонирование, идентификацию, молекулярный анализ, гетерологичную экспрессию генов цитолизинов, выяснение путей регуляции их экспрессии, а также изучение механизмов действия этих токсинов представляется одним из наиболее перспективных направлений в исследовании молекулярных основ патогенности и вирулентности микроорганизмов.
Важной практической задачей в рамках данной проблемы является удачный выбор объекта исследований. Учитывая тот факт, что большинство бактерий, продуцирующих цитолитические токсины, принадлежат к числу опасных патогенов, удобно использовать в подобных исследованиях микроорганизмы, вырабатывающие цитолизины, но не являющиеся строго патогенными. С этой точки зрения внимание исследователей в течение многих десятилетий привлекает антракоидная группа микроорганизмов рода Bacillus, представители которой широко распространены в природе и имеют ярко выраженные филогенетическое родство и морфологическое и физиолого-биохимическое сходство на фоне широкого диапазона их патогенных свойств. Так, В. mycoides является сапрофитным микроорганизмом, В. thuringiensis - патогенным для насекомых. В. cereus относится к условно-патогенным для теплокровных. В. anthracis печально известен как опасный патоген, вызывающий сибирскую язву. Эти микроорганизмы продуцируют ряд цитолитических белков, рассматриваемых в качестве потенциальных факторов вирулентности. В. cereus, занимая по патогенному статусу промежуточное положение среди представителей данной группы бактерий и продуцируя широкий спектр цитолизинов, может служить прекрасной моделью для изучения этих токсинов.
Еще одной причиной, которая побуждает к активному изучению токсинов, вырабатываемых В. cereus (и его ближайшим родственником В. thuringiensis), является огромная значимость этих микроорганизмов для человека. Сейчас остро встает вопрос экологически чистого производства сельскохозяйственной продукции. При этом важная роль отводится применению микробиологических средств защиты растений, среди которых серьезное место занимают энтомопатогенные бактериальные препараты. Внедрение интенсивных технологий возделывания сельскохозяйственных культур неизбежно влечет расширение применения микробиологических средств защиты растений. Для производства инсектицидных препаратов в настоящее время широко используется В. thuringiensis, приводя к широкомасштабному внесению этого микроорганизма в окружающую среду. Другой важной проблемой является бактериологическое загрязнение производимых промышленностью продуктов питания, лекарственных и косметических препаратов. При этом В. cereus - один из основных бактериальных загрязнителей. В связи с вышеизложенным встает задача определения степени безопасности таких микроорганизмов, как В. cereus и В. thuringiensis, для окружающей среды, животных и человека. В рамках данной задачи изучение отдельных токсинов, продуцируемых этими бактериями, является необходимым звеном.
Хорошо известно, что В. cereus производит ряд внеклеточных токсинов, обладающих гемолитической активностью и рассматриваемых в качестве потенциальных факторов патогенности (Turnbull, 1986; Drobniewski, 1993). На настоящий момент в разной степени описаны цереолизин, сфингомиелиназа, цереолизин АВ, гемолизин BL, цереолизин-подобный гемолизин, гемолизины II, III и CytK. Спектр и свойства гемолитических белков, продуцируемых данным микроорганизмом, изучены далеко не полно. Это обусловлено сложностью получения индивидуальных препаратов данных белков из исходного микроорганизма. В связи с этим, природа одного из них - гемолизина II - до последнего времени оставалась под вопросом. Гемолитическая активность, позднее приписанная ему, была впервые обнаружена в культуральной жидкости одного из штаммов В. cereus еще в 1963 году (Fossum, 1963). Однако до сих пор не существовало данных, свидетельствующих о том, что гемолизин II является продуктом самостоятельного гена, а не произволен от других, уже хорошо описанных гемолитических белков. Активность, приписываемая гемолизину II, считалась обусловленной совместным действием сфингомиелиназы и фосфолипазы С или же она связывалась с проявлением других известных гемолитических факторов В. cereus. Таким образом, вопрос о самом существовании гемолизина II оставался открытым. Для выяснения подобных вопросов весьма эффективным является подход, основанный на клонировании отдельных генов, кодирующих цитолизины, и изучении данных цитолизинов в гетерологичных системах.
