Содержание к диссертации
Введение
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12
1. TEHBRCAI - СУПРЕССОР ОПУХОЛЕВОГО РОСТА 12
2. СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ ГЕНА BRCA 1 13
2.1. Структура гена BRCA 1 13
2.2. Функции гена BRCA1 16
2.2.1. Роль BRCA1 в репарации ДНК 16
2.2.2. Роль BRCA1 в регуляции транскрипции 19
2.2.3. Участие BRCA1 в контроле клеточного цикла 20
3. МЕХАНИЗМЫ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ КЛЕТКИ ПРИ ДЕФЕКТАХ TEHABRCAI 20
4. МУТАЦИИ В ГЕНЕ BRCA 1 25
4.1. Общие характеристики мутаций 25
4.2. Номенклатура вариаций 27
4.3. Спектр мутаций в гене BRCA 1 28
4.4. Частоты встречаемости мутаций в генах BRCA 1/2 29
5. ПОЛИМОРФИЗМЫ в ГЕНЕ BRCA 1 32
5.1. Критерии полиморфизмов 32
5.2. Исследование полиморфизмов в гене BRCA1 33
6. МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ МУТАЦИЙ 37
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 42
1. ПАЦИЕНТЫ 42
2. АНАЛИЗ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ ГЕНА BRCA1 42
2.1. Выделение ДНК. 43
2.2. ПЦР (полимеразная цепная реакция) 44
2.3. Электрофорез 47
2.4. Окраска геля 49
2.5. Секвенирование. 49
2.6. Статистическая обработка результатов 50
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 51
1. ВЫЯВЛЕНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ ДНК в ГЕНЕ BRCAl... 51
2. СПЕКТР МУТАЦИЙ в ГЕНЕ BRCA1 ПРИ СЕМЕЙНОМ РАКЕ молочной ЖЕЛЕЗЫ. 58
3. СПЕКТР МУТАЦИЙ в ГЕНЕ BRCА1 ПРИ СЕМЕЙНОМ РАКЕ яичников 62
4. ГЕТЕРОГЕННОСТЬ СЕМЕЙ С РАКОМ молочной ЖЕЛЕЗЫ И ЯИЧНИКОВ ПО
ВСТРЕЧАЕМОСТИ МУТАЦИЙ В ГЕНЕ BRCА1 66
5. ХАРАКТЕРИСТИКА ОДНОНУКЛЕОТИДНЫХ ПОЛИМОРФИЗМОВ
BTEHEBRCAI 78
6. ДНК-ДИАГНОСТИКА НАСЛЕДСТВЕННОЙ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К РАКУ
МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ И ЯИЧНИКОВ 83
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 94
ВЫВОДЫ 103
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 105
- TEHBRCAI - СУПРЕССОР ОПУХОЛЕВОГО РОСТА
- Структура гена BRCA 1
- МЕХАНИЗМЫ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ КЛЕТКИ ПРИ ДЕФЕКТАХ TEHABRCAI
- Общие характеристики мутаций
- Критерии полиморфизмов
Введение к работе
Рак молочной железы (РМЖ) относится к наиболее распространенным онкологическим заболеваниям. В структуре заболеваемости злокачественными новообразованиями среди женщин в России рак этой локализации занимает 1-е место (рис.1), а в структуре смертности — 2-е [Аксель и др., 2002].
Ежегодно в мире выявляют около 1 миллиона новых случаев, прогнозируя рост числа заболевших к 2010 году до 1,45 миллиона. Вероятность заболеть раком молочной железы в России на протяжении предстоящей жизни для новорожденной девочки составляет 3,5%, умереть от него -1,8%. В структуре онкологической заболеваемости женщин доля этой локализации варьирует в экономически развитых странах Европы от 25,7% в Испании до 34,3% во Франции, которая занимает первое ранговое место. В России доля этой формы рака составила в 2000 году 19,3% (рис.1).
