Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 13
1.1. Гетерохроматин как феномен биологии эукариот 13
1.2. Малярийные комары рода Anopheles как объект эволюционных исследований
1.3. Гетерохроматин политенных хромосом 17
1.4. Гетерохроматин политенных хромосом малярийных комаров комплекса Anopheles maculipennis
1.5. Молекулярный состав гетерохроматина 23
1.5.1. Белки 23
1.5.2. Первичные последовательности ДНК гетерохроматина 27
1.5.3. Композиция последовательностей ДНК в гетерохроматине 36
1.6. Гетерохроматин и пространственная организация интерфазного ядра 38
ГЛАВА 2. Материалы и методы 48
2.1. Получение биологического материала 48
2.2. Приготовление препаратов политенных хромосом 48
2.3. Микродиссекция и ПЦР с частично вырожденным праймером 49
2.4. Клонирование амплифицированных фрагментов ДНК 50
2.5. In situ гибридизация 51
51
53
2.5.1. Флуоресцентная in situ гибридизация с политенными хромосомами трофоцитов комаров
2.5.2. In situ гибридизация клона А,20р1.4 на хромосомы слюнных желёз дрозофил
58
2.6. Выделение геномных ДНК 55
2.7. Саузерн-блот-гибридизация с мечеными геномными ДНК 55
2.8. Саузерн-блот-гибридизация клона Atr2R-73 56
2.9. Секвенирование и анализ последовательностей ДНК in silico 56
ГЛАВА 3. Результаты 58
3.1. Клонирование и получение районоспецифичной пробы ДНК прицентромерного гетерохроматина правого плеча хромосомы atroparvus методом микродиссекции
3.2. Анализ состава ДНК диффузного прицентромерного гетерохроматина правого плеча хромосомы 2 A. atroparvus
3.2.1. Анализ фрагментов на наличие гомологии друг с другом 60
3.2.2. Анализ фрагментов библиотеки Atr2R на наличие внутренних тандемных повторов
3.2.3. Поиск гомологичных последовательностей в различных базах данных
3.2.4. Анализ библиотеки Atr2R на содержание ДНК,
взаимодействующих с различными белковыми структурами ядра с помощью программы "ChrClass"
3.3. Анализ состава районов гетерохроматина в комплексе Anopheles maculipennis с помощью in situ гибридизации районооспецифичной 66 пробы прицентромерного гетерохроматина правого плеча хромосомы A. atroparvus
3.3.1. In situ гибридизация районооспецифичной пробы с политенными хромосомами трофоцитов яичников A. atroparvus
3.3.2. In situ гибридизация районоспецифичной пробы с политенными хромосомами трофоцитов яичников A. messeae
3.3.3. In situ гибридизация районоспецифичной пробы с политенными хромосомами трофоцитов яичников A. beklemishevi
3.4. Характеристика повторяющихся последовательностей ДНК прицентромерного гетерохроматина комаров комплекса Anopheles maculipennis
3.4.1. Выявление консервативных повторов с помощью Саузерн-блот-гибридизации и характеристика их первичных последовательностей
3.4.2. Хромосомная локализация консервативных повторяющихся последовательностей ДНК у A. atroparvus и A. messeae
3.4.3. Организация повторяющейся ДНК, гомологичной фрагменту Atr2R-73, в геномах комаров комплекса Anopheles maculipennis
3.5. Хромосомная локализация клона А,20р1.4 у видов дрозофил подгруппы melanogaster
ГЛАВА 4. Обсуждение 89
4.1. Применимость метода микродиссекции для клонирования гетерохроматина
4.2. Анализ гомологии последовательностей библиотеки Atr2R с базами данных
4.3. Сравнительный анализ общего состава районов гетерохроматина у комаров комплекса Anopheles maculipennis
4.4. Характеристика повторяющихся последовательностей прицентромерного гетерохроматина комаров комплекса Anopheles 95 maculipennis
4.4.1. Разнообразие повторяющихся последовательностей прицентромерного гетерохроматина
4.4.2. Консервативность повторяющихся последовательностей в комплексе Anopheles maculipennis
4.4.3. Преобразования хромосомной локализации повторяющихся последовательностей ДНК в комплексе Anopheles maculipennis 99
4.5. Молекулярные механизмы прекреплений хромосом к ядерной оболочке
Заключение 102
Выводы 104
Список использованной литературы
- Гетерохроматин как феномен биологии эукариот
- Приготовление препаратов политенных хромосом
- Клонирование и получение районоспецифичной пробы ДНК прицентромерного гетерохроматина правого плеча хромосомы atroparvus методом микродиссекции
- Применимость метода микродиссекции для клонирования гетерохроматина
Введение к работе
