Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 11
1.1 Гетерохроматин – эволюционно значимая часть генома эукариот 11
1.2 Структурно-функциональные особенности гетерохроматина интерфазных ядер 17
1.3 Молекулярный состав гетерохроматина 24
1.4 Гетерохроматин политенных хромосом Diptera 34
1.4.1 Drosophila 35
1.4.2 Anopheles 38
1.5. Таксономия комплекса maculipennis 41
2 Материалы и методы 47
2.1 Характеристика объекта исследования 47
2.2 Приготовление цитологических препаратов политенных хромосом 47
2.3 Микродиссекция с последующим получением ПЦР-продукта 48
2.4 Микроклонирование ПЦР-продукта 49
2.5 In situ гибридизация ДНК-пробы из хромосомы 2L Аn. beklemishevi на геномную ДНК исследуемых видов 50
2.6 Выделение геномных ДНК An. beklemishevi, An. messeae, An. atroparvus 52
2.7 Выделение плазмидной ДНК 52
2.8 Секвенирование клонов минибиблиотеки Abekl2L 53
2.9 Анализ последовательностей ДНК 53
3 Результаты и обсуждение 55
3.1 Особенности локализации ДНК района прикрепления 55
хромосомы 2L An. beklemishevi на хромосомах видов Diptera
3.1.1 Особенности локализации ДНК района прикрепления хромосомы 2L An. beklemishevi на хромосомах видов Anopheles комплекса maculipennis 55
3.1.2 Особенности локализации ДНК района прикрепления хромосомы 2L An. beklemishevi (Abekl2L) на хромосомах видов D. melanogaster, D. erecta, D. teissieri 68
3.1.3 Характеристика последовательностей ДНК
минибиблиотеки Abekl2L 72
3.2 Взаимосвязь особенностей молекулярного состава ДНК и прикрепления к оболочке участков прицентромерного гетерохроматина политенных хромосом комаров комплекса Anopheles maculipennis 85
Заключение 89
Выводы 92
Список использованной литературы
- Гетерохроматин политенных хромосом Diptera
- Приготовление цитологических препаратов политенных хромосом
- Микроклонирование ПЦР-продукта
- Особенности локализации ДНК района прикрепления хромосомы 2L An. beklemishevi (Abekl2L) на хромосомах видов D. melanogaster, D. erecta, D. teissieri
Введение к работе
Актуальность работы. Современный взгляд на структурную
организацию генома предполагает существование хромосомных территорий и связь хромосом с ядерной оболочкой. В этом процессе большое значение имеет гетерохроматин, обеспечивающий динамичность хромосомно-мембранных отношений, что предусматривает его важную роль в эволюции эукариот. Различия в составе, количестве, структуре и распределении характеризуют гетерохроматин как фактор, сопутствующий видообразованию (Корочкин, 1983; Стегний, 1991; Жимулев, 1993). Одной из главных черт, отличающей гетерохроматин, является наличие повторенных последовательностей ДНК, что определяет его как быстро эволюционирующую часть генома. Состав и сочетание высоких и умеренных повторов, с включенными в них мобильными элементами, а также их разнообразие и особенности кластерной представленности, видимо, имеет специфичность и определяет особенную структуру гетерохроматина различных видов (Dimitri et al., 2009, Stacie et al., 2009). Прицентромерные гетерохроматиновые районы (ПГ) хромосом часто являются районами прикрепления (РП) к ядерной оболочке, поэтому изучение прицентромерного гетерохроматина позволяет расширить знания о влиянии изменений состава гетерохроматина на пространственную структуру ядра. Уникальным объектом для данных исследований являются малярийные комары рода Anopheles комплекса maculipennis (Diptera, Сulicidae), которые обладают хорошо структурированными политенными хромосомами в ядрах трофоцитов яичников у самок имаго и в ядрах слюнных желз у личинок.
