Введение к работе
Актуальность проблемы. Одной из наиболее интересных и актуальных проблем современной генетики развития являются механизмы компенсации дозы генов Х-хромосомы. У самок млекопитающих компенсация дозы генов, сцепленных с Х-хромосомой, осуществляется за счет инактивации одной из двух эквивалентных хромосом. Инактивация Х-хромосомы - это сложный процесс, который начинается в раннем эмбриогенезе и его условно принято разделять на несколько стадий: 1) стадия инициации, на которой происходит подсчет числа Х-хромосом относительно диплоидного набора аутосом, выбор будущей неактивной Х-хромосомы и инициация инактивации; 2) стадия распространения неактивного состояния по Х-хромосоме; 3) стадия поддержания неактивного состояния.
Инактивация Х-хромосомы контролируется определенным генетическим локусом, получившим название - центр инактивации. Данный локус содержит ряд генетических элементов, важнейшими из которых являются антисмысловые гены Xist и Tsix. Предполагается, что ключевым в процессе инактивации является ген Xist - X-Inactivate Specific Transcript. Он экспрессируется только на неактивной Х-хромосоме и кодирует длинную нетранслируемую ядерную РНК. Xist РНК накапливается на Х-хромосоме, с которой она считывается, приводя к её гетерохроматинизации и транскрипционной инактивации практически всех расположенных в ней генов (Brockdorff, 1998). В свою очередь, ген Гі&является важнейшим регулятором экспрессии Xist (Lee, Lu, 1999).
Ключевое место в регуляции экспрессии генов занимает процесс
транскрипции. Транскрипция генов контролируется набором регуляторних
элементов (последовательностями ДНК), с которыми взаимодействуют
разнообразные регуляторные белки. Наиболее важным элементом является
минимальный промотор, который представляет собой минимальную
последовательность ДНК, необходимую и достаточную для сборки
преинициаторного комплекса и инициации транскрипции гена. Минимальный
промотор включает точку старта транскрипции и прилегающую к ней область
размером от 100 до 250 п.н., в зависимости от набора образующих его
элементов. Вблизи, по обе стороны от минимального промотора, располагаются
проксимальные элементы, которые модулируют транскрипцию. Дополнительно
процесс транскрипции контролируется дистальными элементами. К
регуляторным элементам такого типа относят энхансеры, сайленсеры и
инсуляторы, которые могут располагаться на произвольном расстоянии как в 5'-,
так и в З'-областях генов. Таким образом, набор определенных регуляторных
элементов и взаимодействие с ними белков формирует паттерн экспрессии генов
в онтогенезе и определяет тканеспецифичность их экспрессии. Поэтому важное
значение имеют исследования, направленные на идентификацию отдельных
регуляторных элементов в различных генах, изучение их действия и
определение транскрипционных факторов, связывающихся с этими элементами.
В связи с этим, идентификация районов, регулирующих транскрипцию гена Xist
и определение способа их действия, позволит раскрыть механизмы его
экспрессии и поможет лучше понять процесс инактивации Х-хромосомы в
целом. I
Привлекательной моделью для изучения инактивации Х-хромосомы являются обыкновенные полевки рода Microtus. Это третий после мыши и человека объект, на котором проводятся систематические исследования процесса инактивации. Однако, в отличие от традиционных объектов, полевки обладают рядом интересных особенностей. В частности, у межвидовых гибридов обыкновенных полевок обнаружена неслучайная инактивация Х-хромосомы, что делает их уникальной моделью для изучения факторов, ответственных за выбор неактивной Х-хромосомы. Отличия в нуклеотидных последовательностях центра инактивации и цитологические различия Х-хромосом (размеры, наличие блоков гетерохроматина, положение центромеры) у разных видов полевок позволяют использовать межвидовые гибриды для наблюдения за судьбой будущих активной и неактивной Х-хромосом на молекулярном и цитологическом уровнях (Zakianetal., 1987).
