Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Генетический контроль метаболизма углерода, азота и фосфора у дрожжей Saccharomyces cerevisiae (Обзор литературы) 17
1.1. Генетические механизмы регуляции метаболических путей и принципы построения регуляторных моделей у эукариот 17
1.2. Метаболизм углерода и генетические механизмы, обеспечивающие адаптацию клеток дрожжей S. cerevisiae к наличию и отсутствию глюкозы в среде 20
1.2.1. Транспорт глюкозы и пути переноса сигнала о наличии глюкозы в среде 22
1.2.1.1. Семейство генов НХТ и регуляция их транскрипции 22
1.2.1.2. Система мембранных рецепторов глюкозы, взаимодействующих с ГТФ - связывающими белками 27
1.2.2. Генетический контроль глюкозной индукции генов, кодирующих ферменты гликолиза 29
1.2.3. Генетический контроль регуляции глюкозной репрессии 32
1.2.3.1 .Репрессор Miglp 35
1.2.3.2. Структура и функции регуляторного комплекса SNF1 37
1.2.3.3. Регуляция экспрессии гена ADH2, кодирующего структуру алкогольдегидрогеназы 40
1.2.3.4. Регуляция транскрипции генов, кодирующих ферменты цикла Кребса 42
1.3. Генетический контроль метаболизма азота у дрожжей Saccharomyces cerevisiae 44
1.3.1. Роль источников азота в регуляции продолжительности стадий клеточного цикла у дрожжей S. cerevisiae 44
1.3.2. Центральный путь азотного метаболизма у дрожжей 45
1.3.3. Генетический контроль регуляции основных ферментов азотного метаболизма ...' 47
1.3.3.1. Регуляция транскрипции GLN1 48
1.3.3.2. Регуляция транскрипции GDH1 48
1.3.3.3. Регуляция транскрипции GDH2 49
1.3.3.4. Регуляция транскрипции GLT1 49
1.3.4. Генетический контроль азотной катаболитной репрессии 50
1.3.4.1. Белки-регуляторы азотного метаболизма 51
1.3.5. Пути передачи информации о количестве и качестве источника азота в среде у дрожжей 55
1.3.5.1. Филаментозный рост у дрожжей-сахаромицетов - как примергенетического контроля формирования адаптивных модификаций 56
1.3.5.2. Система, воспринимающая пищевые сигналы (SPS) 60
1.3.5.3. Дискриминационный путь 61
1.3.6. Генетический контроль утилизации пролина 63
1.4. Генетический контроль метаболизма фосфора у дрожжей S. cerevisiae 65
1.4.1. Метаболизм фосфора у дрожжей 65
1.4.2. Биохимическая характеристика КФ 67
1.4.3. Генетический контроль регуляции кислых фосфатаз дрожжей ПГЛ 68
1.4.3.1. Генетический контроль синтеза КФ 1 69
1.4.3.2. Генетический контроль синтеза КФ2 и КФЗ 69
1.4.4. Механизмы мембранного транспорта Ф„ у дрожжей 73
1.4.5. Пути передачи сигнала о концентрации фосфата 75
1.4.6. Регуляторные белки регулонаРНО 76
1.4.6.1. Позитивные регуляторы 76
1.4.6.2. Негативные регуляторы 82
1.4.6.3. Модель регуляции экспрессии генов регулона PHO 88
Глава II. Материалы и методы
2.1. Основные обозначения 92
2. 2. Основные штаммы и условия их культивирования 93
2. 2.1. Штаммы и плазмиды 93
2. 2. 2. Условия культивирования штаммов 94
2.3. Методы
2.3.1 .Генетические методики 98
2.3.2. Биохимические методики 98
2.3.2.1 . Определение активности кислых фосфатаз 98
2.3.2.2. Качественное определение уровня гликогена 98
2.3.2.3.Определение активности р - галактозидазы у дрожжей 99
2.3.2.4. Приготовление экстракта белков дрожжей S. cerevisiae 99
2.3.2.5. Гибридизация белков с фрагментом промотора гена СІТІ 99
2.3.2.6. Выделение и очистка тропомиозина в составе фракции
термостабильных белков 100
2.3.3. Цитологические методики
2.3.3.1. Визуализация митДНК с помощью DAPI 101
2.3.3.2. Окраска дрожжей родамин - фаллоидином 101
2.3.3.3. Получение и обработка цифровых изображений 102
2.3.4. Молекулярно-биологические методики
2.3.4.1. ПЦР с праймерами к гену РН085 102
2.3.4.2. Секвенирование фрагментов ДНК 103
2.3.5. Статистическая обработка результатов 103
Глава III. Результаты и обсуждение
3.1. Структурно-функциональная характеристика киназы Pho85p и генетический анализ плейотропных эффектов мутаций pho85 104
3.1.1. Установление аллельности генов АСР82 и РН085 104