Политенные хромосомы в ядрах трофоцитов яичников восьми видов
комаров комплекса maculipennis имеют четкие различия по наличию, либо
отсутствию облигатного прикрепления к ядерной оболочке, по морфологии
участков прикрепления и по внутрихромосомному расположению РП (Стегний,
1979, 1987). У мух рода Drosophila – Drosophila melanogaster (Meigen, 1830) и
Drosophila virilis (Sturtevant, 1916) также были обнаружены структурные
изменения прицентромерного гетерохроматина политенных хромосом и их
отношения к ядерной оболочке при видообразовании (Стегний, Вассерлауф,
1994; Стегний и др., 1996). Изучение гетерохроматина в группах
близкородственных видов является актуальным, поскольку позволяет
проследить процесс видообразования. Среди восьми видов комплекса наиболее
яркие различия прицентромерного гетерохроматина по структуре и
взаимодействию с ядерной оболочкой наблюдаются у вида Anopheles atroparvus
(van Thiel, 1927) в районе прицентромерного гетерохроматина хромосомы 2R.
Молекулярный состав данного района является характерным для
конститутивного гетерохроматина, образован повторяющимися
последовательностями ДНК, мобильными элементами и структурными генами. Результаты флуоресцентной in situ гибридизации районспецифичного ДНК-зонда Atr2R из района прицентромерного гетерохроматина хромосомы 2R на политенные хромосомы трофоцитов яичников малярийных комаров An. atroparvus, Anopheles messeae (Falleroni, 1926), Anopheles beklemishevi (Stegnii et Kabanova, 1976) показали наличие гомологичных последовательностей со всеми
районами прицентромерного (- и -) гетерохоматина хромосом данных видов, кроме прицентромерного гетерохроматина хромосомы 2L An. beklemishevi (Грушко и др., 2004). Для изучения состава ДНК был выбран район -гетерохроматина прицентромерного гетерохроматина хромосомы 2L An. beklemishevi, поскольку он имеет «жесткое» крепление к оболочке ядра и, видимо, сильно отличается по молекулярному составу от нуклеотидных последовательностей прицентромерного гетерохроматина хромосомы 2R An. atroparvus.
Цель и задачи исследования. Целью исследования является молекулярно-генетический анализ ДНК района прикрепления хромосомы 2L малярийного комара An. beklemishevi и сравнение его с ДНК районов прикрепления хромосом уже изученных видов комплекса maculipennis. Задачи исследования:
- получить минибиблиотеку фрагментов хромосомной ДНК из РП левого плеча
хромосомы 2 An. beklemishevi (Abekl2L) методом микродиссекции с
последующей амплификацией и клонированием в плазмидном векторе,
определить первичную последовательность полученных фрагментов ДНК;
- провести сравнительный анализ локализации нуклеотидных
последовательностей, гомологичных нуклеотидным последовательностям
библиотеки Abekl2L в хромосомах An. beklemishevi, An. atroparvus, An.
messeae;
- проверить возможность наличия/отсутствия взаимосвязи между
морфологическим типом отношения хромосомы к ядерной оболочке и
паттерном нуклеотидных последовательностей РП на примере
близкородственных видов двух родов Diptera: Anopheles и Drosophila.
- определить нуклеотидную последовательность ДНК клонов фрагментов
минибиблиотеки Abekl2L методом секвенирования. Провести
аннотирование последовательностей ДНК минибиблиотеки при помощи
различных методов биоинформатики;
- выявить отношения фрагментов ДНК из РП к ядерной оболочке хромосомы
2L Аn. beklemishevi к фрагментам ДНК, предположительно участвующим в
формировании разных типов петель хроматина: MAR/SAR, ДНК ядерной
ламины, ДНК синаптонемного комплекса, ДНК розеткоподобных структур.
Научная новизна. Впервые на молекулярно-цитологическом уровне
изучены нуклеотидные последовательности РП к ядерной оболочке хромосомы
2L An. beklemishevi. Определена первичная нуклеотидная последовательность
данного участка хромосомной ДНК, в результате анализа которой было
выявлено наличие повторяющихся последовательностей ДНК, гомологичных
разнообразным мобильным элементам класса LINE семейства L1, GYPSY 12-I
D. melanogaster, простым тандемным повторам (TTGTG), сателлитам
(TAAAAA)2, (CAAAAA)n, фрагментам генов An. gambiae, Ae. aegypti и D.
melanogaster. При сравнении нуклеотидных последовательностей
минибиблиотеки изучаемого района An. beklemishevi и минибиблиотеки из района прикрепления 2L An. atroparvus между собой найдено только две пары фрагментов ДНК с высокой степенью гомологии (95%). При помощи методов
биоинформатики обнаружено, что в составе последовательностей ДНК
минибиблиотеки РП к ядерной оболочке хромосомы 2L An. beklemishevi
присутствуют нуклеотидные последовательности, относящиеся к
последовательностям MAR/SAR, ялДНК, скДНК (предполагаемые
«структурные» участки хромосом). РП прикрепления к ядерной оболочке хромосомы 2L An. beklemishevi отличается по соотношению представленности разных классов «структурных» участков хромосом как от РП хромосомы 2R An. atroparvus так и от РП An. messeae.
