Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 13
1.1. Существование двух форм Culex pipiens pipiens 13
1.1.1. История открытия двух форм Culex pipiens pipiens 13
1.1.2. Основные биологические и экологические признаки С. p. pipiens и С. p. molestus 15
1.1.2.1. Автогенность - неавтогенность 15
1.1.2.2. Стеногамность - эвригамность 18
1.1.2.3. Гомодинамность - гетеродинамность 19
1.1.2.4. Прокормители 20
1.1.2.5. Местообитания 20
1.1.3. Гибридизация между С. p. pipiens и С. p. molestus 21
1.1.4. Таксономический статус С. p. pipiens и С. p. molestus . 27
1.2. Culex torrentium 32
1.3. Молекулярные методы популяционной генетики, систематики и филогении 34
1.3.1. Изоферментный анализ 34
1.3.2. Иммунологический анализ 36
1.3.3. ДНК-ДНК гибридизация 36
1.3.4. RFLP-анализ 36
1.3.5. Секвенирование 37
1.3.6. RAPD-анализ 38
1.4. Объекты молекулярной систематики и филогении 42
1.4.1. Митохондриальная ДНК 42
1.4.2. Рибосомальная ДНК 44
2. Материал и методы 48
2.1. Материал 48
2.2. Методы 48
2.2.1. Выделение ДНК 48
2.2.2. RAPD-ПЦР 48
2.2.3. Поиск специфичных RAPD - фрагментов 54
2.2.4. Клонирование и секвенирование специфичных RAPD - фрагментов 55
2.2.5. SCAR-ПЦР 55
2.2.6. Рестрикционный анализ участка митохондриального гена субъединицы I цитохромоксидазы с 56
2.2.7. Амплификация ITS2 регионов рибосомальной ДНК . 58
2.2.8. Амплификация второго интрона гена ацетилхолинэстеразы 2 59
2.2.9. Секвенирование участка митохондриального гена субъединицы I цитохромоксидазы с и второго интрона гена ацетилхолинэстеразы 2 59
2.2.10. RAPD-полиморфизм 60
3. Результаты 61
3.1. Молекулярно - генетические маркеры для идентификации представителей комплекса Cidex pipiens 61
3.1.1. RAPD - маркеры 61
3.1.2. SCAR-маркеры 64
3.1.3. ITS2 регионы рибосомальной ДНК 68
3.1.4. Участок гена субъединицы I цитохромоксидазы с 71
3.1.5. Второй интрон гена ацетилхолинэстеразы 2 74
3.2. Полиморфизм RAPD - маркеров в природных популяциях С. p. pipiens, С. p. molestus, С. torrentium 74
4. Обсуждение CLASS 85
4.1. Использование молекулярно - генетических маркеров для идентификации представителей комплекса Culex pipiens 85
4.1.1. RAPD-маркеры 85
4.1.2. SCAR-маркеры 86
4.1.3. ITS2 регионы рибосомальной ДНК 86
4.1.4. Участок гена субъединицы I цитохромоксидазы с 88
4.1.5. Второй интрон гена ацетилхолинэстеразы 2 89
4.2. Генетическая дифференциация популяций С. p. pipiens, С. p. molestus и С. torrentium умеренных широт 91
4.3. Распространение С. torrentium и С. p. pipiens на территории Томской области и Республики Казахстан 97
Выводы 101
Литература
- Существование двух форм Culex pipiens pipiens
- Поиск специфичных RAPD - фрагментов
- Молекулярно - генетические маркеры для идентификации представителей комплекса Cidex pipiens
- Использование молекулярно - генетических маркеров для идентификации представителей комплекса Culex pipiens
Введение к работе
Актуальность темы
Комары комплекса Culex pipiens (Diptera: Culicidae) представляют большой научный и практический интерес. Они являются активными кровососами людей (особенно на урбанизированных территориях) и известны как переносчики возбудителей ряда опасных заболеваний человека. Высокая экологическая пластичность, сложная таксономическая структура и характер взаимоотношений между членами комплекса привлекают постоянное внимание исследователей. Представление о составе комплекса Culex pipiens и таксономическом ранге его членов на протяжении длительного периода его изучения менялись, до сих пор единого мнения по этому вопросу не достигнуто (Виноградова, 1997).