3.1.2. Фенотипическая характеристика мутантов pho85 105
3.1.3. Структурно -функциональный анализ мутаций pho85 106
3.1.4. Поиск генов, кодирующих шапероны комплекса Pho85p-Pho80p 108
3.1.4.1. Генетический анализ спонтанных супрессорных мутаций, подавляющих проявление pho85-3 и pho85- 7 110
3.1.4.2. Рекомбинационный тест мутаций DSP 113
3.1.5. Генетический анализ плейотропных эффектов мутаций pho85 115
3.1.5.1. Генетическая нестабильность ядерного и митохондриального геномов - новый плейотропный эффект мутаций pho85 121
3.1.5.1.1. Определение количества генов, в которых возникают мутации ts на фоне дизрупции гена РН085 123
3.1.5.1.2. Влияние дизрупции гена РН085 на распределение митохондриальных нуклеоидов между материнской клеткой и почкой 126
3.1.5.1.3. Влияние дизрупции РН085 на структуру цитоскелета 127
3.1.5.1.4. Влияние дизрупции РН085 на спектр термостабильных белков 130
3.2. Поиск регуляторних путей, связывающих метаболизм азота и фосфора у дрожжей 139
3.2.1. Изучение роста мутантов pho на средах с различными источниками азота 139
3.2.2. Генетический анализ признака Pro" - "неспособность к утилизации пролина" 140
3.2.3. Влияние мутаций pho85 на транспорт пролина 141
3.2.4. Влияние мутаций pho4 на рост pho85 мутантов на среде с пролином 144
3.2.5. Анализ нуклеотидных последовательностей промоторов генов катаболизма пролина 145
3.3. Поиск регуляторних путей, связывающих метаболизм углерода и фосфора у дрожжей S. cerevisiae 148
3.3.1.Определение зависимости экспрессии гена СІТІ от концентрации фосфата и дизрупции гена РН085 149
3.3.2 Поиск белков, взаимодействующих с областью промотора гена СІТІ, ответственной за глюкозную репрессию 151
3.4. Зависимость экспрессии гена HSP82, кодирующего структуру белка-шаперона от концентрации фосфата в среде и мутаций в генах
РНО 158
3.4.1. Получение изогенных CSG55 штаммов с мутациями в генах РНО и их генетический анализ 161
3.4.2. Влияние концентрации фосфата и мутаций в генах РНО на транскрипцию HSP82 162
3.5. Идентификация ортолога гена РН085 дрожжей Pichia pastoris 168
3.5.1. Получение штаммов с дизрупцией гена РН085 у дрожжей P. pastoris 169
3.5.2. Изучение фенотипического проявления дизрупции в гене РН085Рр 171
3.5.3. Изучение функций ортологов Pho85p у представителей разных эволюционных групп 173
Глава IV. Роль фосфопротеинкиназ Pho85p, Snflp, Torl,2 в реализации закона лимитирующего фактора у дрожжей (Заключение) 182
4.1. Координация метаболизма в ответ на лимитирующий фактор 185
4.1.1. Координация метаболизма при азотном голодании 186
4.1.1.2. Изменения метаболизма углерода в ответ на недостаток азота 187
4.1.1.3. Недостаток азота и метаболизм фосфора 188
4.1.2. Координация метаболизма при недостатке источника углерода 189
4.1.2.1. Глюкозное голодание и метаболизм азота 190
4.1.2.2. Глюкозное голодание и метаболизм фосфора 191
5.1.3. Координация метаболизма при недостатке фосфора 192
5.1.3.1. Недостаток фосфата и метаболизм азота 193
5.1.3.2. Недостаток фосфата и метаболизм углерода 193
5.2. Влияние лимитирующего фактора на клеточный цикл 195
5.3. Лимитирующий фактор и его роль в формировании « адаптивных» мутаций 198
Выводы 202
Список литературы
- Генетические механизмы регуляции метаболических путей и принципы построения регуляторных моделей у эукариот
- Определение активности кислых фосфатаз
- Структурно-функциональная характеристика киназы Pho85p и генетический анализ плейотропных эффектов мутаций pho85
- Координация метаболизма в ответ на лимитирующий фактор
Введение к работе
Актуальность исследования. Изучение генетических механизмов, лежащих в основе координированной регуляции метаболизма основных биогенных элементов, является фундаментальной проблемой биологии. Ее решение позволит подойти к пониманию принципов, лежащих в основе самоорганизации живых систем и регуляции адаптивной нормы клетки.