Практическая значимость. В настоящей работе впервые проведено
молекулярно-цитогенетическое исследование нуклеотидных
последовательностей РП хромосомы 2L An. beklemishevi; получена
минибиблиотека клонов ДНК этого района, определена первичная
последовательность РП прикрепления к ядерной оболочке хромосомы 2L An. beklemishevi. Полученные результаты имеют важное фундаментальное и прикладное значение. Они вносят весомый вклад в понимание механизма структурной реорганизации генома эпидемилогически опасных малярийных комаров комплекса maculipennis в процессе видообразования.
Апробация результатов. Результаты работы представлены на
Международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (Томск, 2007), Международной конференции «Хромосома 2009» (Новосибирск, 2009), Международной конференции по кариосистематике беспозвоночных животных «Карио V» (Новосибирск, 2010). По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, две из которых – статьи в журналах, соответствующих перечню ВАК.
Личный вклад автора. Основные результаты получены автором самостоятельно. Автор лично планировал эксперименты и обобщал полученные данные. Микродиссекция и DOP-ПЦР проводились совместно с д.б.н. Н. Б. Рубцовым и к.б.н. Т. В. Карамышевой (ИЦиГ СО РАН). Секвенирование фрагментов библиотеки Abekl2L на начальном этапе проводилось совместно с к.б.н. М.В. Лебедевой (НИИ МГ СО РАМН), далее самостоятельно. Компьютерный анализ первичных последовательностей выполнен совместно с к.б.н. Е.А. Елисафенко (ИЦиГ СО РАН). FISH ДНК из прицентромерного района хромосомного плеча 2L An. beklemishevi с политенными хромосомами близкородственных видов Drosophila подгруппы melanogaster проведена при участии к.б.н. К.Е. Усова (НИИ ББ ТомГУ).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, 2 из которых – статьи в журналах, соответствующих перечню ВАК.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 113 страницах машинописного текста и состоит из следующих частей: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, заключение, выводы и список литературы. Библиографический список включает 142 источника. Работа иллюстрирована 13 рисунками и 8 таблицами.
Гетерохроматин политенных хромосом Diptera
Гетерохроматин является специфической частью хроматина. В 1904 году хроматин был охарактеризован Т. Бовери как вещество клеточного ядра, которое в процессе митоза преобразуется в хромосомы. Позднее понятие хроматина Э. Гейц дополняет двумя новыми понятиями – гетерохроматин и эухроматин. Уже на раннем этапе исследований гетерохроматина было обнаружено, что распределение этого элемента хроматина в клеточном ядре закономерно связано с определенными участками хромосом и хромосомами в целом. Например, гетерохроматином полностью образована половая Y-хромосома и большая часть половой X хромосомы многих видов животных и растений. Так, у D. melanogaster полностью гетерохроматизирована Y-хромосома и около 40 % X-хромосомы. Так же, стало очевидным широкое распространение гетерохроматиновых районов: в области ядрышкового организатора, в области центромер, в теломерных районах (Прокофьева-Бельговская, 1986). Открытие политенных хромосом с высокой степенью политенизации у двукрылых позволило более детально изучить свойства гетеро- и эухроматиновых районов. Оказалось, что гетерохроматические зоны хромосом организованы так же, как и эухроматические – имеют нуклеосомную организацию (Olins, Olins, 1974), но многочисленные исследования гетерохроматина выявили особые его цитологические, молекулярные и генетические свойства. Гетерохроматин чаще всего располагается в прицентромерных районах, иногда в теломерных областях. Обнаружены вкрапления гетерохроматина в эухроматино2в ые участки хромосомных плеч. Такой гетерохроматин называют интеркалярным, он хорошо заметен в сильно декомпактизованных хромосомах, например, в политенных. Расположение и количество гетерохроматина на хромосомах видоспецифично (Redi et al., 2001).
