Введение к работе
Актуальность проблемы.
Известно, что мРНК эукариотических генов различаются по трансляционной активности, то есть по интенсивности синтеза белка в процессе трансляции. Считается, что инициация является лимитирующей стадией процесса трансляции в клетках эукариот. 5’-нетранслируемая последовательность мРНК (участок между 5’-концом и началом белок-кодирующей последовательности (БКП)) участвует во взаимодействии с факторами аппарата трансляции и 40S субъединицами рибосом. Известно, что характеристики нуклеотидной последовательности 5’-НТП оказывают существенное влияние на эффективность инициации трансляции (Kozak, 2005; Kochetov, 2008). Некоторые из таких функционально-значимых характеристик были выявлены: в частности, стабильная вторичная структура и потенциальные стартовые кодоны в районе 5’-НТП могут ингибировать трансляцию. Показано, что небольшие открытые рамки считывания (upstream ORF, uORF), содержащиеся в составе 5’-НТП многих эукариотических мРНК, в некоторых случаях играют важную роль в пост-транскрипционном контроле экспрессии соответствующих генов. Однако, в подавляющем большинстве случаев их роль остается не изученной. В целом, имеющаяся информация о структурно-функциональной организации 5’-НТП, недостаточна. Знание трансляционно-значимых характеристик 5’-НТП важно для предсказания трансляционной активности мРНК, особенностей контроля экспрессии генов на пост-транскрипционном уровне, а также для предсказания связи между мутациями в этом районе гена и патологическими состояниями.
На момент начала работы имеющиеся в литературе данные о характеристиках 5’-НТП в основном были получены в экспериментах in vitro, не было известно, существуют ли у 5’-НТП как у функционального района гена какие-либо общие или таксон-специфические особенности. Кроме этого, не было достаточной информации о структуре сигнала инициации трансляции. Известно, что распознавание триплета AUG в качестве стартового кодона зависит от нуклеотидного окружения (контекста). Считалось, что основную роль выполняют нуклеотиды, расположенные непосредственно перед AUG в 5’-НТП (5’-часть контекста). Согласно некоторым экспериментальным данным, эффективность распознавания инициаторного кодона также зависела от нуклеотидов, расположенных непосредственно после AUG (3’-части контекста, совпадающей с началом БКП). Однако, имеющиеся экспериментальные данные были противоречивы, что не позволяло точно определить полную структуру сигнала инициации трансляции, затрудняло предсказание локализации и эффективности этих сигналов.
Цели и задачи исследования.
Целью работы являлось изучение трансляционно-значимых характеристик нуклеотидных последовательностей 5’-нетранслируемых районов мРНК генов эукариотических организмов. В рамках работы были поставлены следующие задачи.
1. С помощью компьютерного анализа исследовать контекстные характеристики нуклеотидных последовательностей 5’-НТП мРНК генов дрожжей, высших растений, насекомых, амфибий, птиц и млекопитающих и определить параметры, связанные с эффективностью инициации трансляции.
2. Исследовать роль нуклеотидов, расположенных непосредственно после кодона AUG (3’-концевого участка контекста), в функционировании сигнала инициации трансляции в мРНК млекопитающих.
Научная новизна.
Впервые проведен систематический анализ контекстных характеристик, специфических для 5’-НТП мРНК генов Arabidopsis thaliana, Liliopsida, Drosophila melanogaster, Xenopus laevis, Gallus gallus, Mus musculus, Homo sapiens и Saccharomyces cerevisiae. Обнаружено, что для 5’-НТП высших растений, насекомых, птиц и животных характерен выраженный дисбаланс в содержании комплементарных нуклеотидов. По-видимому, эта особенность лидерных районов мРНК сформировалась в ходе эволюции и является следствием естественного отбора, направленного на элиминацию стабильных вторичных структур, снижающих эффективность трансляции. Показано, что 5’НТП эффективно транслируемых мРНК эукариотических организмов характеризуются меньшим размером, отсутствием (или меньшим числом) триплетов AUG, более выраженным дисбалансом в содержании комплементарных нуклеотидов.
