Введение к работе
Актуальность работы
Проблема пространственной организации генома возникла в то же время, что и современная генетика, но была незаслуженно забыта в связи с активным развитием представлений о том, что только первичная последовательность ДНК определяет работу генома. В настоящее время, когда просеквенированы геномы многих организмов, стало ясно, что большая часть генома не несет очевидной информационной функции. Считается, что некодирующая ДНК, представленная по большей части гетерохроматическими районами, ответственна за укладку остальной части генома (Manuelidis, Borden, 1988; Haaf, Schmid, 1999). Гетерохроматин состоит в основном из двух классов последовательностей - умеренных и тандемных повторов сателлитной ДНК. Как организованы эти повторы в гетерохроматине, каково их значение и посредством каких механизмов осуществляется их функционирование до сих пор остается нерешенной проблемой. Поэтому актуальным является исследование эпигенетических (надгенетических) механизмов функционирования генома, в которых участвует гетерохроматин. Одним из таких механизмов, вероятно, является реорганизация повторов разных классов, которая способна изменять трехмерную ориентацию хромосом в ядре.
Понимание принципов расположения генетического материала в пространстве ядра (принципов организации хромосомных территорий) имеет особое значение, так как оно во многом определяет его активность, его транскрипционный статус. Следовательно, детальный анализ районов прикрепления хромосом к ядерной оболочке и становление принципов внутриядерной организации хроматина является актуальной задачей.
Малярийные комары Anopheles комплекса «maculipennis» являются подходящим объектом для изучения вопросов, касающихся надгенетической регуляции работы генома, её механизмов и эволюции. На протяжении многих лет в Томском госуниверситете ведутся работы по изучению генетики этих насекомых. Детально изучена цитогенетика Anopheles комплекса «maculipennis», обитающих на территории Палеарктнки (Кабанова и др., 1972, 1973), исследованы принципы видообразования этих насекомых (Стегний, 1991), выявлены закономерности пространственной организации ядра и открыт новый тип мутаций - системные мутации (Стегний, 1979, 1991), проведены исследования организации гетерохроматина у малярийных комаров (Шарахова и др., 1997). Установлено, что у близкородственных видов малярийных комаров в клетках генеративной системы хромосомы организованы в пространстве по-разному - хромосомы различаются по наличию/отсутствию контактов с ядерной оболочкой, расположению районов прикрепления на самих хромосомах и. их морфологией (Стегний, 1979), что свидетельствует об эволюционном значении архитектуры хромосом в ядре.
Дальнейшее изучение взаиморасположения хромосом в пространстве ядра и особенностей организации гетерохроматина у Anopheles должно быть основано на богатом опыте проведенных исследований и использовании современных подходов. Имеющаяся информация о цитогенетике и филогенезе малярийных комаров комплекса «maculipennis» позволит провести оценку эволюционного аспекта пространственной реорганизации хромосом в ядре, связанного с изменением молекулярно-генетической структуры гетерохроматина.
«maculipennis» необходимо проводить в направлении поиска зависимости
пространственной реорганизации хромосом в ядре от изменения последовательности ДНК в районах прикрепления хромосом к ядерной оболочке.
Цель и задачи исследования
Целью исследования является сравнительный анализ ДНК из районов прикрепления хромосом к ядерной оболочке у малярийных комаров Anopheles комплекса «maculipennis».
Задачи исследования:
-
Осуществить микродиссекцию районов прикрепления хромосом XL и 3R Anopheles messeae Fall., XL An. atroparvus van Thiel. и получить библиотеку клонов района прикрепления XL хромосомы Л л. messeae.
-
Провести сравнительный анализ локализации ДНК из района прикрепления XL хромосомы An. messeae на хромосомах An. messeae, An. atroparvus, An. beklemishevi Steg. et Kab., An. maculipennis Mg. и An. melanoon Hackett. с помощью флуоресцентной in situ гибридизации.
