Идентификация и характеристика генов, влияющих на поддержание и фенотипическое проявление прионоподобного детерминанта [ISP+], у дрожжей Saccharomyces cerevisiae Аксенова Анна Юрьевна

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1. Обзор литературы. роль генетических и эпигенетических факторов в обеспечении точности трансляции у эукариот 8

1.1. Характеристика процесса трансляции и типы ошибок, возникающих в ходе трансляции 8

1.2. Генетический контроль точности трансляции. Факторы, влияющие на считывание стоп кодонов 11

1.2.1. Роль мутантных и естественных нонсенс-супрессорных тРНК в считывании стоп-кодонов 11

1.2.2. Роль факторов терминации в распознавании стоп-кодонов. 13

1.2.3. Роль рРНК и рибосомных белков в поддержании точности трансляции 17

1.2.4. Роль факторов элонгации трансляции в поддержании точности трансляции 20

1.2.5. Роль компонентов системы деградации содержащих нонсенс-мутации мРНК?в поддержании точности трансляции 23

1.2.6. Роль белка РаЫ в поддержании точности трансляции 26

1.2.7. Влияние тоннельного белка рибосомы Rpl39 и связанных с рибосомой шаперонов на точность трансляции 26

1.2.8. Роль белков цитоскелета в регуляции точности трансляции. Новые функции факторов терминации трансляции 28

1.2.9. Другие факторы, влияющие на считывание стоп-кодонов .29

1.3. Эпигенетический контроль точности трансляции 31

1.3.1. Фактор [PSf] и его влияние на точность трансляции. Молекулярно-генетический и биохимический анализ свойств агрегатов белка Sup35 31

1.3.2. Белок-белковые взаимодействия Sup35 - влияние на поддержание и свойства фактора [PSt] 34

1.3.3. Взаимодействие фактора [PSt] с другими прионами 37

1.3.4. Эпигенетический детерминант [ISP+], вовлеченный в контроль точности трансляции 38

1.4. Заключение 40

ГЛАВА 2. Материалы и методы 42

2.1. Штаммы 42

2.2. Плазмиды и библиотеки генов 42

2.3. Среды и условия культивирования 50

2.4. Генетические методы 51

2.5. Молекулярно-генетические и биохимические методы 53

2.6. Математические и статистические методы 58

ГЛАВА 3. Результаты 61

3.1. Идентификация генов, влияющих на фенотипическое проявление и поддержание детерминанта [ISP+] 61

3.1.1. Использование центромерной библиотеки для выявления генов, влияющих на фенотипическое проявление и поддержание детерминанта [ISP+] 61

3.1.2. Анализ вставок геномной ДНК, изолированных в составе плазмид YCp50-4, YCp50-71, YCp50-73, YCp50-106, YCp50-107 и YCp50-l 14 63

3.1.3. Анализ вставок геномной ДНК, изолированных в составе плазмид YCp50-l 15, YCp50-165, YCp50-231 65

3.2. Идентификация криптических мутаций в гене SUP45,

влияющих на фенотипическое проявление [ISP+] 67

3.2.1. Аллель дикого типа гена SUP45, вносимая на центромерной плазмиде, приводит к маскировке фенотипического проявления [ISP+] 67

3.2.2. Хромосомная аллель гена SUP45 из штамма 4В-П4482 содержит мутацию 69

3.2.3. Штамм [ISP+], несущий мутацию sup35-10, также содержит мутацию в гене SUP45 70

3.2.4. Мутации sup45-400 и sup45-75 не имеют самостоятельного супрессорного эффекта 71

.3. НаІЗ-Ppzl -зависимая регуляция точности трансляции и ее влияние на проявление и свойства детерминанта [ISP+] 72

3.3.1. Сверхэкспрессия гена HAL3 вызывает аллосупрессию в штаммах [ISP+] 72

3.3.2. Сверхэкспрессия гена PPZ1 оказывает антисупрессорный эффект в штаммах [isp~], опосредованный каталитической функцией фосфатазы Ppzl 74