Culex pipiens L., 1758 - северный обыкновенный комар, включает в себя две формы или экотипа, pipiens и molestus, для которых характерно симпатрическое распространение, небольшие морфологические и значительные биологические отличия (Виноградова, 1961, 1997; Лопатин, 2000). Единственным достоверным морфологическим признаком, позволяющим идентифицировать pipiens и molestus, является величина сифоналыюго индекса личинок. В то же время, различия в биологии настолько очевидны, что некоторые авторы рассматривают автогенную форму в качестве самостоятельного вида С. molestus Forskal, 1775 (Miles, 1977; Knight, 1978), другие, напротив, считают pipiens и molestus формами одного вида, а отличия между ними - только физиологической изменчивостью (Harbach, Harrison, Gad, 1984; Виноградова, 1997), а третьи -подвидами или полувидами (Bullini, 1982; Лопатин, 2000).
Culex torrentium Martini, 1924 считается видом - двойником Culex pipiens, литературные сведения о нем фрагментарны, не определены и границы ареала (Natvig, 1948; Mattingly, 1951а; Service, 1968; Jupp, 1979; Gillies, Gubbins, 1982; Dahl, 1988). Морфологически С. torrentium и С. p. pipiens близки, распространение симпатричное. В биологическом отношении С. torrentium также похож на С. p. pipiens — неавтогенный, эвригамный и гетеродинамный комар (Dahl, 1988; Виноградова, 1997). По личинкам виды не различимы, определение ведется только по самцам, диагностическое значение имеют особенности строения гипопигия (Виноградова, 1997).
Исследования представителей рода Culex приобрели особое значение в связи с возникновением трех крупных эпидемий западнонильской лихорадки (West Nile virus) в урбанизированных районах на юге Румынии (Tsai, Popovici, Cernescu et al., 1998), в дельте Волги в России (Lvov, Butenko, Gromashevsky et al., 2000; Platonov, Shipulin, Shipulina et al., 2001) и на северо - востоке США (Lanciotti, Roehrig, Deubel et al., 1999) в 1996 - 1999 гг. Основным признаком, объединяющим эти эпидемии, явилось вовлечение Culex pipiens в передачу возбудителя заболевания (Hayes, 2001).
Надежная и быстрая идентификация комаров необходима для дифференцировки форм и лучшего понимания их потенциальной роли в передаче возбудителей заболеваний, а также для разработки эффективных мер контроля. Кроме того, возможность точной идентификации видов или подвидов позволяет изучить другие аспекты биологии, например, особенности личиночной экологии, брачного поведения, устойчивости к инсектицидам (Walton, Sharpe, Pritchard et al., 1999; Kengne, Trung, Baimai et al., 2001; Manguin, Kengne, Sonnier et al., 2002). Важное значение имеет идентификация гибридных особей, т.к. вывод о таксономическом статусе организмов должен базироваться на данных, касающихся природной гибридизации. Морфологические признаки, особенно, если они носят количественный характер, не всегда удобно использовать для этих целей, т.к. часто они подвержены индивидуальной, географической, комбинативной и модификационной изменчивости. Для облегчения идентификации криптических видов комаров широко применяются разнообразные молекулярно - генетические методы в дополнение к традиционным морфологическим (Wilkerson, Parsons, Albright et al., 1993). ДНК - маркеры можно использовать для идентификации организма на любой стадии развития; эти маркеры не подвержены изменчивости, вызванной действием факторов окружающей среды (Ноу, 1994; Walton, Sharpe, Pritchard et al., 1999), что позволяет избежать недостатков, присущих морфометрическим признакам. Кроме того, молекулярные маркеры используются при проведении популяционно - генетических и филогенетических исследований.