Несмотря на то, что гемолитические токсины В. cereus активно изучаются, на сегодняшний день очень мало известно об их генетической регуляции, так же как и о регуляции других факторов патогенности этого микроорганизма. Лишь недавно был обнаружен первый плейотропный регулятор, PlcR, который является активатором генов фосфолипаз, негемолитического и гемолитического энтеротоксинов, а также - целого ряда других генов В. cereus и В. thuringiensis (Lereclus et al., 1996; Agaisse, 1999; Gohar et al., 2003). Учитывая, что вопрос о регуляции генов токсинов неразрывно связан с регуляцией патогенных свойств микроорганизмов, а также ввиду малой изученности данного вопроса для В, cereus, весьма актуальным является поиск и изучение других локусов в геноме этой бактерии, контролирующих экспрессию генов токсинов.
Цели и задачи исследования. Данная работа выполнялась в рамках исследовательского направления, имеющего целью обнаружение и идентификацию генов цитолизинов В.cereus, их структурно-функциональный анализ и изучение функции данных цитолизинов. Особый интерес представляло клонирование из генома В.cereus
гемолитических детерминант, не тождественных ранее клонированным. Целью настоящей работы являлось клонирование генетической детерминанты гемолизина II, определение ее первичной структуры, функциональной активности в гетерологичной системе и распространение среди бацилл цереусной группы, описание особенностей регуляции экспрессии гена гемолизина II.
Для достижения указанной цели последовательно ставились следующие задачи:
1. Создать библиотеку генов B.cereus и отобрать гемолитические клоны.
2. Идентифицировать генетическую детерминанту гемолизина И.
3. Определить нуклеотидную последовательность клонированной генетической детерминанты B.cereus и провести ее анализ. На основании анализа выведенной аминокислотной последовательности сделать предварительное заключение о механизме действия гемолизина II.
4. Исследовать особенности активности гемолизина II в гетерологичных системах (E.coli и B.subtilis).
5. Провести скрининг коллекции штаммов бацилл цереусной группы на наличие последовательностей ДНК, гомологичных области, содержащей ген гемолизина II, и на продукцию подобного гемолизина.
6. Определить роль нового гена hlyllR в регуляции экспрессии hlyll и характер (особенности) этой регуляции.
Данная работа выполнена в лаборатории генной систематики и ВНТК генной активности Института биохимии и физиологии микроорганизмов имени Г.К. Скрябина РАН.
Научная новизна работы. Результаты, полученные в ходе данных исследований, носят приоритетный характер. Впервые клонирован ген гемолизина II Bacillus cereus. Тем самым положен конец многолетней дискуссии о существовании этого гемолизина и доказано, что он является самостоятельным белком В. cereus, а не произволен от других гемолитических факторов этого микроорганизма. Впервые определена нуклеотидная последовательность гена гемолизина II и получены данные, позволяющие причислить этот белок к группе 3-складчатых олигомерных порообразующих цитолизинов. Впервые показано, что способность В. cereus продуцировать гемолизин II является штаммоспецифичным свойством по причине ограниченного распространения его гена среди штаммов этого вида. Впервые установлено, что многие штаммы В. thuringiensis производят гемолизин, гомологичный гемолизину II В. cereus и сходный с ним по свойствам. Впервые клонирован ген этого гемолизина В. thuringiensis. Обнаружен и клонирован новый регуляторный ген В. cereus и показана его функция как регулятора транскрипции гена гемолизина И.
Практическое значение работы. Полученные результаты вносят вклад в понимание феномена гемолитического фенотипа и молекулярных основ вирулентности В. cereus и близких видов микроорганизмов. Эти данные являются необходимым первоначальным этапом, закладывающим основу для дальнейших исследований гемолизина II: выяснения его участия в патогенезе, изучения его структурно-функциональных особенностей, что позволит в перспективе использовать этот объект при исследовании клеточной физиологии и функционирования мембран клеток. Тот факт, что гемолизин II обнаружен у В. thuringiensis, широко применяемого как биологический инсектицид, заставляет усилить внимание к тщательному анализу и отбору используемых штаммов на предмет их безопасности для человека и животных и заостряет вопрос о правомочности использования данного микроорганизма в качестве инсектицидного препарата. Обнаружение нового регуляторного локуса В. cereus, контролирующего транскрипцию гена гемолизина II, является шагом к выяснению сложных механизмов скоординированной регуляции генов, обеспечивающих вирулентность этого микроорганизма, что в перспективе позволит осуществлять контроль над его патогенными свойствами.