3.3.3. Делеция гена HAL3 обладает антисупрессорным эффектом по отношению к мутации sup35-25 в [isp~] штаммах 77

3.3.4. Делеция гена PPZ1 в [ISP+] штаммах приводит к слабому нонсенс-супрессорному эффекту. Поиск альтернативных мишеней белка На13 79

3.3.5. Аллосупрессорный эффект сверхпродукции белка На13 опосредован его взаимодействием с Ppzl и ингибированием каталитической активности этой фосфатазы 83

3.3.6. Сверхэкспрессия фактора элонгации трансляции eEFlBa, являющегося мишенью фосфатаз Ppz, имеет антисупрессорный эффект в штаммах [isp~] 85

3.3.7. [ISP*] и [isp~] штаммы содержат разное количество белка На13 87

.4. Элиминация [ISP+] под действием GuHCl является На13 - зависимой 88

3.4.1. Эффективность излечивания хлоридом гуанидина детерминанта [ISP+] значительно ниже, чем фактора [PSt\ 88

3.4.2. [ISP+] и [isp~] штаммы различаются по чувствительности к GuHCl 89

3.4.3. GuHCl обладает излечивающим эффектом в отношении детерминанта [ISP+] 91

3.4.4. Делеция гена HAL3 приводит к чувствительности штаммов к хлориду гуанидина и блокирует способность детерминанта [ISP+] 96

3.4.5. Мутации hal3, влияющие на способность На13 взаимодействовать с фосфатазой Ppzl и ингибировать ее активность, приводят к чувствительности роста несущих их штаммов к действию GuHCl и обуславливают их конститутивный антисупрессорный фенотип, несмотря на действие GuHCl 98

3.4.6. Штаммы [isp~\ более устойчивы, по сравнению со штаммами [ISP+], к аминогликозидным антибиотикам и хлориду лития 100

3.5. Делеция гена HALS снижает эффективность излечивания хлоридом гуанидина фактора [PSt] 102

ГЛАВА 4. Обсуждение 104

Выводы 126

Список литературы

• Характеристика процесса трансляции и типы ошибок, возникающих в ходе трансляции
• Роль белков цитоскелета в регуляции точности трансляции. Новые функции факторов терминации трансляции
• Молекулярно-генетические и биохимические методы
• Идентификация генов, влияющих на фенотипическое проявление и поддержание детерминанта [ISP+]

Введение к работе

Трансляция последовательности триплетов мРНК в последовательность аминокислот в белке, осуществляемая в соответствии с правилами генетического кода, является важнейшим этапом реализации генетической информации. Точность считывания триплетов - необходимое условие этого процесса, однако, известно, что она не абсолютна. Исходя из принципа поливариантности матричных процессов, сформулированного С.Г. Инге-Вечтомовым почти 40 лет назад (Инге-Вечтомов, 1969), определенный уровень неточности и неоднозначности при считывании триплетного кода является характерным свойством белоксинтезирующего аппарата. Нарушения в работе компонентов аппарата трансляции могут дополнительно влиять на уровень возникновения ошибок трансляции, приводя к снижению ее точности или, наоборот, повышению.

Наиболее простой моделью для изучения точности трансляции является изучение супрессии нонсенс-мутаций, приводящих к преждевременному появлению стоп-кодона в открытой рамке считывания. Изменения в точности трансляции в этом случае могут быть обнаружены на фенотипическом уровне, так как считывание стоп-кодонов как значащих восстанавливает прерванный мутацией синтез белка.

Более чем 40-летняя история изучения нонсенс-супрессии у дрожжей S. cerevisiae показала, что возможность и эффективность считывания стоп-кодонов как значащих у этого объекта контролируется факторами генетической и эпигенетической природы. Большинство мутаций, влияющих на считывание стоп-кодонов, было изолировано в генах, кодирующих тРНК, рРНК, белки рибосомы, факторы терминации и элонгации трансляции. К факторам, влияющим на считывание стоп-кодонов на эпигенетическом уровне относят наследственные детерминанты белковой природы - прионы. Наиболее изученный прион дрожжей [PSf] является продуктом прионного превращения белка Sup35, фактора терминации трансляции eRF3 (см.