Цели и задачи исследования
Цель данной работы заключалась в поиске молекулярно - генетических маркеров для идентификации представителей комплекса Culex pipiens и оценке внутри - и межвидовой изменчивости Culex torrentium, С. pipiens pipiens, С. p. molestus. Для достижения поставленной цели требовалось выполнить следующие задачи: 1) провести анализ спектров амплифицированных RAPD - фрагментов ДНК для выявления мономорфных специфичных последовательностей ДНК; 2) определить нуклеотидные последовательности специфичных RAPD - фрагментов ДНК для создания SCAR - праймеров; 3) проверить диагностическую ценность молекулярно -генетических маркеров, предложенных другими авторами для идентификации представителей комплекса Culex pipiens; 4) провести секвенирование и сравнение последовательностей второго интрона гена ацетилхолинэстеразы 2 и участка митохондриального гена субъединицы I цитохромоксидазы с у особей С. p. pipiens и С. p. molestus с целью выявления различий, пригодных для получения молекулярно - генетических маркеров; 5) оценить внутри - и межвидовую изменчивость и дивергенцию RAPD -маркеров у членов комплекса Culex pipiens.
Научная новизна
Впервые были найдены специфичные RAPD - маркеры для идентификации С. torrentium. Определение нуклеотидной последовательности RAPD - фрагментов позволило создать специфичные SCAR - праймеры. ПЦР с использованием SCAR - праймеров является простым, быстрым и надежным методом идентификации С. torrentium. В ходе работы также была изучена диагностическая ценность маркеров, предложенных другими авторами для идентификации С. p. molestus и С. torrentium (Виноградова, Шайкевич, 2005), С. p. pipiens и С. torrentium (Smith, Fonseca, 2004). Показано, что эти маркеры позволяют идентифицировать особей С. torrentium, в то время как, С. p. pipiens и С. p. molestus идентичны по этим маркерам. Выявлено соответствие результатов при использовании различных типов молекулярно - генетических маркеров. Впервые предложен способ идентификации гибридных особей от скрещивания С. torrentium и С. p. molestus.
Проведен анализ изменчивости RAPD - маркеров в популяциях С. р. pipiens, С. p. molestus и С. torrentium из г. Томска, Томской области и Республики Казахстан. Полученные результаты позволили сделать вывод о генетической дифференциации С. torrentium, С. p. pipiens и С. p. molestus и об отсутствии природной гибридизации между ними в районе проведенных исследований. Кроме того, показано, что в открытых личиночных биотопах (Томская область и Республика Казахстан) доминантным видом является С. torrentium , личинки С. p. pipiens встречаются с небольшой частотой.
Практическая ценность работы
Молекулярно - генетические маркеры, рассмотренные в настоящей работе, можно использовать в любых исследованиях, где необходима надежная идентификация С. torrentium и С. p. pipiens, в частности, при изучении устойчивости к инсектицидам, путей передачи возбудителей заболеваний, при разработке новых методов контроля за численностью переносчиков, для анализа гибридогенеза, а также, в популяционно -генетических, таксономических, филогенетических и фаунистических исследованиях. Принципы поиска и создания специфичных маркеров (RAPD- и SCAR - маркеры), изложенные в диссертации, можно применять для получения диагностических маркеров практически для любого организма.
Апробация результатов работы
Результаты исследований были представлены на II Международной конференции «Проблема вида и видообразования», Томск (2001); на III Съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров, Москва (2004); на III Международной конференции «Проблема вида и видообразования», Томск (2004).
Публикации
По теме диссертации опубликовано шесть работ.
Благодарности
Прежде всего я хотела бы выразить глубокую признательность научному руководителю, заведующему лабораторией эволюционной цитогенетики НИИ ББ при ТГУ, д.б.н., профессору В.Н. Стегнию за предоставленную возможность работы над интересной темой, общее руководство и помощь на всех этапах работы над диссертацией. Также, я искренне благодарна к.б.н. Сибатаеву А.К. за предоставление части материала, определение комаров, всестороннюю помощь и поддержку. Я признательна сотрудникам лаборатории эволюционной цитогенетики НИИ ББ при ТГУ Русаковой A.M., Шабановой Ю.В., Штумпф О.В. за помощь в сборе материала, а также, к.б.н. Брагинец О.П. за синтез RAPD - праймеров. Благодарю ст. преподавателя кафедры цитологии и генетики ТГУ Новикова Ю.М. за ценные комментарии к работе. В заключение хочу выразить свою признательность всем коллегам из лаборатории эволюционной цитогенетики НИИ ББ при ТГУ за участие и моральную поддержку.