Совокупность биохимических реакций в отдельной клетке и в многоклеточном организме обеспечивает постоянство внутренней среды -гомеостаз. Именно гомеостаз является одной из причин стабильности фенотипа. Его поддержание гарантируется генетическими и биохимическими механизмами, возникшими в ходе эволюции.
Важную роль в поддержании гомеостаза играют системы регуляторных сетей, координирующих сигналы, поступающие из внешней среды, с ответом клетки, который выражается в дифференциальной активности генов, корректировке скорости биохимических реакций, высокой или замедленной скорости клеточных делений, повышении или понижении частоты спонтанных мутаций, развитии или программированной гибели организма. Координированный ответ на внешние воздействия ведет к формированию адаптивных модификаций, «реакции клеток и организма на изменения условий среды, которые неоднократно действовали на организм в ходе эволюции. Все они в пределах нормы реакции, заданной генотипом» (Инге-Вечтомов, 1989).
Проблема координированного ответа живых организмов на изменение характера питания издавна привлекает внимание исследователей. В 1840 году Юстус Либих открыл закон лимитирующего фактора: "Веществом, находящимся в минимуме, управляется урожай и определяется величина и устойчивость последнего во времени" (цит. по Одум, 1975). Этот закон широко используется в экологических и агрохимических исследованиях, а в настоящее время особенно актуален в промышленной микробиологии - в
11 связи с развитием производства гетерологичных белков генетически модифицированными микроорганизмами.
Согласно закону, если в среде не хватает нескольких компонентов, лимитирующим является только одно вещество. Таким образом, именно один лимитирующий фактор контролирует в данный момент практически все стороны жизнедеятельности организма и направляет работу многих генных сетей. Сигнал о лимитирующем факторе должен быть воспринят всеми возможными мишенями, и метаболизм клетки соответствующим образом скорректирован.
Важнейшую роль в передаче информации об изменении состава среды играют фосфопротеинкиназы и фосфатазы, так как именно они обеспечивают быстрый ответ клетки, не требующий синтеза белка de novo. Дополнительной возможностью для координированной экспрессии ключевых генов разных метаболических путей является вовлечение в их регуляцию различных транскрипционных факторов, что обеспечивает тонкую корректировку уровня транскрипции в зависимости от потребностей клетки. Механизмы, координирующие ответ на лимитирующий фактор, в настоящее время изучены недостаточно.
Дрожжи Saccharomyces cerevisiae являются наиболее подходящим объектом для изучения координированной регуляции метаболизма. Прекрасная генетическая изученность и доступность полной последовательности генома дрожжей предоставили уникальную возможность развития системного подхода, позволяющего понять, как действие и взаимодействие генов в геноме обеспечивают интегральный ответ клетки дрожжей на внешний фактор. В последние годы были развиты методы направленного генерирования мутаций (Delneri et ah, 2001) и созданы новые технологии, позволяющие анализировать уровень всех иРНК организма (транскриптом), всех белков (протеом) и низкомолекулярных промежуточных соединений (метаболом). Использование сложных компьютерных программ для обработки различных баз данных позволяет
понять структуру метаболических путей, рассчитать скорость потока метаболитов (Stafford a. Stephanopoulos, 2001), а также получать графические изображения генных и белковых взаимодействий.