Wickner et al, 1999). В присутствии [PSt~\ повышается эффективность считывания стоп-кодонов как значащих за счет снижения количества растворимого белка Sup35 (Paushkin et al, 1996). Другой прион - [РІРҐ] также косвенно вовлечен в контроль точности трансляции, поскольку необходим для индукции [PSf] de novo (Derkatch et al, 1997). Показано, что [Р/Л^] может появляться в клетке в результате прионизации 11 различных белков (Derkatch et al, 2001). Один из этих белков - иге2р_гявляется структурным белком еще одного приона дрожжей - [URE3], который участвует в контроле метаболизма азота (см. Wickner et al, 1999).

На точность трансляции влияют также некоторые нехромосомные эпигенетические детерминанты, природа которых пока не известна. Один из них, детерминант [ISP⁺], был идентифицирован в лаборатории физиологической генетики при изучении свойств мутаций sup35: он практически полностью нейтрализует эффект мутаций sup35-10 и sup35-25, восстанавливая нарушенную точность трансляции (Волков, 2000). [ISP⁺] обладает рядом свойств, характерных для дрожжевых прионов,и способен излечиваться при воздействии универсального антиприонного агента, хлорида гуанидина (GuHCl). Тем не менее, прямых доказательств того, что [ISP⁺] может являться еще одним прионом дрожжей пока не получено.

Данная работа посвящена дальнейшему изучению механизмов эпигенетической регуляции точности трансляции у дрожжей на примере детерминанта [ISP⁺].

Характеристика процесса трансляции и типы ошибок, возникающих в ходе трансляции

Процесс трансляции обеспечивается работой сложноорганизованного молекулярного аппарата, состоящего из рибосом, тРНК и множества белковых факторов. Рибонуклеопротеиновые комплексы - рибосомыл заявляются молекулярной платформой, на которой осуществляется взаимодействие мРНК, тРНК и белковых факторов трансляции.

Трансляция может быть подразделена на несколько этапов: инициация, элонгация, терминация и рециркуляция рибосом (Ramakrishnan, 2002; см. Marintchev a. Wagner, 2004). Инициация трансляции является наиболее комплексным и наименее эволюционно-консервативным этапом (см. Marintchev a. Wagner, 2004). Она включает в себя все стадии между диссоциацией субъединиц рибосомы в предыдущем цикле трансляции и сборкой на старт-кодоне рибосомы, готовой к элонгации. В ходе инициации рибосома вместе с инициаторной аа-тРНК поэтапно присоединяется к мРНК при помощи целого ряда факторов инициации.

Образование первой пептидной связи является переходом к следующей стадии - элонгации. Элонгация состоит из серии событий, заключающихся в образовании комплементарных взаимодействий между кодоном в мРНК и антикодоном в составе аа-тРНК в А-сайте рибосомы с дальнейшим образованием пептидной связи и перемещением пептидил-тРНК из А-сайта в Р-сайт, а деацетилированной тРНК из Р-сайта в Е-сайт. При этом происходит транслокация рибосомы на один кодон и удлинение полипептидной цепи на один аминокислотный остаток (см. Andersen a. Nyborg, 2001; Andersen et ah, 2003; Nilsson a. Nissen, 2005).

Терминация трансляции - это процесс распознавания одного из трех стоп-кодонов (UAA, UGA, UAG), находящегося в рамке считывания на мРНК, приводящий к гидролизу пептидил-тРНК и высвобождению полипептидной цепи. Распознавание стоп-кодона в А-сайте рибосомы осуществляется посредством факторов терминации трансляции I класса (Stansfield et al, 1995; Zhouravleva et al, 1995). Оно определяется образованием межмолекулярных взаимодействий между рибонуклеотидами стоп-кодона в мРНК и фактором терминации. Существенную, но не установленную роль в эффективности распознавания стоп-кодонов играют факторы терминации II класса, которые, как предполагается, стимулируют работу факторов терминации I класса (Stansfield et al, 1995; Zhouravleva et al, 1995; см. Inge-Vechtomov et al, 2003).