Существование двух форм Culex pipiens pipiens
В 1737 г. К. Линней присвоил имя Culex alpinus обычному комару Лапландии, который определенно был видом Aedes. В десятом издании Systema Naturae, опубликованном в 1758 г., Линней называет этого комара С. pipiens и дает ссылки на иллюстрации и описания Реамур с соавторами, которые совершенно точно соответствуют неавтогенному С. pipiens.
Обширные наблюдения, проведенные в Европе, привели к заключению, что самки Culex pipiens L. почти никогда не нападают на человека. С другой стороны, были зарегистрированы многочисленные случаи нападения Culex pipiens на человека в городских зданиях. В 1890 г. Фикалби (Ficaibi) предложил теорию, объясняющую это противоречие существованием другого вида p. Culex, который не выявлялся по причине его близкого сходства с Culex pipiens. Фикалби назвал этот вид Culex phytophagus, отметив этим названием то, что он отличается от «обычного кровососущего комара Culex pipiens» способностью существовать на «вегетарианской диете». Кроме того, он выявил ряд различий в окраске взрослых насекомых: Culex phytophagus темнее, чем С. pipiens и другие, касающиеся цвета разных частей тела. Следует отметить, что Фикалби сомневался в соответствии «обычного кровососущего комара» Линнеевскому С. pipiens и впоследствии предложил для него альтернативное название haematophagus. Как будет видно позднее, названия pipiens и haematophagus по Фикалби, можно заменить на molestus и pipiens, соответственно (Marshall, Staley, 1937).
Точка зрения Фикалби долгое время не вызывала научного интереса, не смотря на то, что были получены подтверждения в ее пользу наблюдениями других ученых. По данным Грасси (1923) в районах, где С. pipiens был источником беспокойства для человека, имаго были светлее, чем в тех местах, где люди не подвергались атаке (Grassi, 1923, цит. по: Marshall, Staley, 1937). Более того, было отмечено существование в одном и том же месте во Франции двух "рас" С. pipiens: 1) нападают на человека и размножаются в затопленных подвалах, цистернах с дождевой водой и выгребных ямах; самки этой "расы" светлее самок второй, 2) игнорируют человека и размножаются в открытых водоемах (Legendre, 1931, цит. по: Marshall, Staley, 1937).
В 1929 г. Рубо, Бойсезон и Хафф (Roubaud, Boissezon, Huff) независимо друг от друга показали, что некоторые расы С. pipiens проявляют аномальные черты, а именно, они способны спариваться в маленьких садках и откладывать фертильные яйца без кровососания (Marshall, Staley, 1937). Вторую черту Рубо (1933) обозначил понятием «автогенность» и предложил называть обычную неавтогенную расу С. pipiens pipiens, а автогенную - С. р. autogenicus. Также, он ввел понятия «стеногамность» и «эвригамность», обозначающие способность и неспособность комаров к копуляции в ограниченном пространстве (Marshall, Staley, 1937).
Маршалл и Стейли (Marshall, Staley, 1937) описали дополнительные характеристики имаго и личинок, по которым автогенная форма отличалась от неавтогенной. Кроме того, они предложили выделить эти формы в качестве отдельных видов не только на основе морфологических признаков, но также из-за удобства использования понятия «вариета» к менее отчетливым признакам, по которым можно было бы различать автогенные линии из разных мест. Ими же были даны обоснования использования видовых имен. Автогенную расу Маршалл и Стейли предложили называть С. molestus, основываясь на описаниях Форскаля (1775) особей из Египта (Marshall, Staley, 1937).
