Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Роль эпигенетики в изучении патогенеза рака молочной железы и разработке молекулярных маркеров канцерогенеза 11
1.1.1. Краткая характеристика рака молочной железы 11
1.1.2. Значение метилирования ДНК в норме и при патологии 13
1.1.3. Особенности метилирования CpG-островков генов, вовлеченных в канцерогенез 15
1.1.4. Значение нарушений метилирования ДНК при РМЖ как молекулярньк маркеров канцерогенеза 17
1.1.4.1. Аномальное метилирование генов, вовлеченных в канцерогенез, при РМЖ 18
1.1.4.2. Преимущества метилирования ДНК как молекулярного маркера канцерогенеза 28
1.1.4.3. Аномальное метилирование ДНК в биологических жидкостях при РМЖ 29
1.2. Методы анализа метилирования ДНК 31
1.2.1. Методы исследования полногеномного метилирования 31
1.2.2. Ген-специфический анализ метилирования 33
1.2.2.1. Основные принципы ген-специфического анализа метилирования...33
1.2.2.2. Выбор метода ген-специфического анализа метилирования 36
1.2.3. Методы поиска дифференциально метилированных CpG-островков 38
1.2.3.1 .Метилчувствительное рестрикционно-ориентированное геномное сканирование 39
1.2.3.2. Метилчувствительный репрезентативно-дифференциальный анализ (МЧ-РДА) 41
1.2.3.3. Вычитательная гибридизация хромотографически изолированных пулов CpG-островков 43
1.2.3.4. Метилчувствительный фингерпринтинг (МЧФП) 44
1.2.3.5. Амплификация интерметилированных CpG-островков 46
1.2.3.6. Идентификация дифференциально метилированных CpG-островков
с использованием микрочиповых технологий 48
Глава 2. Материалы и методы 53
2.1. Клинический материал 53
2.2. Забор крови и операционного материала 53
2.3. Выделение геномной ДНК 53
2.4. Выделение РНК 54
2.5. Модификация метода МЧФП 55
2.5.1. Обработка ДНК эндонуклеазами рестрикции 55
2.5.2. Метил-чувствительная полимеразная цепная реакция (МЧ-ПЦР) с использованием CG-богатых праймеров 55
2.5.3. Электрофорез в ПААГ 57
2.5.4. Ультратонкое окрашивание нитратом серебра 57
2.5.5. Амплификация фрагментов CpG-островков и определение нуклеотидной последовательности 57
2.6. Рестрикционный анализ 58
2. 7. Метил-чувствительная ПЦР со специфическими праймерами 58
2. 8. Обработка ДНК бисульфитом натрия 59
2. 9. Метил-специфический сиквенс 61
2.10. Синтез кДНК 61
2.11. ОТ-ПЦР в реальном времени 62
2.12. Микросателлитный анализ 63
2. 13. Программное обеспечение 63
Глава 3. Результаты и обсуждение 64
3.1. Оптимизация метода поиска аномально метилированных CpG-островков 64
3.2. Идентификация дифференциально метилированных CpG-островков в образцах ДНК больных РМЖ 66
3.3. Характеристика метилирования исследуемых генов в нормальных тканях человека 67
3.4. Анализ метилирования и экспрессии исследуемых генов в образцах опухолей РМЖ 68
3.4.1. Анализ метилирования и экспрессии гена BIN1 68
3.4.2. Анализ метилирования и экспрессии гена LAMC3 75
3.4.3. Анализ метилирования и экспрессии гена SEMA6B 80
3.4.4. Анализ генов, кодирующих субъединицы ионных каналов 84
3.4.5. Анализ метилирования и экспрессии гена VCIP135 87
3.4.6. Анализ метилирования и экспрессии гена PSMTF1 88
3.5. Оценка эффективности модификации метода МЧФП и информативности выявленных эпигенетических маркеров канцерогенеза 89
Заключение 93
Выводы 95
Список литературы 96
- Роль эпигенетики в изучении патогенеза рака молочной железы и разработке молекулярных маркеров канцерогенеза
- Преимущества метилирования ДНК как молекулярного маркера канцерогенеза
- Метил-чувствительная полимеразная цепная реакция (МЧ-ПЦР) с использованием CG-богатых праймеров
- Идентификация дифференциально метилированных CpG-островков в образцах ДНК больных РМЖ
Введение к работе
Основными задачами онкогеномики являются изучение молекулярных механизмов канцерогенеза и разработка оптимальных методов предупреждения, диагностики и мониторинга онкологических заболеваний. В связи с этим особое значение приобретает проблема идентификации генов, вовлеченных в канцерогенез, и их подробная характеристика. Один из подходов к решению этой задачи основьюается на анализе эпигенетических особенностей генома опухолей. Эпигенетическая регуляция экспрессии генов подразумевает изменения генома, отличные от структурных вариаций кодирующих областей генов. К эпигенетическим явлениям относятся, в частности, метилирование-деметилирование ДНК и гистонов, ацетилирование-деацетилирование гистонов, полиморфизмы повторяющихся последовательностей в регуляторных областях генов.