Завершающим этапом раунда трансляции на мРНК является процесс рециркуляции рибосом, который заключается в подготовке субъединиц рибосомы к новому раунду репликации на этой же или другой мРНК. Этот этап начинается с диссоциации посттерминационного комплекса (состоящего из мРНК со стоп-кодоном, расположенным в А-сайте рибосомы, тРНК и рибосомы) (Kaji et al, 2001; Rajkowitsch et al, 2004; Hirokawa et al, 2006). Диссоциация посттерминационного комплекса у прокариот катализируется белком RRF (от англ. "ribosome recycling factor") вместе с фактором EF-G (Hirokava et al., 2006). В эукариотической модели считается, что в рециркуляции существенную роль играет сближение 3 и 5 - концов мРНК и замыкание мРНК в кольцо за счет взаимодействий, обеспечиваемых, в первую очередь, белком РаЫ и фактором инициации eIF4G (Jacobson a. Peltz, 1996; Gallie, 1998; Kahvejian et al, 2001).

Как и любой матричный процесс, трансляция характеризуется определенным уровнем точности. Снижение точности трансляции может происходить на разных этапах и иметь разные последствия. В частности, неправильно выбранный стартовый кодон на этапе инициации приведет или W к образованию белка, несущего лишние аминокислотные остатки на N-конце или к невозможности синтеза какого-либо белка, если трансляция инициирована в "неправильной" рамке считывания. В ходе элонгации может происходить образование неправильных кодон-антикодоновых пар, приводящее к перекодировкам значащих триплетов и к появлению аминокислотных замен в белке. Наряду с этим, могут иметь место и более грубые ошибки, такие как сдвиг рамки считывания и преждевременная терминация на значащих стоп-кодонах, возникающая в результате спонтанной диссоциации рибосомы с мРНК. Сдвиг рамки считывания, помимо серьезного изменения последовательности аминокислот в белке, с высокой вероятностью также может приводить к преждевременной остановке синтеза белка за счет появления стоп-кодонов в новой рамке считывания (см. Valente a. Kinzy, 2003; Rospert et al., 2005). Известно, что к/частота событий приводящих к преждевременной терминации белкового ( /синтеза и, соответственно, к появлению белков, укороченных с С-конца, достаточно велика, она составляет величину порядка 2x10"4 для бактериальных рибосом (Dong a. Kurland, 1995). На этапе терминации трансляции может происходить ошибочное прочитывание стоп-кодонов как значащих, приводящее к появлению дополнительных аминокислотных остатков на С-конце белка. Очевидно, что такие ошибки также будут существенно влиять на функции синтезированных белков и не могут быть \у нейтральнымтшя клетки. Так, чрезмерно высокий уровень считывания стоп-кодонов приводит к снижению жизнеспособности у дрожжей (Liebman а. Sherman, 1976).

Роль белков цитоскелета в регуляции точности трансляции. Новые функции факторов терминации трансляции

Молекулярный аппарат биосинтеза белка в живых клетках имеет сложнейшую организацию и вовлечен во взаимодействие с множеством факторов различной природы. Оказалось, что важное место в этих взаимодействиях занимают компоненты актинового цитоскелета (Kandl et al, 2002; Valouev et al, 2004; Rospert et al, 2005). Интересно, что изменения, затрагивающие белки цитоскелета, оказывают эффект и на точность трансляции. Так, анализ мутаций в гене, кодирующем актин, выявил, что определенная часть из них приводит к повышению прочитывания стоп-кодонов как значащих (Kandl et al, 2002). Несмотря на то, что конкретные молекулярные механизмы этих эффектов остаются неизвестными, обсуждается возможность того, что центральную роль во взаимодействиях белков цитоскелета с аппаратом трансляции играют полифункциональные белки Sup35 (eRF3) и Sup45 (eRFl). В этой связи интересен тот факт, что С-домен Sup35 проявляет высокую гомологию фактору элонгации трансляции eEFIA, для которого показано участие в формировании цитоскелета (Condeelis, 1995).