С. p. pipiens и С. p. molestus достаточно четко различаются по ряду эколого - физиологических признаков, а именно, эвригамности -стеногамности, орнитофилии - маммалофилии, неавтогенности -автогенности, гетеродинамности - гомодинамности, соответственно, кроме того, личинки С. p. pipiens заселяют открытые водные биотопы, в то время как С. p. molestus - гипогенные (т.е., расположенные ниже поверхности земли) или закрытые (Виноградова, 1997; Лопатин, 2000; Byrne, Nichols, 1999).
Поиск специфичных RAPD - фрагментов
Первичный скрининг праймеров заключался в поиске потенциальных специфичных фрагментов ДНК, для этого анализировалась изменчивость RAPD - маркеров у трех особей каждого вида или подвида (формы) комаров. Во второй этап скрининга вовлекались праймеры, которые амплифицировали фрагменты ДНК, не подверженные вариабельности; только после проверки репрезентативных выборок делалось заключение о возможности использования RAPD - маркеров для таксономической идентификации. Специфичные маркеры должны быть мономорфными, т.е. не проявлять индивидуальной и географической изменчивости, а также быть яркими и четкими, для исключения двусмысленной интерпретации результатов амплификации.
Специфичные RAPD - ПЦР продукты вырезали из агарозного геля и очищали с использованием High Pure PCR Product Purification kit ("Roche Applied Science", Germany), следуя инструкции, прилагаемой к набору. Для лигирования использовался набор pGEM - Т Easy Vector System ("Promega Corp.", USA), затем осуществляли трансформацию в клетки Escherichia coli XL 2 blue ("Stratagene"), согласно инструкции. Рекомбинантные плазмиды очищались стандартным щелочным методом. Определение нуклеотидной последовательности проводили согласно протоколу ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems Perkin -Elmer Corporation) на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 377. Для обработки результатов секвенирования использовали программу SeqMan 4.02. Подбор SCAR - праймеров осуществляли с помощью программы PrimerSelect4.01.
Реакционная смесь содержала однократный ПЦР-буфер (60 мМ Tris-HCl, 25 мМ КС1, 10 мМ 2 - меркаптоэтанол, 0,1% - ый Тритон X - 100), 2,5 мМ MgCb, 200 мкМ каждого dNTP, 1 единицу активности Taq ДНК - полимеразы ("СибЭнзим", г. Новосибирск), по 28 нг праймеров SCARcpl и SCARcp2 или по 7 нг праймеров SCARcp3 и SCARcp4 (Таблица 3), 20 нг геномной ДНК и деионизованную воду до объема 15 мкл. Амплификацию проводили в программируемом термоциклере Eppendorf Mastercycler personal (Германия). Условия амплификации: первичная денатурация ДНК - 3 мин при 94С, затем 35 циклов, включающих три этапа: 30 сек при 94С, 30 сек при 57С, 1 мин при 72С; финальная достройка цепей - 10 мин при 72С. Продукты амплификации разделяли в 1,5%-ном агарозном геле в однократном ТАЕ -буфере (0,04М трис-ацетат, 0,002М ЭДТА) при напряжении 100 V, окрашивали бромистым этидием (1 мкг/мл), визуализировали в ультрафиолетовом свете и фотодокументировали. Оценку размеров фрагментов ДНК осуществляли относительно 100 Ьр и 100 Ьр + 1,5 kb ДНК - маркеров ("СибЭнзим", г. Новосибирск). Полученные изображения обрабатывали в программе AdobePhotoshop 7.0.
Для амплификации участка митохондриального гена субъединицы I цитохромоксидазы с (COI) использовали праймеры UEA9 и UEA10 (Otranto, Traversa, Guida et al., 2003). Реакционная смесь содержала однократный ПЦР -буфер (60 мМ Tris - НС1, 25 мМ КС1, 10 мМ 2 - меркаптоэтанол, 0,1%-ый Тритон X - 100), 3 мМ MgCb, 200 мкМ каждого dNTP, 1 единицу активности TaqflHK - полимеразы ("СибЭнзим", г. Новосибирск), по 10 пмоль праймеров UEA9 и UEA10 (Таблица 3), 20 нг геномной ДНК и деионизованную воду до объема 15 мкл. Амплификацию проводили в программируемом термоциклере Eppendorf Mastercycler personal (Германия). Условия амплификации: первичная денатурация ДНК - 3 мин при 94С, затем 35 циклов, включающих три этапа: 30 сек при 94С, 30 сек при 60С, 1 мин при 72С; финальная достройка цепей - 10 мин при 72С.