Геном эукариот состоит из двух функционально-структурных доменов: эухроматина и гетерохроматина. Насыщенный повторяющимися последовательностями ДНК и обеднённый генами гетерохроматин обеспечивает правильное протекание основных биологических процессов — митоза и мейоза; влияет на процессы генетической рекомбинации; участвует в пространственной организации ядра и в регуляции генной экспрессии. Сильная эволюционная лабильность гетерохроматина на цитологическом и молекулярном уровнях послужила основой предположениям о ключевой роли реорганизации гетерохроматина . при видообразовании. Изменения гетерохроматина в кариотипах касаются его количества, структуры и распределения гетерохроматина на хромосомах. На молекулярном уровне состав образующих гетерохроматин последовательностей ДНК, в особенности - повторяющихся последовательностей, может сильно отличаться не только в пределах рода, но и в популяциях одного вида. У малярийных комаров комплекса Anopheles maculipennis (Culicidae, Diptera) в политенных ядрах трофоцитов яичников был выявлен ещё один аспект эволюционных преобразований гетерохроматина: реорганизация его пространственного положения в ядре клеток зародышевой линии. Вследствие высокой степени политении в трофоцитах яичников, прицентромерные гетерохроматиновые районы хромосом у видов комплекса Anopheles maculipennis не связаны в хромоцентр и хорошо отличимы друг от друга по структуре и характеру контактов с ядерной оболочкой. У восьми видов комплекса Anopheles maculipennis описаны четкие межвидовые различия в силе и характере прикрепления прицентромерного гетерохроматина к ядерной оболочке (Стегний, 1979, 19876; Стегний, Шарахова, 1991). Реорганизация структуры и связей с ядерной оболочкой прицентромерного гетерохроматина политенных хромосом при видообразовании была обнаружена также у плодовых мух (род
7 Drosophild) двух подродов: в подгруппе melanogaster подрода
Sophophora (Стегний, Вассерлауф, 1994), и в группе virilis подрода Drosophila
(Стегний и др., 1996). На основании различий пространственной структуры
гетерохроматина была предложена схема видообразовательных событий в
с видовых комплексах у Anopheles и Drosophila, и сформулирована теория
системных мутаций (Стегний, 19876, 1993), в которой преобразованиям
гетерохроматина, влияющим на пространственную организацию генома,
отводится решающая роль в процессе видообразования. Характер и
направление преобразований гетерохроматина в группах близкородственных
видов в видовых комплексах у Anopheles и Drosophila не случаен и совпадает
с филогенетическими отношениями видов, восстановленными на основании
целого ряда признаков: перекрывания хромосомных инверсий,
гибридологического анализа и биохимического анализа белков (Стегний,
1991). Изучение гетерохроматина в таких группах представляется наиболее
актуальным, поскольку помогло бы реконструировать обстоятельства и,
возможно, даже механизмы видообразовательных событий.
Так как малярийные комары рода Anopheles являются переносчиками различных видов малярийного плазмодия, исследования молекулярных основ видообразования именно в этой группе насекомых актуальны и как теоретическая основа методов контроля распространения малярии, до сих пор занимающей первое место по смертности среди паразитических заболеваний человека (World Health Report, 2003). На примере многих видовых комплексов показано, что даже близкородственные виды Anopheles обладают различной способностью к переносу поражающих человека видов малярийных плазмодиев, различной антропофильностью, различной широтой ареала и численностью, что придает им разную эпидемическую значимость. /Для понимания генетических основ этих явлений необходимы всесторонние исследования межвидовых отличий в организации геномов у видов рода Anopheles.
Дальнейшее изучение феномена реорганизации прицентромерного гетерохроматина при видообразовании видится нам как поиск ответов на
8
следующие вопросы. Какие именно различия на урвне
последовательностей ДНК ответственны за разнообразие структуры
прицентромерного гетерохроматина и характера его прикреплений к ядерной
оболочке у видов комплекса Anopheles maculipennisl Связано ли образование
контактов района прицентромерного гетерохроматина с ядерной оболочкой с
содержанием в нем каких-либо специфических последовательностей ДНК?
Универсальны ли принципы изменений состава прицентромерного
гетерохроматина, влияющих на пространственную организацию генома, при
видообразовании в отряде двукрылых у Anopheles и у Drosophila? Для ответов
на эти вопросы необходима характеристика состава ДНК отдельных районов
прицентромерного гетерохроматина.
Для клонирования и характеристики состава ДНК был выбран район
диффузного Р-гетерохроматина правого плеча хромосомы 2 A. atroparvus
(Рис. 1а), поскольку по структуре этого района и его прикреплению к ядерной
оболочке между видами комплекса Anopheles maculipennis наблюдаются
наиболее яркие различия (Рис. 16), а вид A. atroparvus введен в лабораторную
культуру.