В настоящее время разработан ряд методов, позволяющих выявлять аномально метилированные локусы в геноме опухолевой клетки. Идентифицированные с помощью подобных методов гены в дальнейшем характеризуются с точки зрения их молекулярной патологии при канцерогенезе, в частности, оценивается их экспрессия, структурные нарушения и метилирование в норме и патологии. Особое внимание целесообразно уделять подробной характеристике особенностей метилирования изучаемых генов. Это обусловлено тем, что анализ маркеров метилирования на сегодняшний день является оптимальным инструментом молекулярно-генетической диагностики и мониторинга в онкологии. По специфичности он не уступает анализу экспрессии генов, значительно превосходя последний по простоте и доступности. Что же касается анализа структурных аномалий, он остается достаточно дорогостоящей процедурой и находит применение, в основном, в диагностике наследственных онкологических синдромов.
Анализ аномалий метилирования должен опираться на фундаментальную научную основу. В частности, необходимо значительно расширить генный состав применяемых диагностических панелей. Список хорошо изученных диагностических и прогностических маркеров метилирования не превышает на сегодняшний день двух десятков, причем многие из них не являются специфичными. Все применяемые маркеры должны быть четко охарактеризованы с точки зрения тканеспецифичности опухолей, информативности, особенностей метилирования CpG-островков в норме и при патологии.
Коротко актуальность проблемы можно выразить следующим образом:
Злокачественные новообразования относятся к одним из наиболее социально значимых болезней. Использование в клинической практике высокоинформативных предиктивных, диагностических и прогностических молекулярных маркеров канцерогенеза должно способствовать формированию групп риска, раннему выявлению заболеваний, повышению эффективности дифференциальной диагностики, определению тактики лечения и контролю за его эффективностью.
Существующие панели молекулярно-генетических маркеров канцерогенеза не обеспечивают необходимого уровня эффективности диагностики, что объясняется, в первую очередь, недостатком всесторонне изученных маркеров.
На сегодняшний день одним из оптимальных инструментов молекулярно-генетической диагностики и мониторинга в онкологии является анализ маркеров метилирования. Тем не менее, выбор таких маркеров часто проводится на случайной основе без учёта эпигенетических характеристик конкретных геномных локусов. Совершенствование молекулярно-генетической диагностики онкозаболеваний невозможно без идентификации новых генов, вовлечённых в канцерогенез, и подробной характеристики особенностей эпигенетической регуляции их функционирования в норме и при патологии.
Целью настоящей работы является идентификация и характеристика новых маркеров метилирования и экспрессии генов, вовлеченных в канцерогенез, при раке молочной железы.
Задачи исследования
Оптимизация методологии скрининга дифференциального метилированния геномов нормальных и опухолевых клеток.
Идентификация локусов генома человека, аномально метилированных в образцах РМЖ и определение их принадлежности к конкретным генам.
Оценка частот метилирования CpG-островков выявленных генов в норме и при РМЖ.
Высокоразрешающее картирование метилирования CpG-островков изучаемых генов.
Изучение особенностей экспрессии исследуемых генов при РМЖ.
Оценка информативности выявленных эпигенетических маркеров канцерогенеза.
Научная новизна.
В результате проведенного исследования разработана эффективная и экономичная модификация метода поиска дифференциально метилированных CpG-островков в геноме опухолевых клеток. На основании применения этой методики выявлено семь областей генома человека, дифференциально метилированных в ДНК из образцов тканей РМЖ и принадлежащих CpG-островкам генов LAMC3, SEMA6B, VCIP135, BIN1, KCNH2, CACNG4 и PSMF1. Для указанных генов впервые проведен анализ метилирования их промоторных областей при РМЖ, а также в нормальных тканях молочной железы и лимфоцитах периферической крови здоровых доноров. Построены высокоразрешающие карты метилирования CpG-островков генов LAMC3, SEMA6B и BIN1. Проведен количественный анализ экспрессии указанных генов в операционном материале РМЖ и клеточных линиях РМЖ. Подробное исследование метилирования и экспрессии генов, вьивленных в ходе работы, в злокачественных опухолях проведено впервые, и полученные результаты свидетельствуют о значительной роли эпигенетических факторов в регуляции функции этих генов при канцерогенезе.