Ряд методов специфичных окрасок позволяет выявить ярко окрашивающийся, блочный гетерохроматин – -гетерохроматин, который составляет, как правило, саттелитная ДНК. гетерохроматин присутствует в виде рыхлых зернистых блоков и занимает большую часть прицентромерной области. Он преимущественно образован мобильными элементами и их производными и содержит меньше повторов (Прокофьева Бельговская, 1986). Переход между этими типами гетерохроматина определить довольно сложно (Zhimulev, 2003). У большинства видов эукариот хромосомы содержат как эу-, так и гетерохроматиновые участки. Чаще всего, у эукариот гетерохроматин сконцентрирован в блоки (около миллиона пар нуклеотидов), в основном, в прицентромерных и субтеломерных районах всех хромосом (Redi et al., 2001). Гетерохроматин составляет значительные части геномов – до 60% геномов некоторых организмов и около 30% геномов человека и дрозофилы (Прокофьева-Бельговская, 1986; Gatti, Pimpinelli, 1992; Жимулев, 1993).
Первые исследования гетерохроматина на предмет активности в клеточном метаболизме привели ученых к выводу о нейтральности его функций и мнению о том, что гетерохроматин является балластом в структуре хромосомы. В начале 70-х г.г. прошлого столетия было экспериментально доказано наличие сателлитных последовательностей в гетерохроматине, а затем и содержание в них некоторых РНК-кодирующих последовательностей (Commings,3 Mattoccia, 1972; Gall et al., 1971).
Эти факты указывали на наличие определенных функциональных свойств гетерохроматина. Всего за время изучения гетерохроматина были открыты следующие его свойства. Первым открытым свойством является сохранение компактного состояния на протяжении почти всего клеточного цикла (Heitz, 1928). Впоследствии обнаружили преимущественную локализацию гетерохроматина на периферии интерфазного ядра, а связи его с ядерной оболочкой имеют пространственно упорядоченный характер. Такое взаимодействие является основой как для упорядочения хромосом между собой, так и по отношению к ядерной оболочке в интерфазном ядре в целом (Paddy et al., 1990; Belmont et al., 1993; Marshall et al., 1996; Carvalho et al., 2001; Sage, Csink, 2003; Стегний, 1993). Гетерохроматин реплицируется в самом конце S-фазы (Lima-de Faria, Jaworski, 1968; Прокофьева Бельговская, 1986), благодаря, в том числе, и альтернативным механизмам инициации процесса, которые различны для эу- и для гетерохроматина, и регулируются независимо друг от друга (Груздев, 1999). Таким образом, проявляется лабильность репликации гетерохроматина, что обеспечивает избирательное функционирование и гетерохроматиновых районов, и прилегающих к ним эухроматиновых районов в онто- и филогенезе (Прокофьева-Бельговская, 1986). В политенных хромосомах наблюдается недорепликация гетерохроматина прицентромерных районов (Rudkin, 1965, Жимулев, 1993). Гетерохроматин наделяет специфическими свойствами прилегающие участки хромосом. Например, такие участки могут обладать повышенной мутабельностью генов, высокой вероятностью разрывов и хромосомных перестроек (Прокофьева-Бельговская, 1938; 1986). Эти свойства гетерохроматина имеют большое значение, особенно принимая во внимание его молек4у лярный состав. Сейчас известно, что гетерохроматин является не менее важной частью генома, чем эухроматин. (Корочкин, 1983; Стегний, 1991; Кикнадзе и др., 1991, Dimitri et al., 2005, 2009).