Цель и задачи исследования
Целью данной работы является характеристика состава ДНК прицентромерного гетерохроматина у видов комплекса Anopheles maculipennis и поиск молекулярной основы структурной и пространственной изменчивости прицентромерного гетерохроматина, сопровождающей видообразование. Данная цель предполагает решение следующих задач:
1) методом микродиссекции политенных хромосом, последующей амплификации материала с помощью DOP-ПЦР и клонирования в плазмидном векторе получить районоспецифичную библиотеку ДНК прицентромерного гетерохроматина правого плеча хромосомы 2 A. atroparvus и определить первичную последовательность клонированных фрагментов ДНК;
2) с использованием различных пакетов компьютерных программ
проанализировать первичные последовательности фрагментов
районоспецифичной библиотеки ДНК; выявить и охарактеризовать типичные для гетерохроматина последовательности ДНК — повторы, мобильные элементы и гены; проверить потенциальную способность фрагментов районоспецифичной библиотеки ДНК к взаимодействию с различными белковыми структурами ядра;
3) провести сравнительный анализ общего состава ДНК
прицентромерного гетерохроматина у видов комплекса Anopheles maculipennis
с помощью in situ гибридизации районоспецифичной пробы ДНК
прицентромерного гетерохроматина правого плеча хромосомы 2 A. atroparvus
с политенными хромосомами A. atroparvus, A. messeae и A. beklemishevi;
4) выявить в составе районоспецифичной библиотеки консервативные
повторяющиеся последовательности ДНК с помощью Саузерн-блот-
гибридизации с мечеными геномными ДНК A. atroparvus и A. messeae',
выяснить особенности их, распределения на политенных хромосомах А.
atroparvus и A. messeae с помощью in situ гибридизации и особенности
организации в геномах A. atroparvus, A. messeae и A. beklemishevi с помощью
Саузерн-блот-гибридизации;
5) определить хромосомную локализацию консервативной
повторяющейся последовательности ДНК из диффузного прицентромерного
гетерохроматина Drosophila melanogaster, обеспечивающей связь
гетерохроматина с ядерной оболочкой (клон А20р1.4), у видов комплекса
melanogaster (род Drosophila (Sophophora)) — D. simulans, D. mauritiana и D.
sechellia с помощью in situ гибридизации; сравнить особенности
перераспределения при видообразовании консервативных повторяющихся
последовательностей ДНК, способных к взаимодействию с белковыми
структурами ядра, в видовых комплексах Anopheles maculipennis и Drosophila
melanogaster.
10 Научная новизна
Научная новизна исследования заключается в том, что впервые проведено прямое клонирование и изучение состава ДНК района прицентромерного гетерохроматина у малярийного комара. Анализ первичной последовательности полученных фрагментов ДНК показал, что прицентромарный гетерохроматин правого плеча хромосомы 2 A. atroparvus образован смесью различных повторяющихся ДНК, большинство которых — АТ-богатые, консервативны в комплексе Anopheles maculipennis и потенциально способны к взаимодействию с различными белковыми структурами ядра. В составе исследованного района описаны типичные для конститутивного гетерохроматина классы ДНК — повторяющиеся последовательности ДНК, мобильные элементы и структурные гены.
Оценена эволюционная изменчивость отдельных последовательностей в
составе прицентромерного гетерохроматина. Повторяющиеся
последовательности ДНК консервативны в комплексах близкородственных видов, что было показано в ходе межвидовых in situ и Саузерн-блот-гибридизаций ДНК районоспецифичной пробы и отдельных фрагментов библиотеки прицентромерного гетерохроматина правого плеча хромосомы 2 A. atroparvus в комплексе Anopheles maculipennis, а также — в ходе межвидовых in situ гибридизаций клона А20р1.4 у видов Drosophila комплекса melanogaster. Мобильные элементы и структурные гены консервативны в отряде двукрылых насекомых, что показано в ходе сравнения фрагментов библиотеки ПГХ правого плеча хромосомы 2 A. atroparvus с известными последовательностями из геномов Drosophila melanogaster и Anopheles gambiae.
Впервые продемонстрированы различия районов прицентромерного гетерохроматина разной структуры и отношений к ядерной оболочке у малярийных комаров комплекса Anopheles maculipennis на уровне состава ДНК. В составе каждого исследованного района прицентромерного гетерохроматина были обнаружены хромосомоспецифичные повторяющиеся
последовательности ДНК. Кроме того, обнаружено, что состав каждого района прицентромерного гетерохроматина у малярийных комаров комплекса Anopheles maculipennis уникален по композиции повторяющихся последовательностей ДНК.
Показано, что структура района прицентромерного гетерохроматина и его прикрепление к ядерной оболочке как у Drosophila, так и у Anopheles напрямую не связаны с наличием либо отсутствием в его составе последовательностей ДНК, способных к взаимодействию с белковыми структурами ядра.