Доля заболеваний вследствие высокого генетически обусловленного риска оценивается в 5 -10% всех случаев рака молочной железы на протяжении жизни людей и составляет более трети случаев рака молочной железы в возрасте до 30 лет [Claus et al., 1991]. Наследственная предрасположенность к раку молочной железы проявляется в накоплении случаев указанного заболевания в семьях. Наряду с раком молочной железы в таких семьях нередко наблюдается также рак яичников. Коренные сдвиги в понимании этого явления произошли в последнее десятилетие. Аутосомно-доминантное наследование рака молочной железы было показано в семьях с высоким риском этого заболевания [Newman et al., 1988]. Вскоре в области хромосомы 17q21 был картирован ген BRCA1 [Hall et al., 1990; Claus et al., 1991], выделенный в 1994 г. [Miki et al., 1994], который ответственен за наследственную предрасположенность к раку молочной железы и яичников. Спустя 2 года был клонирован второй ген, обусловливающий наследование повышенного риска рака молочной железы -BRCA2, локализованный в районе хромосомы 13ql2 [Tavtigian et al., 1996]. Результаты клонирования были подтверждены при анализе мутаций в выделенных генах у больных с семейной историей рака молочной железы [Castilla et al., 1994; Tavtigian et al., 1996]. Наибольшая доля наследуемых форм рака молочной железы и/или яичников связана с мутациями в гене BRCA1 [Ford et al.,1998]. Мутации данного гена являются высокопенетрантными и приводят к 50-90% риску возникновения заболевания [Antoniou et al., 2002].
За прошедший после выделения генов период накоплена значительная информация о наследуемых мутациях в гене BRCAL Известно, в частности, что мутации распределены по всему гену. В то же время, наблюдается популяционная зависимость в распределении мутаций. В этой связи, определение спектра мутаций в различных популяциях важно как с фундаментальной точки зрения, так и для решения практических задач медицинской генетики. Изучение характеристик мутаций на выборках из разных популяций позволит получить фундаментальную информацию по возникновению и распространению мутаций, их связи с клиническими проявлениями в составе разных генотипов. Семьи с наследственной предрасположенностью гетерогенны как по отягощенности раком яичников наряду с раком молочной железы, так и по числу пораженных заболеванием членов семьи. Эти характеристики семей могут быть связаны с вероятностью обнаружения мутации в гене BRCA1. Учитывая различия спектров мутаций в гене BRCA1 в разных популяциях, изучение наследуемых мутаций в связи с указанными характеристиками семей представляет существенный интерес. Такая информация важна, например, для выяснения возможной зависимости риска возникновения рака различной локализации
молочная железа желудок ободочная кишка тело матки шейка матки яичник прямая кишка легкое пемобластозы поджелудочная железа
Рис. 1. Структура заболеваемости населения России злокачественными новообразованиями в 2000 году (%) (приводится в соответствии с работой Аксель и др., 2002).
%15
Рис. 2. Доля IV стадии в структуре РМЖ (по данным работы Трапезников и др., 2001). (молочной железы или яичников) от положения мутации в гене [Thompson et al., 2002], а также выяснения взаимосвязи мутаций в данном гене с другими особенностями их клинического проявления. Помимо мутаций в гене BRCA1 обнаруживают ряд полиморфизмов. В ряде работ представлена информация по полиморфизмам в этом гене, но их анализ при семейном раке молочной железы и яичников пока нельзя признать достаточным. В частности, не ясна связь однонуклеотидных полиморфизмов гена BRCA1 с мутациями данного гена.
Определение спектра мутаций в гене BRCA1 и решение других указанных вопросов важно не только с фундаментальной точки зрения, но и для решения практических медико-генетических задач. Актуальность для практики обусловлена в частности тем, что смертность от РМЖ, являющаяся высокой, постоянно растет. Основной причиной высокой смертности больных раком молочной железы и яичников является позднее выявление болезни. Доля больных с IV стадией заболевания в структуре заболеваемости раком молочной железы неуклонно растет (рис.2) [Трапезников и др., 2001]. Следовательно, вопросы своевременной диагностики и профилактики рака молочной железы и яичников весьма актуальны, так как запоздалая клиническая диагностика во многих случаях этого онкологического заболевания обусловливает существенное сокращение продолжительности жизни, несмотря на лечение.
Изучение генов BRCA1 и BRCA2, ответственных за наследственную предрасположенность к раку молочной железы и яичников, создает принципиально новые возможности медико-генетического консультирования и профилактики при этом заболевании. Выявление мутаций в гене BRCA1 обеспечивает объективный критерий для формирования групп риска рака молочной железы с целью его профилактики и своевременной диагностики в случае возникновения заболевания. Более ранний возраст рака молочной железы и его высокая доля вследствие высоко пенетрантных наследуемых мутаций дополнительно акцентирует важность изучения соответствующих генов и практического использования полученных результатов. Создание ДІЖ-диагностики наследственной предрасположенности к раку молочной железы и яичников весьма важно и создает базу для формирования групп риска и развития профилактики на принципиально новой основе.