Реакционная смесь для рестрикции содержала 3 мкл амплификата, однократный SE - буфер К (10 мМ Tris - НС1, 10 мМ MgCl2, 100 мМ КС1, 1 М DTT), 1 мкг BSA, 5 единиц активности рестриктазы Sspl ("СибЭнзим", г. Новосибирск) и деионизованную воду до объема 10 мкл. Смесь инкубировали при 37С в течение 1,5 ч. Продукты рестрикции разделяли в 2%-ном агарозном геле в однократном ТАЕ - буфере (0,04М трис - ацетат, 0,002М ЭДТА)
Молекулярно - генетические маркеры для идентификации представителей комплекса Cidex pipiens
Амплификация со случайными праймерами позволяет получать генетические маркеры без знания первичной последовательности ДНК. Эта техника получила название RAPD - ПЦР (Williams, Kubelik, Livak et al., 1990; Welsh, McClelland, 1990). RAPD - маркеры оказываются весьма полезными для выявления скрытой генетической изменчивости в линиях и близкородственных видах, которые не удавалось разделить ни по морфологии, ни цитогенетически, ни с помощью других молекулярных методов (Kambhampati, Black, Rai, 1992; Ballinger - Crabtree, Black, Miller, 1992; Wilkerson, Parsons, Albright et al., 1993; Wilkerson, Parsons, Klein et al., 1995; Favia, Dimopoulos, Delia Torre et al., 1994; Kengne, Trang, Baimai et al., 2001; Manguin, Kengne, Sonnier et al., 2002).
Первичный скрининг праймеров заключался в поиске потенциальных специфичных фрагментов ДНК, для этого анализировалась изменчивость RAPD - маркеров у трех особей С. torrentium, С. p. pipiens и С. p. moles tits. Праймеры, которые амплифицировали не подверженные вариабельности фрагменты ДНК (потенциальные специфичные маркеры) вовлекались во второй этап скрининга; только после проверки репрезентативных выборок делалось заключение о возможности использования RAPD - маркеров для таксономической идентификации. Специфичные маркеры должны быть мономорфными, т.е. не проявлять индивидуальной и географической изменчивости, а также быть яркими и четкими, для исключения двусмысленной интерпретации результатов амплификации.
Скринингу подвергали 26 десятинуклеотидных случайных праймеров (Таблица 2). После первичного скрининга были отобраны четыре праймера (ОРА - 09, ОРА - 11, ОРВ - 02 и ОРМ - 08), которые амплифицировали потенциальные специфичные фрагменты ДНК (бэнды), способные идентифицировать С. torrentium, С. p. pipiens и С. p. molestus. Дополнительный анализ на большем числе особей показал, что бэнды, амплифицирующиеся праймерами ОРА - 09 и ОРМ - 08, не являются специфичными, т.к. проявляют внутри - (праймер ОРМ - 08) или межпопуляционную (праймер ОРА - 09) изменчивость (данные не показаны).
На втором этапе скрининга праймеров анализировали внутри- и межпопуляционную изменчивость RAPD - маркеров в репрезентативных выборках (n = 48) из восьми популяций С. torrentium, трех популяций С. р. pipiens и пяти популяций С. p. molestus (г. Томск, Томская область, Республика Казахстан). Скрининг показал, что для идентификации С. torrentium и С. р. pipiens можно использовать фрагменты ДНК, амплифицирующиеся RAPD -праймерами ОРВ - 02 и ОРА - 11. В спектре фрагментов ДНК, амплифицированных праймером ОРВ - 02, был выявлен мономорфный бэнд, размером 1183 п.н. (по данным секвенирования), идентифицирующий С. torrentium (Рисунок 4А). На рисунке 4В представлены результаты амплификации с использованием праймера ОРА - 11. В паттерне С. torrentium четко выявляется специфичный фрагмент ДНК, размером 680 п.н. (по данным секвенирования), отсутствующий в спектре амплифицированных фрагментов ДНК С. p. pipiens и С. p. molestus.