-
Определить и охарактеризовать первичную последовательность ДНК района прикрепления XL хромосомы An. messeae.
-
Выявить последовательности ДНК гомологичные для районов прикрепления хромосом XL, 3R An. messeae, XL хромосомы An. atroparvus и провести анализ их взаимодействия с белками внутриядерных структур.
Научная новизна
Впервые была изучена первичная последовательность района прикрепления XL хромосомы к ядерной оболочке трофоцитов An. messeae.
Впервые проведен сравнительный анализ локализации последовательности ДНК района прикрепления An. messeae на пяти видах малярийных комаров комплекса «maculipennis». Показано, что район прикрепления XL хромосомы An. messeae сформировался в результате реорганизации последовательности ДНК района 2Ь-с, а не путем его переноса из прицентромерного района инверсией или другими хромосомными перестройками.
Были выявлены различия в локализации повторов на хромосомах трофоцитов комаров комплекса «maculipennis». Показано, что в ходе филогенеза происходила аккумуляция повторов в прицентромерном гетерохроматине An. maculipennis и An. messeae.
В районе прикрепления XL хромосомы An. messeae выявлены мобильные элементы, тандемные повторы и последовательности, гомологичные генам.
Проведен поиск гомологичных последовательностей ДНК районов прикрепления хромосом XL и 3R An. messeae, а также XL An. atroparvus, что позволило впервые выявить характеризующие их элементы.
Полученные данные расширяют знания о структуре, функции клеточного ядра и пространственной организации интерфазных ядер.
Положения, выносимые на защиту
-
Виды малярийных комаров комплекса «maculipennis» различаются по локализации повторов ДНК на политенных хромосомах трофоцитов.
-
Район прикрепления XL хромосомы An. messeae к ядерной оболочке содержит мобильные элементы, тандемные повторы и последовательности, гомологичные генам.
-
Характеристикой районов прикрепления XL хромосомы An. messeae и An. atroparvus, а также 3R хромосомы An. messeae является обогащенность последовательностями ДНК, потенциально связывающих белки внутриядерных структур. Общими для них являются последовательность клона Mes2b-c_395 и LINE-элементы.
Практическая значимость
Получены районспецифичные ДНК пробы из районов 2b-c An. messeae, 5а An. atroparvus и 32d An. beklemishevi, а также библиотека клонов ДНК района 2b-c An. messeae которые необходимы для анализа гетерохроматиновых районов и их вклада в пространственную организацию хромосом Anopheles комплекса «maculipennis». Полученные ДНК пробы могут быть использованы для видовой диагностики малярийных комаров. Данные анализа районов прикрепления хромосом к оболочке ядра у малярийных комаров позволят оценить эволюционные механизмы в этой группе насекомых, дадут возможность в дальнейшем контролировать их численность в ходе эпидемиологических мероприятий.
Апробация работы
Результаты работы представлены в материалах Международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (Томск, 9-12 мая 2007 г.), материалах II Съезда Общества клеточной биологии совместно с конференцией, посвященной юбилею Института цитологии РАН (С.-Петербург, 16-19 октября 2007г.) и материалах международной конференции «Хромосома 2009» (Новосибирск, 31 августа - 6 сентября 2009 г.). По теме диссертации сделано четыре публикации в отечественных журналах рецензируемых ВАК.
Вклад автора
Основные результаты работы были получены автором самостоятельно. Микродиссекция района 2b-c XL хромосомы An. messeae трофоцитов проводилась совместно с д-ром биол. наук Н. Б. Рубцовым и канд. биол. наук Т. В. Карамышевой (ИЦиГ СО РАН, г. Новосибирск). Секвенирование библиотеки проводилось совместно с канд. биол. наук Н. В. Храбровой (ОСП «НИИ ББ ТомГУ», г. Томск).
Структура и объем работы
Похожие диссертации на Молекулярно-генетический анализ районов прикрепления хромосом к оболочке ядра трофоцитов яичников малярийных комаров Anopheles комплекса "Maculipennis"