Гетерохроматин содержит повторяющиеся последовательности ДНК и обогащен этими последовательностями (Britten, Kohne, 1968, цит. по Жимулев,1993). Повторенные последовательности обнаружили в результате градиентного центрифугирования в хлористом цезии. Эти последовательности ДНК были названы сателлитными ДНК (cатДНК) (по аналогии со спутник – сателлит), так как при центифугировании кроме основной фракции выделилось еще несколько – отличных по молекулярной массе. СатДНК является характерным и необходимым компонентом генома всех эукариот (Beridze, 1986; Bostock, 1986). Биологическое значение сатДНК неоспоримо, так как она является основным компонентом в функционировании центромеры (кинетохора), что показано для хромосом D. melanogaster (Sun et al., 1997) и человека (Schueler et al., 2001). СатДНК состоит из тандемно организованных повторов, не кодирует белки и локализована в конститутивном гетерохроматине хромосом – в прицентромерных районах. Что и обуславливает обедненность гетерохроматина генами. Длина повторов, собственно сатДНК, варьирует от 2 пар нуклеотидов до нескольких сотен. В родственных геномах часто обнаруживается наличие общих или родственных типов сатДНК. Повторяющиеся единицы сатДНК различны по своей специфичности. Некоторые повторы встречаются в большом количестве во всех видах определенного рода, в то время как другие могут присутствовать в одном или нескольких видах. Например, обнаружены существенные отличия в степени амплификации повторов между дикими и культурными видами высших растений (Schwe5iz er et al., 1988; 1993, Hemleben et al, 2007). СатДНК участвует в формировании центромеры и обладает вариабельностью, в отличие от повторенных элементов, расположенных в теломерных концах хромосом, и являющихся консервативными. Даже у близкородственных видов могут различаться прицентромерные сателлитные последовательности. Прослеживаются различия в гистоне CENP-A у близкородственных видов млекопитающих и Cid у видов Drosophila (Hennikoff et al., 2001). В состав гетерохроматина часто интегрируются мобильные элементы. Там они накапливаются и могут служить источником новых семейств сатДНК (Dimitri, 1999). В ряде случаев наблюдается значительное сходство последовательностей сатДНК и фрагментов мобильных элементов. У растений показано, что сатДНК является наиболее вариабельной частью генома с высокой скоростью молекулярной эволюции (Hemleben et al., 2000). Существует гипотеза «эгоистичной ДНК», согласно которой, эволюция сатДНК связана со способностью перемещаться по геному (Southern, et al., 1980). Предполагается, что сатДНК не кодирует никакой информации, и поэтому отбор должен был привести к элиминации этих последовательностей. А так как мобильные элементы способны к транспозиции, это свойство обеспечивает их выживание в геноме.
Приготовление цитологических препаратов политенных хромосом
ДНК ядерных белковых структур не имеет гомологичных последовательностей и в составе генома близкородственных видов и, даже, в геноме одного организма (Глазков, 1995). Это свидетельствует о том, что для специфичности связывания со структурными белками не важна первичная последовательность нуклеотидов. Показано, что для специфичности связывания имеет значение вторичная структура фрагмента ДНК, приобретаемая за счт общей композиции, по которой ДНК ядерных белковых структур различных организмов сходны между собой. Все они являются AT-богатыми последовательностями, имеют в свом составе поли-(A)- и поли-(T)-блоки, содержат чередующиеся пурин-приримидиновые гомополимерные блоки, которые дают изгибы молекулы ДНК, что может обеспечивать существование петельных структур, и содержат палиндромные мотивы, формирующие шпильки, а также, обогащены сайтами связывания топоизомеразы II (Глазков, 1995).
Районы гетерохроматина различаются по способности к связыванию с ядерной оболочкой даже на хромосомах одного вида. Так, районы прицентромерного гетерохроматина хромосомы 2 трофоцитов яичников An. messeae не связаны с ядерной оболочкой, тогда как прицентром3 ерный гетерохроматин правого и левого плеч хромосомы 3 всегда связан с оболочкой тяжами гетерохроматина (Стегний, Шарахова, 1991). Сходные результаты были получены при анализе пространственного расположения в пространстве ядра хромосомоспецифичных проб -сателлитов в ядрах B-лимфоидных клеток человека. Оказалось, что центромерные районы одних хромосом (2, 4, 6, 7, X, 9, 10, 12 и 18) локализованы на ядерной периферии, а других (15, 16, 17, 18, 22) – преимущественно ассоциированы с ядрышком (Carvalho et al., 2001). Результаты этого анализа говорят о том, что позиция прицентромерного гетерохроматина относительно ядерной оболочки хромосомоспецифична. Следовательно, прикрепление или не прикрепление гетерохроматиновых районов хромосом к ядерной оболочке определяется не их гетерохроматиновым состоянием, а может быть объяснено именно способностью или неспособностью, образующих их нуклеотидных последовательностей, к специфическому взаимодействию с белками ядерной оболочки. Вероятность принадлежности данного фрагмента ДНК к фрагментам ялДНК можно вычислить на основе его первичной последовательности при помощи компьютерной программы ChrClass. Эта программа способна классифицировать фрагменты (области) хромосомной ДНК по их принадлежности к тем или иным «структурным» участкам хромосомной ДНК, предположительно лежащим в основании разных типов петель хроматина: MAR/SAR (Matrix/Scaffold Association Region), ДНК ядерной ламины (ялДНК), ДНК синаптонемного коплекса (скДНК) и ДНК розеткоподобных структур (рсДНК) («структурные» участки хромосомной ДНК) (Glasko et al., 2001). 4