Гемолизины как группа бактериальных токсинов
На настоящий момент не существует единой классификации токсинов. И, хотя подробное рассмотрение этого вопроса выходит за рамки данной работы, представляется уместным указать самые общераспространенные подходы к классификации токсинов. Бактериальные белковые токсины можно разделить на два основных класса: цитотоксические и цитолитические токсины (Vine and Cuatrecasas, 1986). Цитолитические токсины взаимодействуют с плазматическими мембранами клеток-мишеней, причем токсический эффект обусловлен нарушением целостности мембраны как барьера, отделяющего внутреннее содержимое клетки от внешней среды. Эта группа токсинов подробно рассматривается ниже на примере гемолитических белков, разрушающих мембраны эритроцитов и являющихся, таким образом, представителями класса цитолизинов. Цитотоксические токсины повреждают клетки с помощью механизмов, не связанных с нарушением барьерных функций мембраны, хотя первичное взаимодействие их с клетками-мишенями может осуществляться через связывание с наружной мембраной. Проникая в клетку, они вызывают нарушения различных метаболических путей. В качестве характерных примеров этого класса токсинов можно назвать дифтерийный токсин и экзотоксин A Pseudomonas aeruginosa (Vine and Cuatrecasas, 1986).
Согласно другому подходу, токсины именуются и классифицируются по их основной роли в патогенезе, по их органоспецифичности (McDonel et al., 1986). Так, например, токсины, действующие на желудочно-кишечный тракт, называют энтеротоксинами, а поражающие нервную систему - объединяются общим термином "нейротоксины". К таким же "общим" (по терминологии Макдонела) классам, основанным на проявлении в патогенезе, относят гемолизины и другие цитолитические токсины (McDonel et al., 1986).
Более точным, по нашему мнению, является рассмотрение гемолизинов как подкласса цитолитических токсинов, поскольку многие цитолизины с неизвестным спектром клеток-мишеней именуются гемолизинами лишь постольку, поскольку их цитолитическая активность протестирована на красных кровяных клетках, являющихся удобным для исследований субстратом.
К настоящему времени получено немало данных, указывающих на участие гемолизинов целого ряда микроорганизмов в развитии инфекционных заболеваний. Однако конкретная роль гемолизинов в этом процессе изучена неполно и для разных заболеваний выяснена в разной степени. Для многих микроорганизмов показано, что продуцируемые ими гемолитические токсины играют ведущую роль в патогенезе. Примерами таких гемолизинов являются: гемолитическая фосфолипаза С и перфринголизин О Clostridium perfringens, рассматриваемые как основные факторы, ответственные за развитие газовой гангрены (Stevens et al., 1988; Awad et al., 2001); листериолизин - тиолактивируемый цитолизин Listeria monocytogenus, нарушение продукции которого приводит к потере вирулентности этого внутриклеточного патогена (Cossart et al., 1989; Portnoy et al., 1988); порообразующий цитолизин Moraxella bovis, при отсутствии которого способность данной бактерии вызывать кератоконьюнктивит резко падает (Pugh and Hughes, 1968; Clinkenbeard and Thiessen, 1991). Гемолизин E. coli, продуцируемый многими уропатогенными штаммами кишечной палочки, также является важным фактором вирулентности этого микроорганизма (Hacker et al., 1983; Knapp et al., 1986). Показано, что у штаммов Staphylococcus aureus степень патогенности строго коррелирует с наличием продукции порообразующего гемолизина альфа-токсина (Kinsman et al., 1981). Данному токсину приписывается роль основной детерминанты вирулентности S. aureus (Tomita and Kamio, 1997). Также порообразующий гемолизин IV (CytK) и гемолизин BL В. cereus рассматриваются как основные факторы, ответственные за развитие вызываемых этой бактерией тяжелых некротических энтеритов (Brillard and Lereclus, 2004) и эндофтальмитов (Beecher et al., 2000), соответственно.
Однако имеется немало примеров, когда конкретное участие того или иного гемолизина в развитии инфекции установить не удается. Так, на сегодняшний день практически отсутствует информация о роли в патогенезе гамма-гемолизина и лейкоцидинов S. aureus, бета-токсина С. perfringens, а также некоторых других гемолизинов.
Вопрос о значении бактериальных токсинов и, в частности, цитолизинов в процессе эволюции и адаптации микроорганизмов неразрывно связан с такой фундаментальной проблемой современной микробиологии и медицины, как возникновение и эволюция патогенности у микроорганизмов. Есть основания считать, что способность бактерий продуцировать токсины сформировалась ранее, чем эти бактерии стали патогенными. В пользу такого предположения говорит тот факт, что у многих микроорганизмов, патогенных для теплокровных животных, оптимальной для продукции токсинов является не температура теплокровного организма, а более низкие, приближенные к условиям окружающей среды температуры (22-25С) (Сомов и др., 1991). Возможно, что бактериальные цитолизины, наряду с другими факторами патогенности, эволюционировали из факторов, способствующих выживанию исходно сапрофитных микроорганизмов в окружающей среде. Так, показано, что цитолитические эндотоксины Bacillus thuringiensis способны помимо разрушающего воздействия на клетки и ткани макроорганизма воздействовать и на ряд одноклеточных почвенных эукариот, для которых эти бактерии служат пищей, а также проявлять бактериостатическое и бактерицидное действие (Юдина и Бурцева, 1997).