Практическая значимость.
Разработанная система скрининга дифференциального метилирования геномов высоко воспроизводима, подробно охарактеризована и может быть использована в дальнейшем в работах по характеристике эпигенетических нарушений, ассоциированных с социально значимыми заболеваниями. В настоящем исследовании скрининг дифференциального метилирования CpG-островков в 40 парных (опухоль и норма) образцах ДНК больных РМЖ позволил выявить семь генов, экспрессия которых подвержена аномальной эпигенетической регуляции при канцерогенезе: LAMC3, SEMA6B, VCIP135, BIN1, KCNH2, CACNG4 и PSMF1. Разработаны методики мультилокусной метилчувствительной ПЦР для CpG-островков каждого из изучаемых генов, предназначенные для оценки статуса их метилирования в материале опухоли. В выборке из 98 образцов РМЖ проведена оценка частот аномального метилирования генов LAMC3, SEMA6B, VCIP135, BIN1, KCNH2, CACNG4 и PSMF1. Анализ экспрессии перечисленных генов в 16 парных образцах ДНК больных РМЖ позволил провести предварительную оценку информативности снижения экспрессии каждого из генов как маркера канцерогенеза. Созданные карты метилирования соответствующих CpG-островков генов LAMC3, SEMA6B и BIN1 и результаты проведённого экспрессионного анализа изучаемых генов представляют собой базу для разработки научно обоснованных систем эпигенетических маркеров канцерогенеза.
Апробация работы.
Материалы исследования докладывались на ежегодных конференциях Европейского общества генетики человека в 2005-2006 гг., на конференции Российского общества медицинских генетиков в 2005 г. (г. Уфа), на конференции «Биомедицина и биобезопасность» в 2005 г. (г. Москва), конференции по функциональной геномике Европейского Научного Фонда в 2005 г. (г. Осло). По результатам работы опубликовано 3 статьи и 5 тезисов. Решением Научного комитета Европейской конференции генетики человека (Амстердам, 2006) исследование признано лучшей научной работой коллектива молодых ученых.
Положения, выносимые на защиту.
Разработанная модификация метилчувствительного фингерпринтинга является эффективной системой скрининга дифференциального метилирования геномов.
Промоторные области генов LAMC3, SEMA6B, VCIP135, BIN1, KCNH2, CACNG4 и PSMF1 подвергаются аномальному метилированию при РМЖ.
Разработаны карты метилирования CpG-динуклеотидов промоторных районов генов LAMC3, SEMA6BnBlNl.
Экспрессия генов LAMC3, SEMA6B, VCIP135, BIN1, KCNH2, CACNG4 и PSMF1 нарушается при РМЖ, с преобладанием ее снижения для большинства изученных генов.
Роль эпигенетики в изучении патогенеза рака молочной железы и разработке молекулярных маркеров канцерогенеза
Рак молочной железы (РМЖ) занимает первое место в структуре заболеваемости и смертности от злокачественных новообразований среди женщин. Социальное значение этой формы рака настолько велико, что исследования проблемы РМЖ занимают одно из ведущих мест в современной онкологической науке.
Для большинства новообразований молочной железы источником клеток служат терминальные дольково-протоковые элементы, которые включают железистые компоненты нормальной паренхимы. Злокачественная трансформация клеток стромы, сосудов, а также жировых клеток наблюдается крайне редко. На основании морфологической классификации ВОЗ выделяют неинвазивные формы РМЖ (внутрипротоковый рак, внутрипротоковая карцинома с болезнью Педжета, лобулярная карцинома in situ) и инвазивные формы (инвазивный протоковый рак, инвазивная протоковая карцинома с болезнью Педжета, инвазивный дольковый рак, медуллярный рак, коллоидная карцинома, тубулярный рак) (Пальцев, 2001).