Мутации в дрожжевых генах SUP35 и SUP45 помимо омнипотентной нонсенс-супрессии характеризуются наличием многочисленных плейотропных эффектов. К этим плейотропным эффектам относятся: летальность при повышенной и пониженной температуре, полная или частичная неспособность к дыханию, чувствительность к повышенному осмотическому давлению, к аминогликозидным антибиотикам паромомицину и неомицину, зависимость от глутаримидного антибиотика циклогексимида (Инге-Вечтомов, Андрианова, 1970; Андрианова и др., 1973; Миронова, Тер-Аванесян, 1983; Mironova et al, 1982; Ter-Avanesyan et al, 1982). Инактивация этих генов приводит к остановке клеточного цикла на стадии Gl (Kikuchi et al, 1988; Борхсениус и Инге-Вечтомов, 1997). Снижение уровня экспрессии генов SUP35 и SUP45 или их частичная мутационная инактивация приводит к нарушению расхождения хромосом в митозе (Borchsenius et al, 2000), к серьезным изменениям в структуре актинового цитоскелета и веретена деления и, как следствие, к нарушениям кариокинеза (Valouev et al, 2002). Недавно было показано, что eRFl взаимодействует с легкой цепью миозина - белком Місі и влияет на цитокинез (Valouev et al, 2004).

Дополнительные подтверждения функциональной связи между цитоскелетом и терминацией трансляции получены при анализе белков Slal и Sla2, вовлеченных в сборку актиновых филаментов. С помощью двугибридной системы обнаружено, что белок Slal взаимодействует с N-терминальным доменом белка Sup35 (Bailleul et al, 1999). He менее интересен второй белок - Sla2, который помимо своих функций в организации цитоскелета клетки, влияет на стабильность мРНК (Zuk et al, 1999).

Предполагается, что факторы терминации взаимодействуют с белками цитоскелета с целью обеспечения компартментализации процесса трансляции (Borchsenius et al, 2000).

Прогресс в изучении механизмов трансляции за последние годы показывает, что списку факторов, влияющих на точность трансляции, предстоит только расширяться. Не так давно в клетках млекопитающих был обнаружен механизм регуляции точности трансляции посредством микроРНК (Valencia-Sanchez et al, 2006). Предполагается, что короткие (около 21 нуклеотида) РНК, кодируемые приблизительно 4% генов человека, могут регулировать трансляцию 30% различных мРНК за счет взаимодействий с З -нетранслируемой области мРНК (Berezikov et al, 2005; Lewis et al, 2005; Xie et al, 2005). Этот механизм, получивший название трансляционной репрессии, интенсивно изучается в последние годы (Valencia-Sanchez et al, 2006). Интересно, что совсем недавние исследования показали связь между трансляционной репрессией, осуществляемой посредством коротких РНК, и уровнем прочитывания стоп-кодонов (Petersen et al, 2006). У дрожжей, однако, такой механизм регуляции, по-видимому, отсутствует.

Немаловажное значение, определяющее будет ли прочитан определенный стоп-кодон как значащий или нет, играет нуклеотидный контекст (Kopelowitz et al, 1992; Buckingham, 1994; Bonetti et al, 1995; Phillips-Jones et al, 1995). Многочисленные исследования, проведенные на различных модельных объектах (Е. coli, клетки млекопитающих, дрожжи), помогли установить роль 3 и 5 -окружения стоп-кодона в стимулировании, или наоборот, ослаблении терминации на нем. В частности, на дрожжах было показано, что достаточно важную роль для терминации играют нуклеотиды, идущие непосредственно после стоп-кодона, причем эта зона может достигать 6 нуклеотидов после нонсенса (Namy et al, 2001).