Штаммы бактерий, фаговые и плазмидные векторы
Выращивание бактерий проводили в жидких и на агаризованных средах LB и 2xYT (Sambrook et al., 1989). LB: бактотриптон - 10 г/л, бакто-дрожжевой экстракт 5 г/л, NaCl -10 г/л. 2xYT: бактотриптон - 16 г/л, бакто-дрожжевой экстракт - 10 г/л, NaCl - 5 г/л. Агаризованная среда на основе LB и 2xYT содержала 15 г/л бактоагара. Мягкий агар для работы с фагами имел состав: бактотриптон -10 г/л, NaCl - 8 г/л, бактоагар - 7 г/л. Для культивирования штаммов В. cereus, В. thuringiensis и В. mycoides использовалась 3,7% сердечно- мозговая среда (BHI) фирмы "Difco". В качестве ростовой среды при получении миниклеток применялась 2,5% среда NB ("Difco").
Для трансформации В. subtilis использовали среду Спицайзена (Anagnostopoulos and Spizizen, 1961): (NH4)2S04 -2 г/л, K2HPO4 - 14 г/л, КН2РО4 - 6 г/л, трехзамещенный цитрат натрия х 2Н20 - 1 г/л, MgS04x7H20 - 0,2 г/л, казаминокислоты - 0,2 г/л, дрожжевой экстракт 1 г/л. В качестве минимальной среды использовалась среда М9: 40 мМ Na2HP04, 20 мМ КН2Р04, 8 мМ NaCl, 20 мМ NH4C1,1 мМ СаС12,10 мМ MgS04 Для приготовления растворов и буферов использовали деионизированную воду.
Для быстрого анализа плазмидной ДНК рекомбинантных клонов использовались следующие растворы (Eckhardt, 1978). Раствор I: 20% сахарозы, 7% фикола 400, ІхТВЕ, 1 мг/мл лизоцима, 50-100 мкг/мл РНКазы. Раствор II: ІхТВЕ, 5% сахарозы, 1% ДДС-Na, бромфеноловый синий.
Буферы и растворы для выделения плазмидной ДНК (Sambrook et al., 1989): Раствор I: 50 мМ глюкозы, 25 мМ Трис-HCl рН 8,0, 10 мМ ЭДТА. Раствор II: 0,2 н NaOH, 1% ДДС-Na. Раствор III: З М ацетат калия рН 4,8. Буфер для выделения тотальной ДНК: 20 мМ Трис НС1 рН 8,0,10 мМ ЭДТА. ЮхТБЕ буфер для электрофореза ДНК: 0,89 М Трис-ОН (108 г/л), 0,89 М борная кислота (55 г/л), 2мМ ЭДТА (9,3 г/л).
Для получения клеточных экстрактов и тестирования гемолитической активности использовался буфер ФСБ: 74 мМ Na-фосфат (рН 6,8), 77 мМ NaCl.
Для гидролиза ДНК эндонуклеазами рестрикции и проведения различных реакций, катализируемых ДНК-модифицирующими ферментами, применяли буферы, рекомендуемые фирмами-поставщиками.
В работе использовали следующие материалы и реактивы: бакто-агар, бактотриптон, бакто-дрожжевой экстракт фирмы "Difco", США; акриламид, N,N-метиленбисакриламид, агароза, ДДС-Na, нитроцеллюлозные и нейлоновые мембраны "ZetaProbe" фирмы "Bio-Rad", США; этидиум бромид, холестерин, ИПТГ, X-gal, ЭДТА, хлорамфеникол, глицерин, мочевина фирмы "Serva", Германия; трис, хлористый кальций, хлористый магний, ампициллин, дитиотрейтол, АТФ, лизоцим, рибонуклеаза фирмы "Sigma", США; наборы dNTP и ddNTP фирмы "USB", США.
Задействованные в работе эндонуклеазы рестрикции и ДНК-модифицирующие ферменты произведены фирмами "Amersham", США, "Boehringer Mannheim", Германия, "Fermentas", Литва. Радиоактивное мечение фрагментов ДНК для получения гибридизационных зондов проводилось с применением набора для ник-трансляции фирмы "Amersham", США. Определение первичной последовательности ДНК выполнялось с использованием ATaq-полимеразы (версия 2.0) и набора для секвенирования фирмы "USB", США. В работе использовались также секвенирующая ДНК-полимераза фага Т7 (версия 2.0) и термостабильная ДНК-полимераза Vent фирмы "NEB", США.