Согласно системе TNM (UICC, версия 1989 г.) приняты следующие обозначения стадий распространения инвазивного рака молочной железы: TjS- карцинома in situ во всех морфологических вариантах; Ті - опухоль не превышает 2 см в наибольшем поперечнике и фиксирована или не фиксирована к грудной фасции и (или) мышце; Тг - раковый узел диаметром 2-5 см с фиксацией к грудной фасции и (или) мышце или без таковой; Тз - фиксированная или не фиксированная к грудной фасции и (или) мышце опухоль превышает 5 см в наибольшем поперечнике; Т4 - новообразование любого размера, прорастающее стенку грудной клетки и кожу. Лимфогенные метостазы маркируют следующим образом: Ni - на стороне ракового поражения имеются увеличенные и смещаемые при пальпации подмышечные узлы; N2 - на стороне поражения выявляются увеличенные подмышечные лимфоузлы, спаянные друг с другом или с окружающими тканями; N3 - на стороне поражения обнаруживаются увеличенные над- и подключичные лимфатические узлы.
В отношении дистантных гематогенных метастазов принято только одно обозначение Mi, свидетельствующее об их наличии.
К факторам риска развития РМЖ относятся наличие больных РМЖ в семье; увеличение репродуктивного периода жизни (раннее начало менструации и поздняя менопауза); поздние первые роды; ожирение, сопровождающееся синтезом эстрогенов в жировых депо; лечение эстрогенами и длительное использование оральных контрацептивов; наличие фиброзно-кистозных изменений в молочной железе с атипичной гиперплазией эпителия; воздействие канцерогенных факторов (радиация, химические канцерогены и т.п.).
Выделяют наследственные и спорадические формы РМЖ. Приблизительно у 10% пациенток, страдающих РМЖ, отмечается наследственная предрасположенность. На сегодняшний день известно, что наследственные формы РМЖ напрямую зависят от мутаций в генах, отвечающих за репарацию ДНК (BRCA1, BRCA2). Риск развития РМЖ у пациенток с терминальными мутациями BRCA1 составляет 85-90%», при этом болезнь развивается в молодом возрасте и характеризуется высокой степенью злокачественности.
Спорадический рак возникает при накоплении целого ряда соматических мутаций в различных генах. Комплекс молекулярно-генетических изменений, которые характерны для спорадического РМЖ, включает в себя активацию некоторых семейств протоонкогенов, структурную и функциональную инактивацию генов-супрессоров, характерные делеции некоторых хромосомных районов, ассоциированных с РМЖ.
Несмотря на большое количество исследованных генов, полиморфизмов ДНК и структурных перестроек, на сегодняшний день не существует достаточного количества молекулярно-генетических маркеров, которые строго ассоциированы с РМЖ, особенно со спорадическими случаями. Успехи в исследовании молекулярных механизмов опухолеобразования отстают от скорости распространения онкологических заболеваний, поэтому продолжаются поиски маркеров ранней диагностики и метастазирования, маркеров, определяющих течение заболевания и предрасположенность для различных опухолей, в том числе и дляРМЖ.
Метилирование цитозина в 5 -положении пиримидинового кольца -доминирующая эпигенетическая модификация ДНК в геноме человека. Термин «эпигенетическая» подразумевает, что метилирование изменяет информацию, содержащуюся в ДНК, не меняя первичной нуклеотидной последовательности. Не нарушая структуры генов и функций кодируемых ими продуктов, метилирование ДНК предоставляет информацию о том, где, когда и какие гены должны экспрессироваться (Bird et al. 2002). Присоединение метальной группы к молекуле цитозина катализируется ферментами семейства ДНК-метилтрансфераз и происходит только на пострепликативной стадии, поскольку молекулы 5-метилцитозина в свободном виде в клетке отсутствуют (Bestor et al., 2000). При этом за редкими исключениями, метилированию подвергаются только молекулы цитозина, предшествующие в цепи ДНК гуанину, т.е. входящие в состав CpG-динуклеотидов. Более того, в то время как большинство рассеянных CpG-nap в нормальном геноме метилировано, CpG-обогащенные участки, часто располагающиеся в 5 -областях генов, обычно не содержат метилированных молекул цитозина. Метилирование таких областей (CpG-островков) коррелирует со снижением транскрипционной активности генов (Cross et al., 1995).
В геноме человека механизмы подавления экспрессии генов, основанные на метилировании ДНК, лежат в основе инактивации Х-хромосомы у женщин, инактивации молчащих аллелей в импринтированных локусах, а также вовлечены в подавление внутригеномных мобильных элементов ДНК (Costello et al., 2001). Установление и поддержание определенных паттернов метилирования необходимо для нормального эмбрионального развития (Jacob et al, 2005).