На цитохимическом уровне гетерохроматин представляет собой сложную структуру из ДНК и, связанных с ней и друг с другом, различных белков. Гетерохроматин и эухроматин различаются по белковому составу уже на уровне гистонов. Гистоны гетерохроматина гипоацетилированы у всех эукариот (Elgin, Grewal, 2003), а лизин или аргинин гистонов Н3 и Н4 в составе гетерохроматина метилированы (Zhimulev, Belyaeva, 2003). К негистоновым белкам гетерохроматина, обеспечивающим подавление его экспрессии, и консервативным у эукариот, относятся HP1, HP2, SU(VAR)3-7, SU(VAR)3-9, PR/SET07 и SuUR. Все эти белки локализуются в хромоцентре политенных хромосом у D. melanogaster, а кодирующие их гены являются модификаторами эффекта положения (Zhimulev, Belyaeva, 2003). Белок HP1 специфически связан с метилированными участками гистона Н3Lys9 и с остальными белками гетерохроматина (Sugimoto et al., 1996, цит по Eissenberg, Elgin, 2000). Белок, кодированный геном SU(VAR)3-7, связан с белком HP1, но также имеет 7 мотивов цинковых пальцев, что предполагает прямые взаимодействия с ДНК (Eissenberg, Elgin, 2000; Zhimulev, Belyaeva, 2003). Белок SU(VAR)3-9 содержит взаимодействующий с ДНК хромодомен и SET-домен. SET-домен обладает метилтрасферазной активностью и является каталитическим центром для реакции метилирования лизина гистонов (Zhimulev, Belyaeva, 2003). Ген, гомологичный гену человека PR/SET07, кодирует гистон-H4-лизин20-метилтрансферазу. Белок SU(VAR)3-9 связан с белками HP1 и SU(VAR)3-7 (Zhimulev, Belyaeva, 2003). Помимо этих белков, белок HP1 связывается и с другими негистоновыми ядерными белками: LBR (ламин-B-рецептором),
Микроклонирование ПЦР-продукта
При изучении особенностей in situ гибридизации микродиссектированного района прикрепления хромосомы XL An. Atroparvus (5ab) на хромосомы изучаемых видов Anopheles были обнаружены последовательности ДНК, гомологичные последовательностям характерным для районов прикрепления других хромосом вида An. atroparvus и хромосом, близкородственных ему видов An. messeae и An. beklemishevi (Артемов, 2009).
У трех изучаемых видов различается характер прикрепления хромосомы 2. Так, у An. beklemishevi хромосома 2 в области прицентромерного гетерохроматина образует облигатный контакт с оболочкой ядра, у An. messeae хромосома вообще не образует контактов с ядерной оболочкой, а у An. atroparvus обнаруживается внутривидовая изменчивость морфологии данного района, с образованием факультативных 8 связей хромосома – ядерная оболочка. Исходя из этих различий, можно предположить, что расположение хромосом в ядре и их взаимоотношение с ядерной оболочкой не определяется универсальными последовательностями, так как не все области прикрепления имеют одинаковую Особенности локализации ДНК района прикрепления хромосомы 2L An. beklemishevi (Abekl2L) на хромосомах видов D. melanogaster, D. erecta, D. teissieri
Среди Drosophila подгруппы melanogaster так же, как и у видов Anopheles есть виды, которые имеют разные морфологические типы организации хромосом по отношению к ядерной оболочке в пространстве ядер трофоцитов (Стегний, 1993)
Представлялось интересным выяснить, имеют ли политенные хромосомы трофоцитов близкородственных видов Drosophila подгруппы melanogaster последовательности ДНК, гомологичные последовательностям из района прикрепления 2L к оболочке ядра An. beklemishevi, а также определить локализацию этих последовательностей. У D. melanogaster хромосомы разобщены и прицентромерным контактируют с оболочкой ядра, у D. erecta хромосомы, объединенные в диффузный хромоцентр, не прикрепляются к ядерной оболоке. У D. teissieri хромосомы, визуально необъединены в хромоцентр, плечи хромосом 2 и 3 не разобщены, объединены гетерохроматиновым блоком и не контактируют с облочкой ядра (Стегний, 1993). В связи с этим, представлялось интересным выяснить распределение районоспецифичной ДНК из прицентромерного района хромосомного плеча 2L An. beklemishevi на политенных хромосомах трофоцитов данных видов. Была проведена флуоресцент9н ая in situ гибридизация ДНК из прицентромерного района хромосомного плеча 2L An. beklemishevi с политенными хромосомами трофоцитов D. melanogaster, D. erecta, Drosophila teissieri Tsacas. В результате, у всех трех видов были обнаружены последовательности, гомологичные последовательностям районоспецифичной ДНК из хромосомного плеча 2L An. beklemishevi, которые локализовались в прицентромерных районах хромосом. Так у D. melanogaster пометились прицентромерные районы всех хромосом (рисунок 11). Интенсивность сигнала в прицентромерном районе хромосомного плеча 3R была значительно ниже, чем в прицентромерном районе хромосомного плеча 3L (рисунок 11). Интенсивность сигнала в прицентромерном районе хромосомного плеча 2L заметно не отличалась от таковой в 2R (рисунок 11).