Среди белков, влияющих на уровень прочтения стоп-кодонов при сверхпродукции, был выявлен белок Stu2, который является компонентом полярного тела веретена и контролирует динамику сборки микротрубочек (Namy et al, 2002). Еще один белок с неизвестными функциями Ittl, предположительно вовлеченный в регуляцию транскрипции, взаимодействует с белками eRFl и eRF3 и вызывает нонсенс-супрессию при сверхэкспрессии (Urakov et al, 2001).

Молекулярно-генетические и биохимические методы

В работе использовались стандартные методы молекулярной генетики и биохимии: рестрикционный анализ, гель-электорофорез, выделение плазмидной и тотальной ДНК из E.coli и дрожжей, амплификация фрагментов хромосомной ДНК методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) (Sambrook et al, 1989; Kaiser et al, 1994). Трансформацию E.coli проводили в соответствии с методом Иноу (Inoue et al, 1990), трансформацию дрожжей - по методу Гица (Gietze/a/., 1992).

Некоторые из использованных в работе методик заслуживают подробного описания: Трансформация штаммов дрожжей центромерной библиотекой генов: В работе была использована дрожжевая геномная библиотека сконструированная на основе вектора YCp50, введение которой в дрожжевые клетки проводили используя метод высокоэффективной трансформации Д. Гица (http://www.umanitoba.ca/faculties/medicine/biochem/gietz/method.html). Средняя эффективность трансформации, оцененная в ходе работы, составляла приблизительно 20 тысяч трансформантов на 1 мкг ДНК библиотеки. Отбор трансформантов проводили на среде SMM-Ura.

Метод спасения аллели:

Для клонирования аллелей гена SUP45, находящихся в хромосоме, использовали метод "спасения аллели" (Гловер, 1988). Для этого дрожжи трансформировали плазмидой pGRS45, линеаризованной по сайту BamHI. Поскольку плазмида pGRS45 несет участки, комплементарные фланговым участкам гена SUP45, разделенные сайтом рестрикции BamHI, то за счет гомологичной рекомбинации и репликации с использованием в качестве матрицы последовательности гена SUP45 в хромосоме, может происходить застраивание бреши в плазмиде. Таким образом, при отборе трансформантов линеаризованной плазмидой pGRS45 можно получить клоны, несущие в составе этой плазмиды копию хромосомной последовательности гена SUP45. Из полученных трансформантов выделяли тотальную ДНК и использовали ее для трансформации штамма DH5a E.coli. Амплифицированные в E.coli плазмиды выделяли стандартными методами и проводили их дальнейший анализ.

Сайт-направленный мутагенез с использованием олигонуклеотидов:

Штаммы, несущие делеции генов HAL3, PPZ1, PPZ2, PPQ1, были получены с помощью сайт-направленного мутагенеза с использованием олигонуклеотидов (Wach et al., 1994; Goldstein a. McCusker 1999; Storici et aL, 2001). Для этого проводили амплификацию фрагментов ДНК с плазмид, несущих различные маркеры, используемые для селекции в дрожжах, с помощью специально подобранных праймеров. 3 -концы таких праймеров комплементарны участкам плазмиды, фланкирующим область селективного маркера, а 5 -концы комплементарны фланговым участкам хромосомного гена, который должен быть удален. В результате амплификации получается кассета, несущая селективный маркер, окруженный короткими (40-50 п.н.) последовательностями, гомологичными фланкирующим последовательностям гена-мишени. Трансформация такой кассетой дает возможность отбора трансформантов, у которых произошла интеграция кассеты в геномную ДНК за счет гомологичной рекомбинации между фланкирующими последовательностями гена-мишени в хромосоме и короткими гомологичными им участками на кассете.

Кассету для делеции гена HALS получали путем амплификации последовательности, несущей гены URA3 и КапМХ, с плазмиды pCORE с использованием праймеров sis2ds и sis2da. Отбор трансформантов, несущих делецию гена HALS, проводили на среде SMM-Ura. Тестирование наличия делеции проводили с помощью ПЦР с праймерами SIS2sense и SIS2anti.