Радиоактивные соединения [a- P]-dATP, [а- P]-dATP и [ SJ-метионин получены из ИВЭ (Обнинск) и РНЦ "Прикладная химия" (Санкт-Петербург). Использованная в работе NI-NTA агароза произведена фирмой «Qiagen» (США). Олигонуклеотиды синтезированы к.х.н. М.Г. Шляпниковым фосфоамидитным методом на модифицированном синтезаторе "Gene assembler" фирмы «Pharmacia» (Швеция) и очищены им же с помощью обращенно-фазовой хроматографии на миниколонках с полимерным носителем. Все остальные использованные в работе реактивы были отечественного производства марки х.ч. или о.с.ч.
Выделение тотальной ДНК проводили согласно методике Мармура (Marmur, 1961) с некоторыми модификациями, как описано ниже. ДНК выделяли из 20 мл культуры. По 0,1 мл ночной культуры бацилл засевали в пробирки с 10 мл LB и выращивали при 37С с аэрацией около 4-х часов. Культуру охлаждали во льду. Клетки собирали центрифугированием и промывали "буфером для выделения тотальной ДНК". Затем их ресуспендировали в 1 мл того же буфера, добавляли 0,5 мл раствора лизоцима (10 мг/мл) и инкубировали при 37С около 1,5 ч до приобретения вязкой консистенции. Образец разводили 7 мл буфера, добавляли 0,4 мл 5М NaCl и перемешивали. Приливали 1 мл 10% ДДС-Na и осторожно, но тщательно перемешивали. Инкубировали на столе 20-30 мин., периодически осторожно перемешивая, до полного просветления и увеличения вязкости образца. В случае необходимости пробу прогревали на водяной бане при 60С 10-15 мин. Полученный лизат экстрагировали равным объемом хлороформа, несколько раз - смесью хлороформа и насыщенного фенола и, в заключение, - хлороформом. ДНК осаждали изопропанолом, затем - этанолом. Промывали 70% этанолом и растворяли в минимальном объеме (0,3-1 мл) буфера ТЕ.
Выделение ДНК плазмид проводили методом щелочного лизиса (Sambrook et al., 1989) с небольшими модификациями.
Для аналитических целей из 5 мл ночной культуры бактерий Е. coli, несущих плазмиду, отбирали 1,5 мл, переносили в микропробирку и осаждали клетки. Осадок ресуспендировали в 100 мкл раствора I, добавляли 200 мкл раствора II, медленно перемешивали и приливали 150 мкл раствора III. Инкубировали 10 мин. во льду и центрифугировали в микроцентрифуге 5 мин. Из супернатанта ДНК осаждали двумя объемами этанола. Осадок промывали 70% этанолом и растворяли в 50 мкл буфера ТЕ. Добавляли 1 мкл РНКазы (10 мг/мл) и инкубировали 20 мин. при комнатной температуре. При необходимости проводили дополнительную очистку ДНК, экстрагируя дважды смесью фенол/хлороформ и хлороформом с последующим переосаждением этанолом и промывкой 70% этанолом. ДНК растворяли в 100 мкл буфера ТЕ. Выход плазмидной ДНК, выделенной таким образом, составлял 100-200 мкг в зависимости от вектора.
Для получения больших количеств высокоочищенной плазмидной ДНК клетки Е. coli, несущие плазмиду, выращивались при 37С около 20 ч. в 0,5 л среды LB с соответствующим антибиотиком. Клетки собирали центрифугированием, осадок обрабатывался в той же последовательности растворами I, II и III (8, 16 и 12 мл, соответственно). Из супернатанта ДНК осаждали 0,6 объемами изопропанола. Осадок растворяли в буфере ТЕ, доводя объем до 33 мл, добавляли 33 г хлористого цезия и, после его полного растворения, - 0,7 мл водного раствора бромистого этидия (10 мг/мл). Переносили данный раствор в центрифужные пробирки для ротора VTi50 и центрифугировали сутки при 45000 об/мин. После центрифугирования отбирали фракцию, содержащую суперспирализованную ДНК. Бромистый этидий удаляли 3-4 -кратной экстракцией 1/4 объема изопропанола. Добавляли 2 объема буфера ТЕ и 3 исходных объема изопропанола. После осаждения ДНК ее растворяли в ТЕ и переосаждали этанолом. Затем растворяли в 1 мл буфера ТЕ. Выход высокоочищенной плазмидной ДНК, полученной таким способом, составляет несколько мг.