Примечание – 2L, 2R, 3R, 3L, XL – политенные хромосомы; с – центромерные районы; масштабная шкала 5 m. У D. erecta после0д овательности, гомологичные последовательностям районоспецифичной ДНК Abekl2L, были обнаружены в прицентромерных районах хромосомы 3 и в прицентромерном районе одного из плеч хромосомы 2 (рисунок 12). Прицентромерные районы хромосомного плеча XL и одного из плеч хромосомы 2 не имеют последовательностей ДНК, гомологичных последовательностям районоспецифичной ДНК An. beklemishevi (рисунок 12).
Особенности локализации ДНК района прикрепления хромосомы 2L An. beklemishevi (Abekl2L) на хромосомах видов D. melanogaster, D. erecta, D. teissieri
Компьютерная программа ChromomerClass способна классифицировать фрагменты (области) хромосомной ДНК по их принадлежности к тем или иным «структурным» участкам хромосомной ДНК, предположительно лежащим в основании разных типов петель хроматина: MAR/SAR (Matrix/Scaffold Association Region), ДНК ядерной ламины (ялДНК), ДНК синаптонемного коплекса (скДНК) и ДНК розеткоподобных структур (рсДНК) («структурные» участки хромосомной ДНК) (Glasko et al., 2001). Районы прикрепления хромосом к ядерной оболочке по определению должны входить в класс особых хромосомных участков - MAR/SAR (Gasser, Laemmli, 1987). Так как фрагменты ДНК библиотеки Abekl2L принадлежат к РП хромосом к ядерной оболочке, было интересно выявить отношение фрагментов к различным классам «структурных» участков хромосомной ДНК (Таблица 7, 8).
Ранее было установлено, что порядка 80 – 90 % изученных фрагментов ДНК минибиблиотеки из района прицентромерного гетерохроматина (РП) хромосомы 2R An. atroparvus, и РП хромосомы и XL An. messeae классифицируются как те или иные «структурные» участки хромосом. У An. atroparvus в большем количестве представлены последовательности ДНК, относящиеся к скДНК – 59 %, однако, выявляются и последовательности ДНК, относящиеся к ялДНК – 7%, к MAR/SAR относится 14% фрагментов (Грушко и др., 2004).