Основные результаты получены автором самостоятельно. Микродиссекция и DOP-ПЦР проводились совместно с д.б.н. Н. Б. Рубцовым и к.б.н. Т. В. Карамышевой. Эксперименты по Саузерн-блот-гибридизации и секвенированию - с к.б.н. А. И. Шевченко и к.б.н. М. В. Шараховой. In situ гибридизации проводились при участии к.б.н. И. В. Шарахова и В. А. Тимошевского.
Практическая ценность
Описан состав ДНК гетерохроматина A. atroparvus, и обнаружены
межвидовые и межхромосомные отличия в составе ДНК гетерохроматина у
малярийных комаров комплекса Anopheles maculipennis. Подтверждается
универсальность принципов организации прицентромерного гетерохроматина
у двукрылых насекомых. Полученная библиотека клонов ДНК
гетерохроматина правого плеча хромосомы 2 A. atroparvus является ценным
материалом для дальнейших исследований гетерохроматина у комаров
комплекса Anopheles maculipennis.
Апробация результатов
Результаты исследований были представлены на VI Совещании диптерологов, посвященном 100-летию А. А. Шталькельберга, "Место и роль двукрылых насекомых в экосистемах" (Санкт-Петербург, 1997); на I Международном симпозиуме "Эволюция жизни на Земле"(Томск, 1997); на Международной конференции, посвященной 80-летию со дня рождения академика Д. К. Беляева, "Современные концепции эволюционной генетики", (Новосибирск, 1997); на региональной научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Сибирская школа молодого ученого" (Томск, 1998); на II съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Санкт-Петербург, 2000); на I Международной конференции "Проблема вида и видообразование" (Томск, 2000); на VII Международной конференции по гетерохроматину Drosophila (Губбио, Италия, 2005); на XV Всероссийском симпозиуме по структуре и функциям клеточного ядра (Санкт-Петербург, 2005).
Публикации По теме диссертации опубликовано 10 работ.
Гетерохроматин как феномен биологии эукариот
Хроматин в интерфазных ядрах эукариот пребывает в виде двух фракций — плотного яркоокрашивающегося гетерохроматина и рыхлого слабоокрашивающегося эухроматина (Heitz, 1928; 1934). Гетерохроматин обладает особыми цитологическими, молекулярными и генетическими свойствами, включающими конденсированное состояние на протяжении большей части клеточного цикла (Heitz, 1928), преимущественную локализацию на периферии интерфазного ядра (Paddy et al., 1990; Belmont et al., 1993; Marshall et al., 1996; Carvalho et al., 2001; Sage, Csink, 2003), и репликацию в самом конце S-фазы (Прокофьева-Бельговская, 1986).
Расположение и количество гетерохроматина на митотических хромосомах видоспецифично (Redi et al., 2001). У большинства эукариот, включая все зоологические таксоны, гетерохроматин сконцентрирован в огромные, порядка миллионов пар оснований, блоки, главным образом, в прицентромерных и субтеломерных районах всех хромосом (Redi et al., 2001). Гетерохроматин занимает значительные части геномов, — в частности, около 30% геномов человека и дрозофилы (Gatti, Pimpinelli, 1992; Жимулев, 1993). Ещё первооткрыватель гетерохроматина Э. Хайтц предполагал, что гетерохроматин является генетически инертным (Heitz, 1928). Впоследствии незначительный уровень транскрипции, обеднённость структурными генами и обилие некодирующих повторяющихся последовательностей ДНК стали основой для понимания гетерохроматина как излишней, "мусорной" (англ.: "junk") части генома (Ohno, 1972; цит по: Redi et al., 2001). Действительно, функция повторенных последовательностей не так очевидна по сравнению с последовательностями, кодирующими белки. Однако после того, как стали известны перечисленные ниже факты, эта точка зрения была пересмотрена.
1. Сегрегация генома на богатый генами эухроматин и насыщенный повторами гетерохроматин обнаружена во всех геномах высших эукариот, включая вид рыб Tetraodon nigroviridis с самым маленьким (всего 385 Мб) геномом среди позвоночных животных (Fischer et al., 2004).
2. Прицентромерный гетерохроматин необходим для правильного функционирования центромер (Sullivan et al., 2001), для правильной сегрегации гомологичных хромосом в мейозе (МсКее, Кафеп, 1990; Dernburg et al., 1996; Karpen et al., 1996) и поддержания связи сестринских хроматид в митозе (Moore, Orr-Weaver, 1998; Bernard et al., 2001).
3. Гетерохроматин влияет на процессы генетической рекомбинации. При мейозе он затрудняет кроссинговер, а при митозе, наоборот, способствует неравному соматическому кроссинговеру (Ladygina et al., 1991; Цит по: Gruzdev, 2000).
4. Гетерохроматин влияет на экспрессию генов: инактивирует перенесенные к нему хромосомными перестройками соседние гены, обусловливая мозаичный эффект положения (Muller, 1930; Цит по: John, 1988; Weiler, Wakimoto, 1996; Benedict et al., 2000; Elgin, Workman, 2002). Эффект положения может распространяться от гетерохроматина по эухроматину на огромные генетические расстояния (Жимулёв, 1993), тем самым, вероятно, определяя адаптивный эффект хромосомных инверсий (Стегний, 1984).