Клонирование и идентификация генетической детерминанты гемолизина
Тотальная ДНК B.cereus ВКМ-В771 была гидролизована эндонуклеазой EcoRV. Полученые фрагменты лигировали с ДНК векторной плазмиды pUC19, линеаризованной по сайту Smal. Лигированная ДНК использовалась для трансформации клеток E.coli Z85. Отбор трансформантов проводился на агаризованной среде с ампициллином, содержащей эритроциты человека. Из полученных таким образом 30 000 рекомбинантных клонов были отобраны И, образующие зоны гемолиза на кровяном агаре. Один из них (названный "706") образовывал лишь едва заметную зону лизиса эритроцитов и характеризовался наличием так называемого тепло-холодового гемолиза, что свойственно сфингомиелиназе (Tomita et al., 1991), а также он обладал лецитиназной активностью. Подобный фенотип характерен для рекомбинантных клеток Е. coli, экспрессирующих гены цереолизина АВ (Гавриленко и др., 1993). Другие 10 клонов, не проявляющие ни тепло-холодового гемолиза, ни лецитиназной активности, образовывали более выраженные, чем у клона 706, зоны лизиса эритроцитов. Эти клоны обладали общей особенностью: при 20С их гемолитический фенотип проявлялся гораздо лучше, чем при 37С. Так, в результате выращивания таких клеток при 37С и последующей инкубации в течение нескольких часов при комнатной температуре происходило увеличение зон лизиса эритроцитов более чем в два раза. Таким образом, были получены два типа гемолитических клонов: клон 706, проявляющий лецитиназную активность и тепло-холодовой гемолиз (что, очевидно, указывает на то, что эти клетки содержат рекомбинантную плазмиду с генами цереолизина АВ, т.е. сфингомиелиназы и лецитиназы), и клоны, не обладающие вышеуказанными свойствами и гораздо лучше проявляющие свой гемолитический фенотип при 20 С, чем при 37С.
Для дальнейшей работы из всех отобранных гемолитических клонов были выделены плазмидные ДНК. В результате их рестрикционного анализа выяснено, что плазмида р706 содержит вставку ДНК размером около 9,5 т.п.н., остальные же 10 рекомбинантных плазмид содержат одинаковые вставочные фрагменты, отличаясь лишь ориентацией этой вставки, размер которой составляет 7,2 т.п.н.. На рис. 2А представлены физическая карта
В результате проведенного делеционного картирования было обнаружено, что делетирование вставочного фрагмента плазмиды р701 до EcoRI-фрагмента размером -2.9 т.п.н. (Рис. 2) не приводит к утрате или изменению гемолитического фенотипа рекомбинантных клеток E.coli, обусловленного исходным клонированным фрагментом ДНК. Субклонированием этого соШ-фрагмента в плазми ду pUC19 были получены рекомбинантные плазмиды pUJl и рШ2 (с противоположными ориентациями вставочного фрагмента), каждая из которых обеспечивает клеткам E.coli гемолитический фенотип, сходный с фенотипом, обеспечиваемым плазмидой р701
С целью проверки идентичности клонированных coRI- и coRV-фрагментов ДНК хромосомным фрагментам В.cereus ВКМ-В771 соотвествующие гидролизаты ДНК данного штамма и плазмид рШ1 и р701 фракционировали в агарозном геле и гибридизовали с Р-меченным вставочным фрагментом плазмиды pUJl (Рис. ЗА и Б). Как следует из представленных результатов данного гибридизационного анализа, вставочные фрагменты плазмид рШ1 и р701 действительно являются ЕсоШ. (2.9 т.п.н.)- и EcoRV (7.2 т.п.н.)-фрагментами хромосомной ДНК B.cereus ВКМ-В771 соответственно.
Итак, отобрав 11 гемолитических рекомбинантных клонов, на основе анализа их фенотипов и сравнения физических карт содержащихся в них плазмид мы сделали предположение, что в составе плазмиды р706 проклонированы гены цереолизина АВ. Данный вывод получил подтверждение тем фактом, что ДНК только этой плазмиды гибридизовалась с фрагментом гена сфингомиелиназы. Генетическая детерминанта гемолизина, клонированная в остальных отобранных плазмидах, требовала идентификации.