Таким образом, несмотря на отсутствие прочного крепления изучаемого района прицентромерного гетерохроматина к оболочке ядра в трофоцитах яичников у An. atroparvus, в его составе присутствуют потенциальные «структурные» участки хромосом. Следовательно, одного наличия подобных последовательностей ДНК ещ недостаточно для формирования прочной связи хромосомы с ядерной оболочкой. У An. messeae 19% фрагментов относятся к MAR/SAR, 21% – к ялДНК, 16% – скДНК и 37 % – срДНК (Артемов, неопубликованные данные). При анализе последовательностей библиотеки Abekl2L на принадлежность к «структурным» участкам хромосом, с помощью программы ChrClass было выяснено, что ими обладают 90 % исследуемых фрагментов, из них 37 % относятся к MAR/SAR, 28 % – к ялДНК,
Таким образом, РП трех видов малярийных комаров отличаются по представленности различных классов «структурных» участков хромосом. У An. beklemishevi наиболее представлен класс MAR/SAR – 37 %, у An. atroparvus скДНК – 59 %, у An. messeae срДНК – 37 %, к тому же участок РП хромосомы 2 R An. atroparvus эволюционно исходного вида отличается по морфологи взаимодействия с ядерной оболочкой (не имеет прочного крепления) от РП хромосомы 2L вида An. beklemishevi и РП хромосомы и XL An. messeae, имеющих «жесткое» крепление к ядерной оболочке. Что может говорить о взаимосвязи между морфологическим типом отношения хромосом к ядерной оболочке и паттерном нуклеотидных последовательностей РП. В настоящей работе установлено, что ДНК района прикрепления хромосомы 2L An. beklemishevi к ядерной оболочке имеет гетерохроматиновую природу, так как содержит последовательности, характерные для прицентромерного гетерохроматина отряда Diptera. Об этом свидетельствуют результаты поиска гомологии с использованием компьютерных баз геномов Diptera. Гомологичные последовательности фрагментов ДНК района прикрепления хромосомы 2L An. beklemishevi к ядерной оболочке были найдены с геномом An. gambiae, Ae. aegypti, и D. melanogaster.
В ДНК района прикрепления хромосомы 2L An. beklemishevi методом биоинформатики были обнаружены мобильные элементы, тандемные и сателлитные повторы, а также последовательности, гомологичные фрагментам генов D. melanogaster. Все последовательности не являются районами прикрепления в геномах An. gambiae, Ae. aegypti и D. melanogaster.
Показано, что состав ДНК РП к ядерной оболочке хромосомы 2L An. beklemishevi характеризуется частичным сходством с составом ДНК РП всех районов прикрепления хромосом у An. atroparvus, An. messeae, и района прикрепления хромосомы XL у An. messeae. В результате нельзя сказать, что РП к ядерной оболочке хромосомы 2L An. beklemishevi и РП хромосомы XL An. messeae обладают какими-то уникальными последовательностями, которые обеспечивают характерный морфологический тип организации хромосом по отношению к ядерной оболочке – «жесткое» прикрепление хромосомы к оболочке ядра. Кроме того гомологичные последовательности фрагментов РП хромосомы 2L An. beklemishevi были найдены в геномах других Diptera но они не являются РП этих видов. Тем не менее, молекулярный состав ДНК района прикрепления хромосомы 2L обнаруживает лишь единичные случаи гомологии при сравнении последовательности минибиблиотек из прицентромерного района хромосомы 2R An. atroparvus, района прикрепления 2b-c хромосомы An. messeae и хромосомы 2L An. beklemishevi. Это, видимо, связано с особенностями взаимодействия хромосом с ядерной оболочкой. Интересно, что РП к ядерной оболочке хромосомы 2L An. beklemishevi обнаружил сходство со всеми прицентромерными участками хромосом трех видов Drosophila подгруппы melanogaster с различным морфологическим типом организации хромосом по отношению к ядерной оболочке D. melanogaster, D. erecta, D. Teissieri. Но необходимо отметить, что у D. melanogaster был выявлен наиболее интенсивный сигнал in-situ гибридмзации. Что может быть обусловлено как высокой копийностью (представленностью) гомологичных последовательностей, так и наличием большего количества гомологичных последовательностей в библиотеке Abekl2L с РП хромосом D. melanogaster, или же – и тем и другим. При анализе последовательностей библиотеки Abekl2L на принадлежность к «структурным» участкам хромосом, с помощью программы ChrClass было выяснено, что к ним относятся 90 % исследуемых фрагментов, из них 37 % –MAR/SAR, 28 % – к ялДНК, 22 % – скДНК, 13 % – срДНК. Интересно, что при сравнении по этому же критерию участков ПГ 2R An. atroparvus, и РП хромосомы и XL An. messeae классифицируются как те или иные «структурные» участки хромосом так же 80-90 % исследуемых фрагментов. Однако представленность разных типов «структурных» участков хромосом в РП у всех трех видов различна. Это можно обьяснить как тем, что исследуемые РП относятся к разным видам комаров, так и тем, что они принадлежат к разным хромосомам. Таким образом, расположение хромосом в ядре и их взаимоотношение с ядерной оболочкой не определяется универсальными последовательностями ДНК в РП. Но возможно определяется сложными сочетаниями определенного числа копий определенных нуклеотидных последовательностей или композициями нуклеотидных последовательностей РП.