Преимущества метилирования ДНК как молекулярного маркера канцерогенеза
Анализ метилирования ДНК имеет ряд преимуществ перед детекцией мутаций при выявлении клеток рака в образцах тканей или свободной ДНК из опухолевых клеток в биологических жидкостях. Во-первых, частоты аномального метилирования CpG-островков множества генов значительно превышают частоты структурных повреждений тех же генов при канцерогенезе (Kaneda et al., 2002; Miyamoto et al., 2003). Во-вторых, выявление аномально метилированных молекул ДНК в избытке нормального биологического материала не вызывает значительных проблем, детекция же мутаций/делеций в этой ситуации практически невозможна. В-третьих, анализ метилирования ДНК технически прост и в большинстве случаев сводится к ПЦР с одной парой праймеров. Поиск мутаций в одном гене требует использования от нескольких до нескольких десятков пар праймеров, кроме того, максимальная эффективность достигается только после секвенирования фрагментов
ПЦР. Наконец, аномальное метилирование наблюдается в пренеопластических тканях и может служить одним из наиболее ранних маркеров канцерогенеза.
Преимущества аномального метилирования как молекулярного маркера способствовали поиску специфических эпигенетических изменений при РМЖ не только в тканях опухолей, но и в плазме крови и в протоковом аспирате, с целью разработки малоинвазивных диагностических тестов.
Присутствие свободной ДНК из клеток злокачественных опухолей в плазме крови было доказано более 20 лет назад (Shapiretal., 1983). Считается, что ДНК освобождается из опухолевых клеток в результате апоптоза и некроза (Jahr et al., 2001). Несмотря на то, что количество свободной ДНК в плазме онкологических больных повышено, лабораторные исследования с её использованием возможны только при наличии четких маркеров повреждения ДНК, характерных для канцерогенеза. Единственным из таких маркеров, технически доступным для определения в плазме крови, на сегодняшний день является аномальное метилирование ДНК. Однако, поскольку исследования в этой области начались лишь в конце 1990-х годов, список генов, аномальное метилирование которых выявлено в плазме крови при РМЖ, невелик (табл.2).
Количество генов, аномальное метилирование которых показано в клетках протокового лаважа и тонкоигольной биопсии несколько больше (табл.2). Вероятно, это связано с возможностями дополнительного подтверждения результатов исследований другими, цитологическими, методами.
Поиск и характеристика новых эпигенетических маркеров канцерогенеза невозможны без применения современных методов анализа метилирования ДНК. Прогрессивный рост числа таких методов свидетельствует о том, что ни один из них не является универсальным, и только использование их комбинаций, в зависимости от цели исследования, может привести к желаемому результату.
Ключевая роль метилирования ДНК в поддержании нормального функционирования клетки и понимание, что нарушения метилирования ДНК оказывают значительное влияние на здоровье человека, обусловливают необходимость разработки методов выявления и оценки метилирования ДНК, полученной из различных источников. Ниже представлены различные методы анализа метилирования ДНК и описаны основные принципы современных технологий.
Каждый метод характеризуется определенными особенностями, что позволяет подобрать технологию, оптимальную для решения конкретной задачи в изучении метилирования ДНК. Все методы можно разделить на группы на основании характера получаемой информации: первая группа включает методы анализа полногеномного метилирования, вторая - методы исследования статуса метилирования специфических последовательностей, третья позволяет идентифицировать новые «горячие точки метилирования», т.е. области ДНК, аномально метилированные в патологически измененной ткани (рис.4).
Анализ полногеномного метилирования подразумевает определение относительного содержания общего цитозина и метилцитозина в составе геномной ДНК. В основе современных методов лежат: полный ферментативный гидролиз ДНК с последующим высокоразрешающим разделением продуктов для определения содержания нуклеотидов; химическая (обработка бисульфитом натрия и хлорацетальдегидом) или биохимическая (использование ДНК-метилтрансфераз) модификации цитозина и 5-метилцитозина; либо использование специфических антител к 5-метилцитозину. Поскольку в настоящей работе методы этой группы не использовались, их подробное описание здесь не приводится.