Праймер ОРА - 11 также амплифицирует потециальные видоспецифичные фрагменты ДНК для двух представителей рода Сиіех, не входящих в комплекс Culex pipiens: С. modestus, размером около 410 п.н. и С. territans - приблизительно 800 п.н. (данные не показаны). Однако, сделать заключение о возможности использования этих маркеров для идентификации С. modestus и С. territans можно лишь после оценки межпопуляционной изменчивости; в данной работе анализировали только по одной выборке этих видов.
Примечание. Специфичные для С. torrentium фрагменты ДНК обозначены стрелками. Дорожки 2-9 -С. torrentium Дорожки 11 - 13 - С. р. pipiens; дорожки 14 - 18 - С. p. molestus. Дорожки 1, 10, 19 ДНК маркеры: Ikb (10, 8, 6, 5, 4, 3, 2.5, 2, 1.5, 1, 0.75, 0.5, 0.25 т.п.н.) (А), ЮОЬр + l,5kb(1.5, 1, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.1 т.п.н.) (В).
Для того чтобы усовершенствовать метод молекулярно - генетической идентификации, сделать его доступным широкому кругу исследователей, была предпринята попытка получения SCAR - маркеров. Основой SCAR - маркеров служат последовательности, характеризующие амплифицированные регионы (SCAR - Sequence Characterized Amplified Regions) (Kengne, Trung, Baimai et al., 2001; Manguin, Kengne, Sonnier et al., 2002).
Специфичные RAPD - бэнды были клонированы и секвенированы. Нуклеотидные последовательности RAPD - фрагментов, специфичных для С. torrentium, представлены на рисунках 5 и 6. Секвенированию подвергали фрагменты, полученные в результате RAPD - амплификации с ДНК 3-5 особей. Последовательности фрагментов ДНК разных особей С. torrentium были гомологичными. Определение последовательности нуклеотидов позволило подобрать специфичные SCAR - праймеры. Праймеры SCARcp3 и SCARcp4 были созданы на основе последовательности RAPD - фрагмента, размером 680 п.н. (RAPD - праймер ОРА - 11) (Таблица 3, рисунок 5); праймеры SCARcpl и SCARcp2 - на основе нуклеотидной последовательности фрагмента, размером 1183 п.н., амплифицированного RAPD - праймером ОРВ - 02 (Таблица 3, рисунок 6), Результатом использования SCAR - праймеров является амплификация одного специфичного фрагмента ДНК (SCAR -маркера).
В ходе SCAR - ПЦР с праймерами SCARcpl и SCARcp2 у особей С. torrentium и гибридов между ? С. p. molestus и в в С. torrentium амплифицируется фрагмент ДНК, размером 1093 п.н.; особи С. p. pipiens и С. р. molestus характеризуются отсутствием амплификации фрагмента ДНК соответствующего размера (Рисунок 7А).
Использование молекулярно - генетических маркеров для идентификации представителей комплекса Culex pipiens
Определение нуклеотидных последовательностей маркерных RAPD -фрагментов позволило создать специфичные SCAR - праймеры. Результатом использования SCAR - праймеров является амплификация только специфичных фрагментов ДНК (SCAR - маркеров) у особей С. torrentium. У особей С. p. pipiens и С. p. molestus данные фрагменты ДНК не амплифицируются из-за отсутствия в последовательности ДНК сайтов отжига для SCAR - праймеров (Таблица 7). Применение SCAR - маркеров позволяет усовершенствовать метод RAPD - идентификации С. torrentium, сделать его доступным широкому кругу исследователей, т.к. в случае использования SCAR - маркеров отпадает необходимость в анализе набора фрагментов ДНК разных размеров. Однако, эти маркеры не позволяют идентифицировать гибридов, т.к. гибридные особи от скрещивания $? С. p. molestus х 66 С. torrentium идентичны по SCAR - маркерам особям С. torrentium (Таблица 7).