Обнаружено, что трансляционно-значимые характеристики uORF (размер, контекст стартового кодона), расположенных в 5’НТП мРНК генов млекопитающих, птиц, высших растений и насекомых, существенно различаются в зависимости от их расположения в пределах 5’НТП (локализованные в 5’-НТП, перекрывающиеся с БКП и сливающиеся с БКП). uORF, локализованные в пределах 5’НТП, характеризуются небольшими размерами, что позволяет осуществлять трансляцию основной рамки считывания с помощью механизмов «сканирования с подтеканием» (leaky scanning) и/или реинициации и говорит о регуляторных функциях этого типа лидерных рамок считывания. uORF, перекрывающиеся с БКП, характеризуются значительно большими размерами, что свидетельствует об их неучтенном кодирующем потенциале и более выраженном негативном эффекте на трансляцию основной рамки считывания.
Впервые показано, что существует взаимосвязь между нуклеотидами в -3 и +4 позициях контекста стартового кодона в мРНК млекопитающих: выявлено два устойчивых варианта оптимального контекста: AnnAUGn и GnnAUGG.
Обнаружено существование функциональной взаимосвязи между аминокислотами в N-концевом участке белка и эффективностью инициации трансляции: выявлены устойчивые комбинации нуклеотидов в позиции -3 перед AUG и аминокислотных остатков во второй позиции белков млекопитающих: AnnAUG коррелирует с более частым присутствием во второй позиции белка остатка серина, GnnAUG – аланина и глицина. По-видимому, комбинации определенного нуклеотида в -3 позиции контекста и аминокислотного остатка во второй позиции белка увеличивают эффективность определённых стадий процесса инициации трансляции (предположительно, формирования первой пептидной связи).
Практическая значимость
Выявленные трансляционно-значимые характеристики эукариотических мРНК (дисбаланс в содержании комплементарных нуклеотидов в 5’-НТП, оптимальные варианты нуклеотидного контекста стартового кодона трансляции (GnnAUGG, AnnAUG), а также потенциальное участие аминокислотных остатков во второй позиции белка в инициации трансляции) могут быть использованы для улучшения существующих методов предсказания трансляционной активности эукариотических мРНК и позиций сайтов инициации трансляции. Полученные данные были использованы для оптимизации сайтов инициации трансляции при планировании генетических конструкций для получения трансгенных растений в лаборатории генной инженерии ИЦиГ СО РАН.
Положения, выносимые на защиту:
5’НТП эффективно транслируемых мРНК генов Arabidopsis thaliana, Liliopsida, Drosophila melanogaster, Xenopus laevis, Gallus gallus, Mus musculus, Homo sapiens и Saccharomyces cerevisiae характеризуются выраженным дисбалансом комплементарных нуклеотидов, небольшими размерами, отсутствием (или небольшим числом) uAUG.
Характеристики лидерных рамок считывания (uORF) Arabidopsis thaliana, Liliopsida, Drosophila melanogaster, Xenopus laevis, Gallus gallus, Mus musculus, Homo sapiens, расположенных либо в пределах 5’НТП, либо перекрывающихся с БКП, статистически достоверно различаются, что может свидетельствовать об отличиях в их функциях.
Оптимальный контекст стартового кодона трансляции в мРНК млекопитающих включает две устойчивые комбинации нуклеотидов в позициях -3 и +4: AnnAUGN, GnnAUGG.
Эффективность инициации трансляции может зависеть от определенных комбинаций нуклеотида в позиции -3 перед кодоном AUG и аминокислотного остатка, расположенного во второй позиции белка: в частности, AnnAUG коррелирует с более частым присутствием серина, GnnAUG – аланина и глицина.
Апробация работы
Материалы диссертации были представлены на: Международной конференции «Генетика в России и мире», Москва, 2006; Translational Control and Non-Coding RNA Meeting, Czech Republic, 2006; Международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» Томск, 2007; Moscow Conference on Computational Molecular Biology,Moscow, 2007, 2009, 2011; Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure. Novosibirsk, 2000, 2006, 2008, 2010.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 16 работ, из них: 6 в рецензируемых журналах (из перечня ВАК), 10 тезисов.
Структура и объем работы
Диссертация включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, выводы, список литературы (159 ссылок) и приложение. Работа изложена на 127, включая 9 рисунков и 18 таблиц.
![Идентификация и характеристика генов, влияющих на поддержание и фенотипическое проявление прионоподобного детерминанта [ISP+], у дрожжей Saccharomyces cerevisiae](/i/i/4278/150135.png "Идентификация и характеристика генов, влияющих на поддержание и фенотипическое проявление прионоподобного детерминанта [ISP+], у дрожжей Saccharomyces cerevisiae Аксенова Анна Юрьевна")