Для идентификации клонированного гемолизина использовались как молекулярно-биологический, так и биохимический подходы. Поскольку в нашей лаборатории на данный момент проклонированы гены некоторых гемолитических токсинов В. cereus (цереолизина АВ и гемолизина III) (Гавриленко и др., 1993; Baida and Kuzmin, 1995), представлялось целесообразным применить их в качестве ДНК-зондов для гибридизации, чтобы исключить возможность того, что исследуемые нами клоны содержат один из этих генов. Что касается остальных гемолизинов, описанных для В. cereus, -цереолизина, гемолизина II, цереолизинподобного гемолизина и гемолизина BL- то только гены, кодирующие последний, клонированы на сегодняшний день (Heinrichs et al., 1993; Ryan et al., 1997). Другие перечисленные гемолитические факторы описаны в различной степени. Наиболее хорошо изученным на сегодня является цереолизин. А о независимом существовании гемолизина II и цереолизинподобного гемолизина до сих пор достоверно неизвестно. Имеются лишь сообщения, указывающие на способность В. cereus продуцировать гемолитические факторы, отличающиеся по определенному ряду свойств от тех, чье существование уже не подвергается сомнению (Honda et al., 1991; Turnbull, 1986; Coolbaugh and Williams, 1978). Поэтому, чтобы идентифицировать клонированный нами гемолизин по отношению к тем, чьими генами мы не располагаем, были использованы биохимические и функциональные (гемолитические) тесты, характеризующие тот или иной из описанных гемолизинов.
В качестве первого шага для идентификации клонированного гемолизина был предпринят гибридизационный анализ отобранных рекомбинантных плазмид, где как зонды использовались фрагмент ДНК B.cereus ВКМ-В164, содержащий генетическую детерминанту цереолизина АВ (Гавриленко и др., 1993), а также ЕсоШ- фрагмент из плазмиды рШ1. Результаты гибридизационного анализа представлены на Рис. 4. Как видно из Рис. 4В, клонированный fcoRV-фрагмент плазмиды р701 (как и соШ-фрагмент из рШ1) не гибридизуется с фрагментом ДНК, содержащим гены лецитиназы и сфингомиелиназы В. cereus, т.е. цереолизина АВ. Из Рис. 4 также следует, что гены цереолизина АВ B.cereus ВКМ-В771 находятся uaEcoRV- и fcoRI-фрагментах рестрикции геномной ДНК, отличных от соответствующих клонированных фрагментов (ср. дорожки 1 на Рис. ЗБ и В, также см. Рис. ЗГ). Таким образом, полученные результаты свидетельствуют, что клонированный нами фрагмент ДНК B.cereus ВКМ-В771 содержит генетическую детерминанту гемолитического фактора, отличного от цереолизина АВ.
Данный фрагмент ДНК не обнаруживает гомологии и с геном другого гемолизина B.cereus, клонированным в нашей лаборатории,- гемолизина III, как было показано в экспериментах по гибридизаии, представленных Байда (Baida and Kuzmin, 1995).
.
Тестирование штаммов на присутствие последовательностей ДНК, гомологичных участку, содержащему hlyll
Тотальные ДНК исследуемых штаммов были обработаны эндонуклеазой EcoRW, и полученные фрагменты ДНК разделяли с помощью электрофореза в агарозном геле. ДНК переносили на нитроцеллюлозные фильтры и гибридизовали с Р-меченым fcoRI-фрагментом ДНК В. cereus ВКМ-В771, включающим в себя ген гемолизина П. На Рис. 16 представлен радиоавтограф нитроцеллюлозного фильтра, содержащего ДНК-ДНК гибриды гидролизатов бактериальных ДНК с используемым зондом.
Как видно из рисунка, лишь четыре из тринадцати проверенных штаммов В. cereus содержат фрагменты ДНК, демонстрирующие гомологию с указанным зондом. Сходные результаты были получены при скрининге другой коллекции штаммов В. cereus (Fagerlund et al., 2004), где использование праймеров для PCR- амплификации гена hlyll позволило выявить продукт амплификации лишь в 6 из 29 штаммов В. cereus.
В то же время из четырнадцати тестированных нами штаммов В. thuringiensis гомологию с EcoRI-фрагментом, содержащим ген гемолизина И, проявляют тринадцать штаммов (т. е. подавляющее большинство).
Использованные в работе ДНК двух штаммов В. anthracis (СТИ и вакцины Ценковского) дали при тестировании положительный ответ. Опубликованные данные о первичной структуре генома одного из сибиреязвенных штаммов - А2012 (Read et al., 2002) подтвердили наличие в нем нуклеотидной последовательности, соответствующей гену hlyll B.cereus ВКМ-В771. Однако, у B.anthracis выявлены в этом гене две точечные мутации, приводящие к сдвигу рамки считывания, которые, по всей вероятности, делают ген нефункциональным.