Использование праймеров, фланкирующих ITS2 регионы, позволяет идентифицировать особей С. torrentium и С. p. pipiens или С. p. molestus, а также гибридов от скрещивания $? С. p. molestus х 66 С. torrentium. Размеры ПЦР - амплификатов у С. torrentium отличаются на 50 п.н. от размеров ПЦР -фрагментов С. p. molestus и С. p. pipiens; у гибридных особей представлены оба варианта (материнский и отцовский) (Таблица 7). К сожалению, не удалось изучить наследование молекулярно - генетических маркеров у гибридных особей от скрещивания 9? С. torrentium и 66 С. p. molestus, т.к. не было получено потомков от такого типа скрещивания. Однако, можно предположить, что у этих гибридов, также как у гибридов от скрещивания С. p. pipiens и С. torrentium будут представлены два типа ITS2 регионов. Разница в 50 п.н. между размерами ITS2 регионов С. p. pipiens (С. p. molestus) и С. torrentium сохраняется и в случае использования праймера 5.8Sa (Таблица 7). В таблице 7 представлены размеры ПЦР - амплификатов, в состав которых входят помимо ITS2 регионов и фланкирующие участки генов 5.8S и 28S рРНК; таким образом, размеры ITS2 регионов С. torrentium, С. p. pipiens и С. p. molestus из изученных мест сбора составляют около 257 п.н., около 307 п.н. и около 307 п.н., соответственно. Результаты настоящей работы соответствуют данным Виноградовой и Шайкевич (2005) для популяций С. torrentium и С. p. molestus европейской части России (г. Москва, г. Санкт - Петербург, Подмосковье и Ленинградская область), а также согласуются с данными Миллера с соавторами (Miller, Crabtree, Savage, 1996), которые свидетельствуют о небольших различиях (несколько замен нуклеотидов), существующих в ITS2 регионах С. р. pipiens и С. p. molestus из США.
Амплифицированный участок митохондриального гена COI, после обработки рестриктазой Sspl у С. torrentium оставался неизмененным, в то время как у С. p. pipiens и С. p. molestus, а также гибридов от скрещивания 99 С. p. molestus и S3 С. torrentium он разрезался рестриктазой на два фрагмента (Таблица 7). Известно, что мтДНК наследуется, независимо от ядерного генома, в основном через цитоплазму женских гамет, хотя иногда наблюдается неполное материнское наследование мтДНК. К сожалению, в ходе работы не удалось получить гибридов от скрещивания 99 С. torrentium и SS С. p. molestus, но можно предположить с большой долей вероятности, что участок гена COI гибридных особей от такого типа скрещивания не будет разрезаться рестриктазой Sspl, т.е. будет соответствовать типу С. torrentium (материнской форме). Вероятнее всего, такая же картина будет наблюдаться и при скрещивании С. p. pipiens и С. torrentium, т.е. у гибридов от скрещивания $$ С. p. pipiens и 33 С. torrentium участок гена COI будет расщепляться рестриктазой Sspl на два фрагмента, а у гибридных особей от скрещивания $ С. torrentium и 33 С. p. pipiens он будет оставаться неизмененным. Таким образом, вследствие материнского наследования мтДНК, метод не позволяет идентифицировать гибридных особей между С. torrentium и С. p. pipiens или между С. torrentium и С. p. molestus. Однако, применение SCAR - маркеров и рестрикционного анализа участка гена COI, позволяет идентифицировать гибридов от скрещивания С. torrentium и С. p. molestus, но лишь в одном направлении скрещивания, а именно, гибридные особи от скрещивания 2? С. p. molestus и в в С. torrentium по SCAR - маркерам будут соответствовать особям С. torrentium, в то время как участок гена COI у этих гибридов будет разрезаться рестриктазой Sspl по типу С. p. molestus (сравните рисунки 7А, 7В и 10). Такая же закономерность, скорее всего, будет наблюдаться и при анализе гибридов от скрещивания $$ С. p. pipiens и S3 С. torrentium. Участок гена COI гибридных потомков от скрещивания С. p. pipiens и С. p. molestus любого направления будет разрезаться рестриктазой Sspl.