В связи со сказанным, щлью_настоящей работы было исследование мутаций и однонуклеотидных полиморфизмов в гене BRCA1 при наследственных формах рака молочной железы и яичников.
Были поставлены следующие задачи: изучить спектр мутаций в гене BRCA1 при семейном раке молочной железы и яичников; изучить однонуклеотидные полиморфизмы в гене BRCA1 при семейном раке молочной железы и яичников и в контрольной выборке; изучить связь мутаций в гене BRCA1 с клиническими характеристиками семей, а также провести сравнительный анализ выявленных частот и характеристик мутаций с наблюдаемыми в выборках из других популяций.
Научно-практическая значимость работы.
Научно-практическая значимость результатов настоящей работы обусловлена выявлением спектра мутаций в гене BRCA1 при семейном раке молочной железы и яичников. Выявленное преобладание одной мутации в спектре имеет существенное значение для практической ДНК-диагностики наследственной предрасположенности к раку молочной железы и яичников. Указанный феномен обеспечивает возможность проведения скрининговых исследований на предрасположенность к указанному заболеванию. Разработан оптимизированный способ обнаружения наиболее частых мутаций в гене BRCA1. Способ был применен для выявления мутаций в семьях с повышенным риском к раку молочной железы и яичников.
Новизна полученных результатов.
Впервые изучен спектр мутаций в гене BRCA1 на выборке семейного рака молочной железы и яичников в России. Показано, что частота мутации 5382insC является наибольшей по сравнению с выборками из других популяций. На основании результатов по частотам гаплотипов, охарактеризованных по ОНП, при мутации 5382insC и анализа частот встречаемости данной мутации в европейских странах выдвинута концепция о происхождении мутации 5382insC в европейской части России. Выявленное преобладание мутации 5382insC как при семейном раке молочной железы, так и яичников, а также результаты анализа соотношения семей с РМЖ, включающих и не включающих РЯ, свидетельствует об отсутствии определяющего влияния положения мутации в гене BRCA1 на локализацию рака. Анализ ОНП в гене BRCA1 при мутациях и без мутаций в данном гене среди пробандов с РМЖ или РЯ позволил сформулировать гипотезу об ассоциации гена BRCA1 с другим геном, предположительно, с геном BRCA2.
Положения, выносимые на защиту.
Изучены спектры мутаций и ОНП в гене BRCA1 при семейном раке молочной железы и яичников. Найденные частоты мутаций при семейном раке молочной железы и яичников составили 32%, при семейном раке только яичников - 86%. В спектре мутаций в гене BRCA1 преобладает мутация 5382insC. Частота данной мутации является наибольшей из выявленных на выборках из других популяций. Мутация 5382insC преобладает как при семейном РМЖ, так и при семейном РЯ. Семьи с раком молочной железы и яичников гетерогенны по частотам встречаемости мутаций в гене BRCA1. Частота мутаций в гене BRCA1 в семьях, включающих четыре и более случаев рака только молочной железы, достоверно понижена по отношению к остальным семьям в выборке. Показано преобладание встречаемости мутаций среди семей с РМЖЯ - мутации найдены у 61% таких семей. Среди семей с РМЖ мутации найдены у 16% семей. Показано различие частот генотипов по однонуклеотидным полиморфизмам между группами пробандов с мутациями и без мутаций в гене BRCA1. Показано, что частоты генотипов в группе пробандов с раком молочной железы или яичников, но без мутаций в гене BRCA1, отличаются от соответствующих популяционных частот.
TEHBRCAI - супрессор опухолевого роста
Как нами уже было отмечено, наибольшая доля случаев наследственной предрасположенности к раку молочной железы и яичников связана с наследуемыми мутациями в гене BRCA1.