Для того, чтобы определить, какие из исследуемых штаммов В. cereus и В. thuringiensis продуцируют гемолизин II, необходимым условием является "отделение" при тестировании его активности от активностей других мажорных гемолизинов, секретируемых данными микроорганизмами. В первую очередь к таким гемолизинам относятся холестеринзависимые цереолизин и туринголизин, которые вносят вклад в суммарную гемолитическую активность продуцирующих их штаммов, сравнимый с вкладом гемолизина II (Bernheimer and Grushoff, 1967а). В связи с этим мы исследовали влияние холестерина на активность внеклеточных гемолизинов, продуцируемых использованными в работе микроорганизмами. Для этого штаммы выращивали в оптимальных для продукции гемолизинов условиях, подобранных предварительно: в сердечно-мозговом бульоне (3,7%) при 28С с интенсивной аэрацией. Через определенные интервалы времени производился отбор культуры и в супернатантах культуральных жидкостей определялась гемолитическая активность - до и после их инкубации с холестерином (0.2 мг/мл) при 20С в течение 30 мин. Эти активности далее фигурируют под названиями "общая" и "остаточная гемолитическая активность" соответственно. Таким образом, для каждого из двадцати семи исследованных штаммов были получены кинетики общей и остаточной гемолитической активности. По характеру влияния холестерина на активность продуцируемых гемолизинов было выявлено два типа штаммов. Микроорганизмы первого типа продуцировали гемолизин(ы), активность которых полностью ингибировалась холестерином (Рис. 17А и В). Поскольку ингибирование холестерином является ключевым свойством SH-токсинов, можно сделать вывод, что микроорганизмы этой группы являются продуцентами SH-токсина - цереолизина или туринголизина. Микроорганизмы второго типа способны помимо этих гемолизинов продуцировать гемолизин(ы), активность которого(ых) не ингибировалась холестерином. Так, после инкубации с холестерином в супернатантах культуральных жидкостей этих штаммов наблюдалась меньшая, чем общая, но достаточно высокая остаточная гемолитическая активность (Рис. 17Б и Г). Это обстоятельство, очевидно, свидетельствует о продукции этими микроорганизмами гемолизина II, характерной особенностью которого, в отличие от SH-токсинов, является нечувствительность к холестерину.
Таким образом, полученные данные о влиянии холестерина на внеклеточные гемолизины тестируемых штаммов позволяют разделить эти штаммы на две группы в отношении продукции гемолизина II: микроорганизмы первой группы, продуцирующие в качестве "мажорного" гемолитического фактора только SH-токсин; и микроорганизмы второй группы, способные, кроме того, продуцировать гемолизин II (сравните. Рис. 17А, В с Б, Г). Среди микроорганизмов, вырабатьюающих этот гемолизин, лишь четыре принадлежали к виду В. cereus и тринадцать - к В. thuringiensis. Ими оказались те же самые штаммы, которые давали положительный ответ в экспериментах по гибридизации с ДНК-зондом, содержащим ген гемолизина П. Таким образом, сопоставление результатов гибридизационных экспериментов с данными по продукции внеклеточных гемолизинов обнаруживает полную корреляцию между способностью микроорганизма продуцировать гемолизин II и наличием в его геноме фрагмента ДНК, гомологичного фрагменту, содержащему структурный ген гемолизина II В. cereus ВКМ-В771 и его регуляторный ген. Данная корреляция дает основания сделать ряд выводов. Во-первых, области ДНК в геномах тестированных штаммов, демонстрирующие гомологию с использованным гибридизационным зондом, содержат функциональный ген, который кодирует активный гемолизин П. Во-вторых, использованный в данной работе метод идентификации гемолизина II в культуральных жидкостях В. cereus и В. thuringiensis является правомерным.
Итак, из представленных данных следует, что гемолизин II имеет ограниченное распространение среди представителей В. cereus, являясь для этого вида штаммоспецифичным признаком (I), и что этот гемолизин широко распространен среди различных штаммов В. thuringiensis (II).
![Влияние аллелей полиморфных генов системы HLA II класса, фолатного обмена, гемостаза и детоксикации на репродукцию человека [Электронный ресурс]](/i/i/4357/184412.png "Влияние аллелей полиморфных генов системы HLA II класса, фолатного обмена, гемостаза и детоксикации на репродукцию человека [Электронный ресурс] Бескоровайная Татьяна Сергеевна")