Кассету для делеции гена PPQ1 получали аналогично описанному способу для получения делеции гена HALS, для этого использовали праймеры ppqlds3 и ppqlda3. Тестирование наличия делеции проводили с помощью ПЦР с праймерами ppq-ampa и ppq-amps.

Кассету для делеции гена PPZ1 получали путем амплификации участка плазмиды pFA6-KanMX4, несущего последовательность гена КапМХ, с помощью праймеров pFA6-PPZl-f и pFA6-PPZl-r. Отбор трансформантов осуществляли на среде YAPD с антибиотиком генетицином. Тестирование наличия делеции гена PPZ1 проводили с помощью ПЦР с праймерами PPZ1-detect-f и PPZl-detect-r.

Кассету для делеции гена PPZ2 получали путем амплифицикации участка плазмиды pAG32, несущего последовательность гена HygB, с помощью праймеров pAG32-PPZ2-f и pAG32-PPZ2-r. Отбор трансформантов осуществляли на среде YAPD, содержащей антибиотик гигромицин. Тестирование наличия делеции гена PPZ1 проводили с помощью ПЦР с праймерами PPZ2-detect-f и PPZ2-detect-r.

Идентификация генов, влияющих на фенотипическое проявление и поддержание детерминанта [ISP+]

Мутации в гене SUP35, кодирующем фактор терминации трансляции eRF3, приводят к нарушению точности трансляции; в их присутствии повышается уровень считывания всех трех типов стоп-кодонов как значащих. Идентифицированный в нашей лаборатории нехромосомный эпигенетический детерминант [ISP+] практически полностью нейтрализует эффект мутаций sup35-25 и sup35-10, восстанавливая нарушенную точность трансляции (Волков, 2000).

Антисупрессорный эффект [ISP+] регистрируется при фенотипическом анализе проявления нонсенс-мутаций his7-l(XJAA) и Iys2-87(UGA). После обработки штаммов, несущих детерминант [ISP+], GuHCl происходит элиминация [ISP ] и восстанавливается супрессия нонсенс-мутаций his7-l и lys2-87, характерная для мутантов sup35-25 и sup35-10. Следует отметить, что наряду с индуцированной GuHCl элиминацией детерминанта [ISP+], с невысокой частотой происходит его спонтанная потеря, приводящая к появлению колоний вторичного роста на средах без гистидина и без лизина.

Для выяснения механизмов антисупрессии, имеющей место в клетках, содержащих [ISP+], и установления молекулярной природы этого детерминанта, необходимо идентифицировать гены, от которых зависит возникновение, проявление и наследование в ряду поколений фенотипа [ISP+]. Очевидно, что основными критериями, по которым можно вести поиск таких генов, является (1) влияние на фенотипическое проявление [ISP+], (2) влияние на частоты его спонтанной или индуцированной GuHCl потери, (3) влияние на индукцию этого детерминанта de novo.

Использованный в настоящей работе подход связан с поиском последовательностей, представленных в центромерной дрожжевой библиотеке, внесение которых в штамм [ISP+] влияет на эффективность супрессии нонсенс-мутаций his7-l(UAA) и Iys2-87(UGA), то есть на фенотипическое проявление [ISP+].

Кроме того, с помощью этого подхода мы провели поиск последовательностей, которые не приводят к супрессии нонсенс-мутаций his 7-1 и lys2-87, но влияют на частоту появления колоний вторичного роста на средах без гистидина и без лизина, то есть на стабильность детерминанта [ISP+]. В первом случае мы ожидали идентифицировать гены, увеличение дозы которых (даже незначительное) влиет на проявление [ISP+], а также выявить возможные криптические мутации, необходимые для проявления [ISP ]. Во втором случае - гены, которые влияют на поддержание [ISP+], индуцируя его потерю, будучи представленными более чем в одной копии.