В то время как изучение глобального метилирования ДНК может быть проведено на нативных препаратах ДНК, современные методы анализа ген-специфических паттернов метилирования требуют осуществления первоначальной амплификации исследуемой последовательности. Поскольку ДНК-полимераза в ходе синтеза ДНК не различает цитозин и 5-метилцитозин, в процессе полимеразной цепной реакции и клонирования информация о метилировании утрачивается. Ряд ферментов и химических соединений, таких как, метилчувствительные рестриктазы, бисульфит (HSCh"), гидразин (N2H4), перманганат (MnCV), могут быть использованы для модификации оснований, что позволяет различить цитозин и 5-метилцитозин в ходе последующего анализа. Все методы ген-специфического анализа метилирования, описанные ниже, основаны на применении либо метилчувствительных рестрикраз, либо бисульфита. Методы, основанные на обработке гидразином и перманганатом используются достаточно редко в силу низкой специфичности и разрешающей способности.
Методы, основанные на применении метилчувствительныхрестриктаз.
Изошизомеры бактериальных эндонуклеаз, обладающие различной чувствительностью к 5-метилцитозину, широко используются для определения статуса метилирования цитозина в специфических сайтах. Как правило, один из ферментов, входящих в пару изошизомеров, нечувствителен к присутствию 5-метилцитозина, в то время как другой не расщепляет ДНК по сайту рестрикции, содержащему 5-метилцитозин (рис.5А). Часто используемой при анализе метилирования парой ферментов являются НраП и Mspl, распознающие сайт CCGG, при этом НраП не узнаёт последовательность, содержащую метилированный цитозин.
Метил-чувствительная полимеразная цепная реакция (МЧ-ПЦР) с использованием CG-богатых праймеров
Для формирования пула GC-богатых фрагментов образцы ДНК подвергались поэтапному гидролизу. На первом этапе ДНК гидролизовали частощепящей рестриктазой Rsal, сайт узнавания которой не содержит CG-динуклеотидов, с целью уменьшения размера фрагментов для дальнейшей амплификации и обогащения образцов фракцией интактных CpG-островков. Аликвоты полученных рестриктов подвергали параллельному гидролизу чувствительным и нечувствительным к метилированию изошизомерами НраП и Mspl, имеющими сайт узнавания CCGG.
В рестрикционную смесь с общим объёмом 20 мкл добавляли 2-Ю мкг нативной ДНК, 2 мкл соответствующего 10х буфера и 20 единиц рестриктазы Rsal или по 20 единиц каждой рестриктазы Rsal и Mspl, или по 20 единиц каждого фермента Rsal и НраП. Смесь инкубировали 16 часов при температуре 37С.
Полимеразная цепная реакция с вырожденными С,С-богатыми праймерами проводилась для каждой из групп рестриктов Rsal, Rsal+Mspl, RsaI+НраП при мягких условиях (низкая температура отжига). Амплификация проб, подвергнутых обработке Rsal и нечувствительным к метилированию ферментом Mspl, позволяла определить наличие сайта узнавания CCGG, в то время как амплификация рестриктов RsaI+НраП позволяла проанализировать состояние метилирования ДНК.
Полимеразную цепную реакцию проводили по стандартной схеме (Saiki, 1990) при помощи программируемого термоциклера МС2 фирмы «ДНК-технология» с использованием термофильной ДНК-полимеразы Taq фирмы "ИнтерЛабсервис" г. Москва.
ПЦР проводили в общем объёме 50 мкл по следующей схеме: К 2 мкл рестрикционной смеси добавляли 25 пМ каждого олигопраймера, 200 мкМ каждого дезоксинуклеотидтрифосфата, 1 единицу термофильной ДНК-полимеразы, 50 мкл однократного буфера для ПЦР следующего состава: 50мМ КС1, ЮмМ трис-НС1 рН 8,4; 1,5 мМ MgCb, 10% DMSO. Затем добавляли 40-60 мкл вазелинового масла. Начальную денатурацию проводили при 94С в течение 10 мин., затем следовали 5 циклов при мягких условиях:
Денатурация: 94 С - 30 сек. Отжиг: 40 С -1 мин. Элонгация: 72 С -1 мин. 30 сек. Затем следовали 30 циклов при жёстких условиях: Денатурация: 94 С -15 сек. Отжиг: 55 С-15 сек. Элонгация: 72 С -1 мин. МЧ-ПЦР завершали инкубацией смеси при 72 С в течение 10 мин. Праймеры выбирались попарно случайным образом из следующего набора: 5 -age cct gec tgc ccg ссе cac-3 ; 5 gg egg gca gcg ttc teg gca-3 ; 5 -act tgc ctt gcg ttg gtc ccg-3 ; 5 -cgg cgt cca cct ссе аса atg-3 ; 5 -cgt gta cgt gtc cag gcg ctg-3 ; 5 -caa gac caa gac get get caa-3 ; 5 -aaa gtc cct gtg tec etc tgc-3 .