5. Гетерохроматин содержит некоторые жизненно важные структурные гены, например, гены рибосомальных РНК и гены фертильности, в частности, Y-связанные факторы фертильности самцов у дрозофил (Gatti, Pimpinelli, 1992; МсКее, Karpen, 1990).
6. Гетерохроматин способствует различным хромосомным перестройкам. Точки разрывов инверсий и робертсоновских слияний хромосом часто картируются в районах прицентромерного и интеркалярного гетерохроматина (Прокофьева- Бельговская, Хвостова, 1939; Pathak et al., 1973; Lee, 1975; Bovero et al., 2002).
7. Связи гетерохроматина с ядерной оболочкой являются основой для пространственного упорядочения отдельных хромосом и интерфазного ядра в целом (Paddy et al., 1990; Belmont et al., 1993; Стегний, 1993; Marshall et al., 1996; Carvalho et al., 2001; Sage, Csink, 2003).
8. Гетерохроматин является "накопителем" различных последовательностей ДНК и источником их изменчивости, что позволяет предположить его важную роль в эволюции генома эукариот (Hennig, 1999).
9. Изменения гетерохроматина в кариотипах сопутствует видообразованию. Изменения касаются состава, количества, структуры, и распределения гетерохроматина на хромосомах (Корочкин, 1983; Стегний, 1991; Кикнадзе и др., 1991).
Таким образом, всестороннее изучение гетерохроматина необходимо для полного понимания структуры и функционирования эукариотического генома. К настоящему моменту достигнут большой прогресс в понимании механизмов генного молчания гетерохроматина и эффекта положения, а также механизмов его компактизации (обзоры Elgin, 1996; Hennig, 1999; Elgin, Grewal, 2003; Zhimulev, Belyaeva, 2003). Однако многие вопросы всё ещё далеки от решения. Среди них - вопрос о роли изменений гетерохроматина при видообразовании и вопрос о значении пространственной организации гетерохроматина для работы интерфазного ядра.
Приготовление препаратов политенных хромосом
Для приготовления воздушно-высушенных препаратов политенных хромосом A. atroparvus, A. messeae и A. beklemishevi использовали яичники, фиксированные в растворе Карнуа (96 % этанол и ледяная уксусная кислота в объемном соотношении 3:1) на стадии активного созревания трофоцитов (Шарахова и др., 1997). Фиксации хранили при —20С. Фрагменты яичников (по 5-6 фолликулов на препарат) помещали на предметное стекло в каплю 50% пропионовой кислоты, мацерировали, накрывали покровным стеклом (18x18мм) и инкубировали 10-15 мин. Затем препарат раздавливали, инкубировали 1 мин при +65 С , охлаждали до комнатной температуры и затем замораживали, погружая на 1-2 мин в жидкий азот. Затем покровное стекло удаляли, а препарат помещали в холодный (-20С) 50% этанол и инкубировали 2 часа при +4С. Затем препарат обезвоживали последовательным инкубированием по 5 минут в 70%, 90% и 100% этаноле при +4С. После этого препарат фиксировали 5 мин при +4С в растворе Карнуа, высушивали на воздухе, промывали в 100% этаноле и снова высушивали на воздухе. Хранили препараты при +25С. Для получения воздушно-высушенных препаратов политенных хромосом Drosophila simulans, Drosophila mauritiana и Drosophila sechellia из личинок выделяли слюнные железы в 45% уксусной кислоте и давили под покровным стеклом в смеси 60% молочной кислоты, воды и ледяной уксусной кислоты, взятых в соотношении 1:2:3. Препараты замораживали, погружая их в жидкий азот на 1-2 мин, затем покровное стекло удаляли, а препарат помещали на 10 мин в 96% этанол. После этого препараты фиксировали 10 мин в растворе Карнуа, высушивали на воздухе и хранили при +25С.
Для получения набора фрагментов ДНК из прицентромерных районов политенных хромосом был использован метод микродиссекции, модифицированный для политенных хромосом (Рубцов и др., 1999). Фрагменты хромосом соскабливали с поверхности воздушно-высушенного препарата, изготовленного на покровном стекле 60x24 мм, силиконизированной стеклянной иглой, управляемой микроманипулятором "MRmot" ("Zeiss", Германия) с помощью инвертированного микроскопа "Axivert 10". Всего было вырезано 14 фрагментов хромосом с трёх препаратов, полученных из яичников одной особи A. atroparvus. Вырезанные фрагменты хромосом погружали в вытянутый конец пипетки Пастера, содержащий Triton Х-100, который затем был обломан в 0,5 мл пробирку.