Для трансформации использовали дрожжевую библиотеку генов, клонированных в центромерном векторе YCp50 (см. Материалы и методы). Для перекрытия всего дрожжевого генома с помощью этой библиотеки, необходимо отобрать около 9 тысяч трансформантов (Rose et ai, 1987). Мы отобрали около 80 тысяч трансформантов штамма 4В-П4482 [ISP+] этой библиотекой; отбор проводили на среде SMM-Ura. Для последующего анализа все трансформанты были поделены на две группы приблизительно одинакового объема ( 40 тысяч трансформантов). Первая группа была перепечатана на среду SMM-Ura-His-Lys, то есть анализ фенотипа в этом случае проводился по двум маркерам: his7-1 и lys2-87. Вторая группа трансформантов была перепечатана на среду SMM-Lys-Ura, на которой анализировался эффект в отношении только одного из маркеров - нонсенс-мутации lys2-87. Целесообразность проведения параллельного анализа трансформантов на средах SMM-His-Lys-Ura и SMM

Lys-Ura была обусловлена тем, что таким образом мы получали возможность анализировать их фенотип в условиях как жесткой, так и мягкой селекции. Дело в том, что разница в эффективности нонсенс-супрессии между [ISP+] и [isp ] штаммами наиболее четко проявляется на синтетической среде без лизина, на этой же среде наиболее четко регистрируются и случаи спонтанной потери [ISP+]. Именно поэтому мы ожидали, что на синтетической среде без лизина могут быть выявлены плазмиды, которые не могут быть выявлены в более жестких условиях - на синтетической среде без лизина и гистидина.

В результате анализа первой группы трансформантов мы выявили 3 плазмиды, влияющих на фенотипическое проявление [ISP ]: YCp50-4, YCp50-71, YCp50-73. Трансформация этими плазмидами приводила к появлению прототрофности одновременно по гистидину и по лизину, то есть в этом случае восстанавливалась супрессия обеих нонсенс-мутаций his7-l и lys2-87. В результате анализа второй группы трансформантов было выявлено 6 плазмид, трансформация которыми изменяла фенотип штамма по сравнению с исходным: три из них - YCp50-106, YCp50-107 и YCp50-114, приводили к появлению прототрофности по лизину, оставшиеся три плазмиды - YCp50-l 15, YCp50-165, YCp50-231 повышали частоту появления колоний вторичного роста на среде SMM-Lys-Ura.

Похожие диссертации на Идентификация и характеристика генов, влияющих на поддержание и фенотипическое проявление прионоподобного детерминанта [ISP+], у дрожжей Saccharomyces cerevisiae

Поиск структурного гена нехромосомного детерминанта [ISP+] с помощью скрининга инсерционного банка генов у дрожжей Saccharomyces cerevisiaeРогоза, Татьяна Михайловна

Цис- и транс-действующие факторы, контролирующие экспрессию гена SUP35 дрожжей Saccharomyces cerevisiaeРябинкова Наталья Анатольевна

Генетический контроль координированной регуляции метаболизма основных биогенных элементов у дрожжей Saccharomyces cerevisiaeСамбук Елена Викторовна

Изучение регуляции синтеза фосфатаз у дрожжей Saccharomyces cerevisiae Самбук Елена Викторовна

Молекулярно-генетическая характеристика супрессорных мутантов по гену SUP35 дрожжей Saccharomyces cerevisiaeШабельская Светлана Васильевна

Генетический анализ роли гликозилфосфатидилинозита в биогенезе клеточной стенки и сворачивании секретируемых белков дрожжей Saccharomyces CerevisiaeФоминов Глеб Вадимович

Прионный детерминант (PSI + ) дрожжей Saccharomyces cerevisiae : Факторы, влияющие на индукцию de novo и поддержаниеКочнева-Первухова Наталья Владимировна

Исследование роли протеинкиназы Pho85p в регуляции метаболизма дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastorisПопова Юлия Георгиевна

Анализ функции гена RAD29/RDH54, контролирующего эксцизионную репарацию оснований у дрожжей Saccharomyces cerevisiaeЛатыпов Виталий Феликсович

Нонсенс- и миссенс-мутации в жизненно-важном гене SUP45 дрожжей Saccharomyces CerevisiaeМоскаленко Светлана Евгеньевна