В настоящей работе проведена детальная молекулярно-генетическая характеристика регуляторного района гена Xist у обыкновенной полевки Microtus rossiaemeridionalis. Кроме этого, исследовано влияние однонуклеотидной замены -43G/A в минимальном промоторе гена Xist на неслучайную инактивацию Х-хромосомы у межвидовых гибридов обыкновенных полевок.
Цель и задачи исследования.
Цель данной работы заключалась в исследовании структурно-функциональной организации 5'-регуляторной области гена Xist у полевки Microtus rossiaemeridionalis.
Для её достижения были поставлены следующие задачи:
-
Идентифицировать районы связывания транскрипционных факторов в регуляторной области гена Xist при помощи метода in vitro футпринтинга с ДНКазой I.
-
Провести компьютерный анализ полученных районов и определить транскрипционные факторы, которые потенциально могут взаимодействовать с этими районами.
-
Определить регуляторный потенциал различных частей 5'-области гена Xist в составе репортерных конструкций.
-
Изучить влияние замены -43G/A в минимальном промоторе гена Xist на процесс неслучайной инактивации Х-хромосомы у межвидовых гибридов обыкновенных полевок.
Научная новизна исследования.
В настоящей работе впервые проведен системный анализ 5'-регуляторного района гена Xist. Показано, что в данном районе располагаются две консервативные последовательности, которые могут быть ключевыми в процессе регуляции экспрессии гена Xist. Молекулярно-генетический анализ позволил идентифицировать области, которые могут оказывать позитивное и негативное влияние на экспрессию Xist полевки Microtus rossiaemeridionalis, а также определить транскрипционные факторы, которые потенциально могут взаимодействовать с этими участками. Полученные результаты имеют существенное значение для понимания механизмов экспрессии гена Xist и всего процесса инактивации Х-хромосомы в целом.
Теоретическая и практическая значимость исследования.
Результаты данной работы расширяют знания о молекулярно-генетических механизмах регуляции экспрессии гена Xist и, следовательно, процесса инактивации Х-хромосомы у самок млекопитающих. Полученные в работе результаты используются в качестве материала при чтении спецкурса «Новейшие молекулярно-генетические технологии» в Новосибирском государственном университете.
Основные положения работы, выносимые на защиту.
-
Присутствие в 5'-области гена Xist двух консервативных нуклеотидных последовательностей свидетельствует о наличии общих механизмов регуляции транскрипции этого гена у разных видов млекопитающих.
-
Транскрипция гена Xist полевки М. rossiaemeridionalis находится под контролем большого количества регуляторных элементов, среди которых ключевым является минимальный промотор, локализованный в районе -100/+67 п.н. Непосредственное участие в регуляции транскрипции Xist принимают транскрипционные факторы Spl и CTCF.
-
Однонуклеотидная замена -43G/A в районе локализации потенциальных сайтов связывания транскрипционных факторов АР2 и CTCF в промоторе гена Xist у полевки М. arvalis не влияет на его экспрессию в фибробластах.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (Томск, 9 - 12 мая 2007 г.), на Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2009» (Москва, 13-18 апреля 2009 г.), на Международной конференции «Хромосома 2009» (Новосибирск, 31 августа - б сентября 2009 г.), на семинарах и отчетных сессиях Института цитологии и генетики СО РАН.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ, 2 из них в рецензируемых журналах из списка ВАК.
Вклад автора. Основные результаты получены автором самостоятельно. Автор принимал личное участие в планировании, проведении и обсуждении всех экспериментов, по результатам которых написана диссертация. Биоинформационный анализ нуклеотидных последовательностей проводился совместно с к.б.н. Е.А. Елисафенко.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 3-х глав (обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение), заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 145 страницах, иллюстрирована 18 рисунками, содержит 5 таблиц и одно приложение. Список цитируемой литературы включает 214 ссылок.