Электрофорез продуктов ПЦР проводили в 8% ПААГ в течение 2-3 часов. Состав 8% ПААГ: 8.4 мл 30% раствора АА (29:1) 1.4 мл 10х буфера ТВЕ, до 30 мл диет, воды, 600 мкл 10% аммония персульфата (APS), 26 мкл ТЕМЕД. Визуальный контроль пробега проб ДНК проводили по ксиленцианолу и бромфеноловому синему.
Проводили окрашивание геля нитратом серебра по приведенной ниже методике. Для фиксации результатов ПААГ проводили сканирование гелей.
Окрашивание гелей проводили по усовершенствованной методике Liberman. После электрофореза гель помещали в раствор 10% метанола и 5% уксусной кислоты на 10-15 минут. Затем дважды отмывали дистиллированной водой. После этого гель инкубировали в растворе 0,011 М AgNCb в течение 10-15 минут, трижды промьюали в дистиллированной воде. Проявление проводили в модифицированном растворе проявителя (увеличена концентрация НСНО) следующего состава: 0,75 М NaOH; 0,5 М НСНО; 2,ЗшМ Ка(ВЩ) около 10-15 минут, в зависимости от интенсивности проявления геля.
Фрагменты, отобранные для последующего анализа, вырезали, измельчали и инкубировали в элюирующем буфере (0,5М ацетат аммония и 1мМ ЭДТА, рН 8,0) в течение ночи при 37С. Далее образец очищали от геля с помощью колонок Freeze N Squeeze (Bio-Rad, США). Выделенный фрагмент ДНК амплифицировали в трех пробирках, одна из которых содержала оба праймера, а две других только по одному олигонуклеотиду из пары, использованной для МЧФП. Этот этап был необходим для определения нуклеотидного состава фланкирующих последовательностей интересующего нас фрагмента. В случае амплификации с одного праймера, ПЦР-продукт подвергали рестрикции ферментом Mspl и проводили секвенирование смеси с соответствующим праймером. В случае амплификации с участием обоих праймеров проводили прямое секвенирование по протоколам ABI Prism 310 Genetic Analyzer Kits ("Applied Biosystems", США). Полученные нуклеотидные последовательности сопоставляли с базой данных GenBank с помощью программы BLAST.
Для анализа метилирования промоторных областей изучаемых генов проводилась обработка ДНК метилчувствительной рестриктазой ДраІІ по следующей схеме: к 1,5 мкг геномной ДНК добавляли 3 е.а. фермента и 2 мкл соответствующего 10х буфера, доводили до 20 мкл деионизованной водой и инкубировали 10 часов в термостате при температуре 37С.
Идентификация дифференциально метилированных CpG-островков в образцах ДНК больных РМЖ
Один из дифференциально метилированных фрагментов, выявленных нами методом МЧФП, был идентифицирован как участок CpG-островка, локализованного в 5 -области гена BIN], кодирующего широко экспрессирующийся адапторный протеин, обладающий свойствами супрессора опухолевого роста. BIN1 специфически взаимодействует с MYC, ингибируя его онкогенную активность. Поскольку MYC играет ключевую роль в регуляции клеточного цикла как нормальных, так и неопластических клеток, усиление его онкогеннои активности, вследствие повреждения BIN1, может приводить к малигнизации клеток (Ge et al, 2000).