Затем добавили 3 мкл 0,25х буфера для секвеназы ("Amersham", США), содержащего 0,2% "Tritone Х-100" ("Sigma- Aldrich", США). Смесь пятикратно нагрели до +90С (1 мин) и охладили до +30С (1 мин), а затем инкубировали 18 часов при +60С в присутствии 0,1 мкл протеиназы К (14 мг/мл; Boehringer Mannheim, США). После этого протеиназа К была инактивирована прогреванием смеси при +96С в течение 6 мин. Затем добавили 2 мкл смеси для амплификации ("lx Sequenase Buffer", ("Amersham", Великобритания)); 0,5 мМ dATP, 0,5 мМ dCTP, 0,5 мМ dGTP, 0,5 мМ dTTP ("Boehringer Mannheim", США); 5 пмоль праймера MW6 (5і CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3 ), (Telenius et al., 1992)) и провели 8 циклов ПЦР: 1 мин при +95С, 2 мин при +30С, 2 мин при +37С. По 0,2 мкл полимеразы "Sequenase Т7 DNA polymerase Version 2" ("Amersham", Великобритания) добавляли после каждой денатурации (1 мин при +95С). Затем добавляли ещё 45 мкл смеси для амплификации, и провели дополнительную амплификацию фрагментов ДНК в 33 циклах ПЦР с добавлением 1 мкл термофильной ДНК-полимеразы ("Stoffel fragment AmpliTaq Polymerase", "Perkin Elmer", США) в следующих условиях: 1 мин при +94С, 1 мин при +56С, 2 мин при +72С; 10 мин при +72С после последнего цикла (Rubtsov et al., 1996). После амплификации 5 мкл реакции были проанализированы с помощью электрофореза в 1 % агарозном геле в буфере ТВЕ.
Клонирование и получение районоспецифичной пробы ДНК прицентромерного гетерохроматина правого плеча хромосомы atroparvus методом микродиссекции
Для получения районоспецифичной библиотеки фрагментов ДНК из диффузного прицентромерного гетерохроматина правого плеча хромосомы 2 A. atroparvus (рисунок 2) был применён метод микродиссекции политенных хромосом. Хромосомный материал был использован в качестве ресурса матричной ДНК в полимеразной цепной реакции с частично вырожденным праймером (DOP-ПЦР). В результате получена смесь случайно амплифицированных фрагментов длиной от 100 до 400 п.о. (рисунок 3), фланкированных сайтами рестрикции Xho I. В негативном контроле ДНК не обнаружена.
Рисунок 3 - Электрофорез амплифицированного в ходе DOP-ПЦР материала прицентромерного гетерохроматина правого плеча хромосомы 2 А. atroparvus в 1 % агарозном геле. 1 - маркер "1 Kb Plus DNA Ladder"; 2 - DOP-ПЦР-продукт; 3 - негативный контроль.
Далее этот материал был частично клонирован в плазмидном векторе для получения отдельных клонов ДНК, а частично - помечен биотином в дополнительных циклах ПЦР и использован в качестве районоспецифичной пробы для внутривидовой и межвидовой in situ гибридизации с политенными хромосомами трофоцитов яичников. В результате клонирования было получено 152 плазмидных клона. Затем плазмидные клоны были проверены на наличие встроек рекомбинантных фрагментов ДНК с помощью переваривания плазмидной ДНК рестриктазой Xho I и электрофорезе в агарозном геле (рисунок 4). Обнаружено, что часть клонов несёт более одной Xho І-встройки, что, скорее всего, является следствием образования химерных фрагментов в ходе DOP-ПЦР либо следствием "сшивки" двух или более фрагментов в ходе реакции лигирования с вектором. Поэтому множественные встройки считались как отдельные фрагменты ДНК прицентромерного гетерохроматина хромосомы 2. Для проведения in situ гибридизаций фрагменты Atr2R-46a, Atr2R-85a, и Atr2R-25a были переклонированы.
Первичная последовательность была определена у ста двух (102) клонированных фрагментов длиной от 32 до 549 п. о. (приложение 1). Общая длина просеквенированных фрагментов составила более 23 000 п. о. Первичные последовательности библиотеки были опубликованы в базе данных "GenBank" (Режим доступа: http://www.ncbi.nlm.nih.gov; индексы доступа с DQ072281 по DQ072378). Далее последовательности фрагментов библиотеки были подвергнуты анализам с помощью различных пакетов компьютерных программ.
Была создана база данных "Atr2R", и затем каждый фрагмент был проверен на наличие гомологии со всеми последовательностями базы данных с помощью программы "Blast2seq". На основе взаимной гомологии фрагменты библиотеки группировались в 17 пар, 2 тройки и одну группу из одиннадцати последовательностей (приложение 2).