В настоящее время основные представления о генетической природе развития онкологических заболеваний основаны на данных о существовании генов, нормальная функция которых связана с подавлением опухолевого роста. Такие гены были названы генами-супрессорами опухолевого роста [Weinberg, 1991]. Дефекты этих генов приводят к прогрессии, а восстановление функции - к существенному замедлению пролиферации или даже реверсии развития опухоли. Гены-супрессоры оказывают блокирующее воздействие на клеточное деление. Они контролируют интенсивность клеточного размножения, и если в них происходит мутация, то рост и размножение клеток становится бесконтрольным, что является ведущим признаком раковых опухолей.
Согласно 2-х ударной модели канцерогенеза, предложенной Кнудсоном (Knudson) в 1971 году, предполагается, что для перехода нормальной клетки в опухолевую необходимо два последовательных мутационных события. Первым событием является мутация, приводящая к образованию клетки, которая обладает повышенным риском возникновения опухоли. Такие мутации могут возникать как в соматических, так и в половых клетках. Вторым событием, происходящим в соматической клетке, является мутация в неповрежденном аллеле, или потеря гетерозиготности гена, и, затем, превращение клетки в злокачественную. Потеря гетерозиготности возникает, в частности, вследствие потери нормального гомолога хромосомы.
Структура гена BRCA 1
Ген BRCA1 находится на хромосоме 17q21 и состоит из 22 кодирующих и 2 некодирующих экзонов, разделенных нитронами с размерами от 0,4 до 9,2 тысяч пар нуклеотидов (т.п.н.) (рис.3). Один из половины кодирующей части гена, и занимает 3427 п.н. Общий размер кодирующих участков составляет 5592 нуклеотида, распределенных в геноме на протяжении более 80 т.п.н.
Ген BRCA1 кодирует белок из 1863 аминокислотных остатков. Сходство этого белка с другими известными белками минимально, однако, изучение структуры белка и сравнение ее с мышиным аналогом помогло выделить несколько областей конкретного функционального значения (рис.4).
- RING домен (или цинк-связывающий домен)
- NLS (сайт ядерной локализации) - область, ответственная за взаимодействие с RAD51
- BRCT домены (состоят из двух BRCT-N и BRCT-C доменов) Гомология между геном BRCA1 человека и его мышиным аналогом составляет
только 58%; низкое сходство указывает на быструю эволюцию этого гена. Несмотря на, в целом, низкую консервативность гена в эволюции, BRCA1 имеет две высоко консервативные последовательности - RING домен на N-конце и BRCT домен на С-конце. Оба домена насчитывают около 300 аминокислотных остатка, что составляет 16% от общего размера белка BRCAl [Jasin, 2002].
RING домен находится на N-концевой области белка, состоит приблизительно из 50 аминокислотных остатков [Miki et al., 1994]. RING домен содержит 8 цистеиновых и 1 гистидиновый остаток (ЗЦисГис4Цис), который связывает 2 атома Zn2+, осуществляя белок-белок или белок-ДНК взаимодействия. Многие различные белки имеют RING домены, образуя макромолекулярные комплексы [Lorick et al., 1999]. RING белки обладают убиквитин- лигазной активностью, облегчая перенос убиквитина от убиквитинсвязывающих ферментов к субстратным белкам [Jasin, 2002]. RING домен BRCAl взаимодействует с RING доменом BARD1, белком участвующим в репарации ДНК, образуя гетеродимер, который также обладает убиквитинлигазной активностью.
Механизмы злокачественной трансформации клетки при дефектах TEHABRCAI
Одна из трактовок механизма выполнения геном BRCA1 функции гена супрессора опухоли связаны с гипотезой Кинзлера и Фогелыптейна [Kinzler, Vogelstein, 1997], объясняющей данную роль нарушением репарационных процессов при дефектах гена BRCA1. Одна из схем такого рода приведена на рис.6.
Гены-супрессоры опухолевого роста можно подразделить на две большие группы по занимаемому ими месту в системе функционирования эукариотической клетки. Так в рамках предложенной Кинзлером и Фогельштайном [Kinzler, Vogelstein, 1997] концепции гены-супрессоры предложено разделить на: - гены контроля клеточного цикла (gatekeepers),
гены контроля целостности генома (caretakers).
Гены - контроля клеточного цикла напрямую вовлечены в его регуляцию. Их белковые продукты способны сдерживать опухолевую прогрессию, ингибируя процессы, связанные с делением клетки. Дефекты генов контроля целостности генома приводят к повышению нестабильности генома, увеличению частоты возникновения мутаций, и, следовательно, к повышению вероятности повреждения генов, в том числе и контроля клеточного цикла.