Ген BIN1 расположен на хромосоме 2ql4.3, в локусе, для которого показана потеря гетерозиготности в 30-40% карцином молочной железы (Kerangueven et al., 1997). В ряде работ было показано нарушение экспрессии BIN1 в клеточных линиях и образцах РМЖ. Sakamuro с сотр. обнаружили снижение или полную потерю экспрессии гена в клеточных линиях ряда опухолей, в том числе в 5 из 6 линий РМЖ, а также в 3 из 6 первичных карцином молочной железы (Sakamuro et al., 1996). На основании гистохимического анализа и ПЦР обратных транскриптов Ge с сотр. продемонстрировали полную или частичную потерю BIN1 в 30/50 (60%) образцов опухолей молочной железы (Ge et al, 2000). Несмотря на наличие генетических повреждений BIN1, в частности делеций (потерь гетерозиготности), частота этих нарушений недостаточна для объяснения всех случаев потери экспрессии гена, что позволяет предположить значимую роль эпигенетических факторов (Ge et al., 2000). Одним из таких факторов может служить абберантный сплайсинг мРНК BIN1, выявленный при меланоме и раке простаты (Ge et al., 2000а, Ge et al., 1999). Другим эпигенетическим механизмом потери экспрессии может быть метилирование промотора гена. Мы не обнаружили в литературе сообщений о наличии аномального метилирования CpG-островка промотора при каких-либо онкологических заболеваниях, однако Lodygin с соавт. показали реактивацию экспрессии ВЇЇЧ1 в одной из трех клеточных линий рака простаты (Du-145) под действием 5-аза-2 -дезоксицитидина. Это позволяет предположить эпигенетический механизм регуляции экспрессии путем метилирования промотора гена (Lodygin et al., 2005).
Чтобы оценить характер метилирования CpG-островка гена BIN1 мы выполнили дизайн специфических праймеров для идентифицированного нами фрагмента ДНК и разработали протокол мультилокусной МЧ-ПЦР, позволяющий объективно оценить полученные результаты. Частота метилирования в образцах ткани первичных опухолей молочной железы составила 18/98 (0,18; 95% ДИ: 0,1-0,26), кроме того, метилирование было обнаружено в ДНК из клеточных линий РМЖ MCF7 и T47D. В то же время, метилирования соответствующего участка в клеточных линиях рака простаты DU145 и LNCap выявлено не было. Для подтверждения полученных результатов проведено метилспецифическое секвенирование исследуемого фрагмента ДНК в 10 образцах условно нормальной ткани молочной железы, 9 образцах РМЖ и четырёх клеточных линиях (MCF7, T47D, DU145 и LNCap) (рис.13).
Анализ экспрессии гена BIN1 был выполнен методом ОТ-ПЦР и показал снижение или отсутствие экспрессии в 80% исследованных образцов опухолей. Исследование экспрессии проводилось по отношению к гистологически неизмененной ткани для 13 пар образцов и двух клеточных линий РМЖ (рис.15).
В клетках линии MCF7 наблюдается полная потеря экспрессии BIN1, в линии T47D экспрессия снижена в 6 раз, что хорошо согласуется с полностью метилированным состоянием исследованного фрагмента CpG островка гена в MCF7 и частично метилированным - в T47D. Экспрессия BIN1 также снижена или образцы РМЖ РисЛ5. Анализ экспрессии гена ВІЮ в образцах РМЖ. На оси абсцисс отображены номера образцов РМЖ на оси ординат - десятичный логарифм кратности относительного изменения экспрессии гена. отсутствует во всех исследованных образцах тканей РМЖ с метилированным участком промотора гена. Тем не менее, частота потери экспрессии BIN1 значительно превосходит частоту аномального метилирования его CpG-островка, что не позволяет считать метилирование доминирующим механизмом инактивации этого гена. На это же указывает отсутствие метилирования CpG-островка BIN1 в клетках линии DU145, на примере которой показана реактивация этого гена после обработки деметилирующим агентом.
Одной из распространённых форм молекулярной патологии генов, вовлечённых в канцерогенез, приводящей к снижению их экспрессии, является потеря гетерозиготности (делеция одного или обоих аллелей). Как уже указывалось, ранее был отмечен высокий уровень (30-40%) потери гетерозиготности (ПГ) в области расположения гена BIN1, 2ql4.3, в карциномах молочной железы (Kerangueven et al., 1997). Нами проведён более тонкий анализ ПГ с использованием трёх микросателлитных маркеров, расположенных в пределах или в непосредственной близости гена BIN1. Для анализа были выбраны один ранее охарактеризованный динуклеотидный повтор, расположенный в пятом экзоне, и два новых микросателлитных маркера, предполагаемые полиморфные участки которых представляют собой ди- и тринуклеотидные повторы, расположенные соответственно в 3 т.п.н. дистальнее BIN1 и в первом экзоне гена (рис.16).
![Идентификация и характеристика генов, влияющих на поддержание и фенотипическое проявление прионоподобного детерминанта [ISP+], у дрожжей Saccharomyces cerevisiae](/i/i/4278/150135.png "Идентификация и характеристика генов, влияющих на поддержание и фенотипическое проявление прионоподобного детерминанта [ISP+], у дрожжей Saccharomyces cerevisiae Аксенова Анна Юрьевна")