Короткие тандемные повторы могут по протяжённости занимать огромную часть хромосом и гетерохроматина. Поэтому все последовательности библиотеки были проанализированы на наличие тандемных повторов с помощью программы "Tandem Repeats Finder". 2 мономера тандемного повтора длиной 43 п. о. было выявлено в составе фрагмента Atr2R-57ab (451 п.о.) (приложение 3). Мономеры повтора отличаются в пяти позициях (рисунок 5).
Клонированные фрагменты были проверены на наличие гомологии к последовательностям из геномов Anopheles gambiae ("Ensembl BLAST Server" и "NCBI / BLAST search A. gambiae genome") и Drosophila melanogaster ("Drosophila Genome Projects Blast Searches" и "NCBI/BLAST search D. melanogaster genome"). Поиск в базах данных показал, что пять клонированных фрагментов (Atr2R-6, Atr2R-50a, Atr2R-53, Atr2R-71a, Atr2R-107) имеют значимые гомологии к последовательностям из генома A. gambiae, а четыре из них (Atr2R-6, Atr2R-50a, Atr2R-53, Atr2R-71a) - также к последовательностям из генома D. melanogaster. Результаты поиска в базах данных Anopheles gambiae и Drosophila melanogaster суммированы в таблице 1 и в приложениях 4—7.
У фрагментов Atr2R-6 и Atr2R-71a обнаружены значимые гомологии к транскриптам генов A. gambiae и D. melanogaster. Фрагмент Atr2R-6 гомологичен предсказанному уникальному гену ENSANGG00000018197 А. gambiae, находящемуся в районе 20С левого плеча хромосомы . 2 (2L) (скэффолд АААВО1008968). Ортологом гена ENSANGG00000018197 является ген extradenticle D. melanogaster, также гомологичный фрагменту Atr2R-6. У D. melanogaster ген extradenticle локализован на хромосоме X и кодирует гомеобокс-содержащий фактор транскрипции CG8933, участвующий в регуляции развития нотума {anterior mesothorax) (Aldaz et al., 2005). Мутации этого гена приводят к нарушениям развития сегментов и сегментации как таковой (Peifer, Wieschaus, 1990). Фрагмент Atr2R-71a гомологичен гену ENSANGGO0OOO018993 A. gambiae. Ген ENSANGG00000018993 A. gambiae ортологичен гену CG17255 D. melanogaster, также гомологичному фрагменту Atr2R-71a. Ген CG17255 D. melanogaster локализован в X хромосоме, молекулярная функция кодируемого им белка неизвестна. Таким образом, выяснилось, что последовательности фрагментов Atr2R-6 и Atr2R-71a являются кодирующими. Поэтому для сравнения уровней гомологии было необходимо провести выравнивание кодированных ими аминокислотных последовательностей и аминокислотных последовательностей белков А. gambiae и D. melanogaster. Как и при сравнении нуклеотидных последовательностей, аминокислотные последовательности транскриптов фрагментов Atr2R-6 и Atr2R-71a оказались ближе к белкам A. gambiae, чем белкам D. melanogaster. Результаты этого анализа представлены в приложении 5.
Сравнение последовательностей библиотеки Atr2R с базой данных известных повторов всех организмов "RepBase" с помощью программы "RepeatMasker" также показало сходство фрагментов Atr2R-53 и Atr2R-50a с LTR-ретротранспозонами Drosophila gypsy-тшіа, соответственно, ZAM_I и MDG3 (приложение 6). Сходства последовательностей библиотеки Atr2R с какими-либо другими повторяющимися последовательностями не обнаружено.
Применимость метода микродиссекции для клонирования гетерохроматина
Поиск последовательностей, гомологичных фрагментам библиотеки Atr2R, выявил ряд значимых гомологии с последовательностями из геномов A. gambiae и D. melanogaster и отсутствие гомологии с последовательностями каких-либо других организмов. Интересно, что последовательности, гомологичные фрагментам Atr2R-6 и Atr2R-107, в геноме A. gambiae уникальны и расположены в одном районе — 20С, на левом плече хромосомы 2. Район 20A-D представляет собой небольшой эухроматиновый участок, ограниченный с одной стороны интеркалярным диффузным гетерохроматином левого плеча (район 21 А) и диффузным прицентромерным гетерохроматином. При этом последовательности, гомологичные фрагментам Atr2R-6 и Atr2R-107 являются уникальными в геноме A. gambiae. Это даёт достаточные основания для утверждения, что клонированный нами участок диффузного прицентромерного гетерохроматина хромосомы 2 A. atroparvus гомеологичен району эухроматина A. gambiae 20С. В свою очередь это интересно тем, что в этом же районе 20С, а точнее, между последовательностями, гомологичными фрагментам Atr2R-6 (скэффолд АААВ01008968 район 84) и Atr2R-107 (скэффолд АААВ01008968 район 65) у A. gambiae картируется ген Kdr (скэффолд АААВО 1008968 район 83), мутации в котором приводят к устойчивости к применяемым против комаров инсектицидам, ДДТ и пиретроидам (Ranson et al., 2000). Более сильное сходство фрагментов Atr2R-50a и Atr2R-53 ретротранспозонами A. gambiae, чем с ретротранспозонами D. melanogaster, а фрагментов Atr2R-6 и Atr2R-71a - с генами A. gambiae, чем с генами D. melanogaster, указывает на то, что клонированные фрагменты действительно принадлежат геному малярийного комара. Поскольку гомологии фрагментов с последовательностями A. gambiae не абсолютны, а случайное клонирование фрагмента нового неизвестного мобильного элемента или гена A. gambiae в данном случае исключается, можно с уверенностью сказать, что фрагменты Atr2R 5Qa и Atr2R-53 являются "осколками" grp-yy-подобных LTR ретротранспозонов, а фрагменты Atr2R-6 и Atr2R-71a - генов из генома А. atroparvus. Таким образом, гомологии фрагментов библиотеки Atr2R с ретротранспозонами и генами A. gambiae отражают присутствие этих классов последовательностей в прицентромерном гетерохроматине хромосомы 2 А. atroparvus.