К группе контроля клеточного цикла относят, например, такие гены как RB1 (ретинобластома), WT1 (опухоль Вильмса), NF1 (нейрофиброматоз типа I) и другие. Если унаследована поврежденная копия гена контроля клеточного цикла, образование опухоли может быть инициировано соматической мутацией в неповрежденном аллеле. Поэтому в случае наследственных форм опухолей, когда имеется наследуемая мутация, для начала заболевания необходимо всего одно соматическое мутационное событие - повреждение единственного функционального аллеля. Спорадические случаи возникновения опухоли того же типа требуют двух независимых мутационных событий в обоих аллелях. В итоге, для носителей мутантного аллеля вероятность развития данного типа опухоли значительно выше, чем в среднем по популяции.
Общие характеристики мутаций
По типу изменения в нуклеотидной последовательности и характеру последствий выделяют мутации: сдвига рамки считывания, приводящие либо к преждевременному окончанию его синтеза, либо к образованию «бессмысленного» белка, мутации сайтов сплайсинга - изменения нуклеотидов в местах сплайсинга, приводящие к его нарушению, нонсенс-мутации, представляющие собой замены нуклеотидов, при которых образуются терминирующие ко доны, и, соответственно, происходит преждевременное окончание синтеза кодируемого геном белка, миссенс-мутаци обусловлены однонуклеотидными заменами в кодирующих участках гена. Мутации сдвига рамки считывания возникают вследствие делеции или инсерции, некратной трем нуклеотидам. Проявление таких мутаций зависит от их локализации. Чем ближе мутации к началу гена, то есть к началу транскрипции, тем короче их белковые продукты, которые не способны к модификациям и быстро деградируют.
Мутации на стыке экзонов и интронов - мутации сайтов сплайсинга - часто нарушают процессинг первичного РНК-транскрипта, в результате чего происходит либо неправильное вырезание соответствующей интронной области и трансляция бессмысленного удлиненного белка, не защищенного от протеолитического действия внутриклеточных ферментов, либо вырезания экзонов и образование делетированного белка. Наиболее часто такие мутации обусловлены заменами существенных инвариантных GT и AG динуклеотидов, локализованных, соответственно, в начале интрона (донорный сайт сплайсинга) и в конце интрона (акцепторный сайт сплайсинга). В результате чего происходит потеря экзона. Критическое значение имеют также последовательности, прилежащие к указанным динуклеотидам.
В случае миссенс-мутаций наиболее часто замены, приводящие к изменениям на уровне белка, затрагивают нуклеотидные основания в первой или во второй позиции кодона, однако замены основания в третьей позиции кодона также могут приводить к серьезным нарушениям из-за вероятности активации критических сайтов сплайсинга. Фенотипическое проявление замен в кодонах миссенс-мутаций зависит от природы соответствующих аминокислотных замен в белке и от функциональной значимости того домена, в котором это произошло.
Критерии полиморфизмов
Наиболее распространенный критерий для отнесения изменений последовательности ДНК в гене к разряду полиморфизмов связан с их частотой. Считают, что полиморфизм - это вариант, представленный в популяции с частотой более 1 % [Shin etal, 2000].
В то же время, данный критерий не является исчерпывающим. В частности, полиморфизмы могут иметь частоту менее 1%. Наиболее надежной могла бы быть полная характеристика функциональных особенностей варианта гена и их связи с возникновением патологии. Однако такой путь является сложным, и в настоящее время в ряде случаев исследуются только отдельные функциональные характеристики. В связи с этим используют ряд критериев, по которым относят данный вариант либо к полиморфизму, либо к мутации. Например, авторы работы [Deffenbaugh et.al.,2002] варианты последовательностей нуклеотидов в гене BRCA1 относят к полиморфизмам по следующим критериям:
1. Частота варианта, наблюдаемая в контрольной группе, равна или больше частоте в группе больных.
2. Вариант не ко-сегрегирует с болезнью в семьях, где он встречается.
3. Миссенс варианты не приводят к замене аминокислоты.
4. Аминокислота, кодируемая участком ДНК с вариантами нуклеотидов, не сохраняется в эволюции (сравнение между человеком, мышью и собакой) или не встречается в области известного функционального значения.