Прицентромерный гетерохроматин многих организмов, от дрозофилы до человека, является местом "массового скопления" мобильных элементов (Anaviev et al., 1998). У A. gambiae среди всех мобильных элементов обнаружено преобладание ретротранспозонов (Ти, Coates, 2003). В ходе секвенирования генома A. gambiae было установлено высокое содержание мобильных элементов, в особенности — ретротранспозонов, в прицентромерном гетерохроматине политенных хромосом (Holt et al., 2002). Поэтому обнаружение гомологии фрагментов Atr2R-50a и Atr2R-53 с мобильными элементами D. melanogaster и A. gambiae не было неожиданностью. Более того, обнаружение этих последовательностей в составе гетерохроматина A. atroparvus лишний раз указывает на успешность предпринятой попытки клонирования гетерохроматина. Интересно, что gypsy-подобные ретротранспозоны содержат инсуляторные последовательности, по молекулярным свойствам являющиеся M/SAR ДНК и ялДНК (Nabirochkin et al., 1998; Gerasimova et al., 2000). Как уже отмечалось, последовательности инсулятора gypsy вызывают в интерфазном ядре у D. melanogaster прикрепление сайтов даже единичных инсерций к ядерной оболочке. Возможно, обилие gypsy-подобных ретротранспозонов обусловливает способность гетерохроматина политенных хромосом прикрепляться к ядерной оболочке. У содержащих эти элементы в прицентромерном гетерохроматине видов D. melanogaster и A. gambiae политенные хромосомы питающих клеток яичников образуют прочные контакты с ядерной оболочкой, - независимые для каждой хромосомы у D. melanogaster (Стегний, Вассерлауф, 1994) и в составе хромоцентра у А. gambiae (Sharakhov et al., 2001). Возможно, что способность района прицентромерного гетерохроматина крепиться к оболочке зависит от присутствия в нём в достаточном количестве встроек gypsy-подобных LTR ретротранспозонов, содержащих инсуляторные последовательности, по молекулярным свойствам являющиеся M/SAR ДНК и ялДНК. В этом случае амплификации и перемещения мобильных элементов могут быть одной из причин реорганизации прикреплений прицентромерных гетерохроматиновых районов политенных хромосом к ядерной оболочке. Кроме того, мобильные элементы могут влиять на реорганизацию связей хромосом и ядерной оболочки посредством случайной амплификации и перемещений граничащих с ними ДНК ядерных белковых структур. Описаны факты перемещения мобильного элемента copia (5 т.п.н.) в составе крупных транспозонов (Gehring, Раго, 1980; цит. по.: Балакирева и др., 1985). Многими исследователями действие мобильных элементов рассматривается как движущая сила преобразований гетерохроматина (Корочкин, 1983; Leibovitch, 2001). В данной работе эти предположения находят ещё одно косвенное подтверждение. Характер распределения клона Х20р1.4 по районам хромосомных плеч у линий и видов дрозофил - наличие общего сайта локализации клона А20р1.4 у разных видов и отсутствие - у некоторых линий одного вида - ясно напоминает картину перемещения мобильных элементов, которые могут как непосредственно перемещаться из одного сайта в другой, так и, сохраняя исходный сайт локализации, перемещаться в виде копий. Поскольку клон А,20р1.4 не проявил значимой гомологии к известным мобильным элементам (Шарахов и др., 1997а, Богачёв и др., 1996), за его транспозиции в природных популяциях у D. simulans, вероятно, ответственны соседствующие с ним в прицентромерном гетерохроматине мобильные элементы.
Похожие диссертации на Молекулярно-цитогенетическая характеристика прицентромерного гетерохроматина малярийных комаров комплекса Anopheles Maculipennis (Culicidae, Diptera)