Углерод, азот, кислород и фосфор - важнейшие элементы, используемые клеткой для производства биологических молекул. Недостаток любого из компонентов среды ведет к накоплению клетками гликогена и трегалозы, нарушению морфологии клеток, переходу их в стадию Go, резкому снижению количества рибосом, споруляции (Ferea et al, 1999; Konopka, 2000). Эти изменения можно рассматривать как адаптивную модификацию, реакцию на голод вообще, в основе которой лежит дифференциальная активность генов. Регуляция общего ответа осуществляется при участии протеинкиназы A (Roosen et al, 2005).
Наряду с общим ответом дрожжи формируют и специфический ответ, который определяется природой соответствующего компонента среды. Ведущую роль в этом случае играют специфические для каждого метаболического пути фосфопротеинкиназы - Snflp, Torl,2p, Pho85p (Schuller et al, 2003; Ter Schure et al, 2000; Oshima, 1997).
В настоящей работе был предпринят поиск генетических механизмов, координирующих ответ различных метаболических путей на лимитирующий фактор и управляющих формированием адаптивных модификаций.
Моделью, позволившей выявить связи между различными метаболическими путями, послужила кислая фосфатаза (КФ) дрожжей. Неспецифические КФ относятся к гидролитическим ферментам (фосфомоноэстеразам) и расположены в периплазматическом пространстве клетки. При взаимодействии с фосфоорганическими соединениями КФ расщепляют эфирную связь и высвобождают Ф„ (Boer a. Steyn-Parve, 1966; 1970).
Идея использовать КФ в качестве модели для изучения механизмов регуляции у дрожжей S. cerevisiae была выдвинута на кафедре генетики и селекции Ленинградского университета М.Н.Смирновым в 70-е годы
прошлого века. С тех пор эта модель чрезвычайно популярна во многих лабораториях мира и в настоящее время является одной из самых изученных в генетическом отношении. В лаборатории биохимической генетики Биологического НИИ СПбГУ были изучены физико-химические свойства КФ (Падкина и др., 1974; Краснопевцева и др., 1979) и создана большая коллекция мутантов в регуляторных и структурных генах РНО, что и послужило основой для выполнения данной работы (Смирнов и др., 1974; Тер-Аванесян и др., 1974; Кожин, Самсонова, 1975; Самсонова и др., 1975).
Одним из подходов, который использовали в данной работе, стал анализ плейотропных эффектов мутаций в регуляторных генах, а также поиск новых мишеней регуляторных молекул системы РНО.
Цель и задачи работы. Целью наших исследований являлось изучение генетического контроля координированной регуляции метаболизма основных биогенных элементов у дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
Основной задачей было выявление ключевых регуляторных факторов, способных функционировать в различных системах клетки и обеспечивать тонкую корректировку метаболизма и других процессов.
Поскольку в работе в качестве основного инструмента использовали систему регуляции репрессибельных КФ, то претендентами на роль белков, координирующих различные метаболические и клеточные процессы, явились регуляторные белки Pho4p и Pho85p. Идентификация новых мишеней этих регуляторных молекул позволила оценить их вклад в координированную регуляцию метаболизма углерода и азота, а также в поддержание стабильности генома.
Необходимым этапом работы явилась подробная характеристика циклинзависимой фосфопротеинкиназы (CDK- Cyclin Dependent Kinase) Pho85p, так как к началу нашей работы об ее функциях было известно очень мало. Это потребовало изучения плейотропных эффектов мутаций pho85, что привело к выявлению нового плейотропного эффекта - генетической
нестабильности - ядерной и митохондриальной, вызванной такими мутациями.
Кроме того, задачей наших исследований являлся поиск и ортолога гена РН085 у дрожжей Pichia pastoris, широко используемых в биотехнологии и фенотипическая характеристика мутаций в этом гене.
Научная новизна состоит в том, что экспериментально установлено, что сигнальная трансдукция является связующим звеном в координации различных метаболических процессов и формировании модификационных и наследственных изменений в клетке.
Использование модели регуляции КФ дрожжей - сахаромицетов позволило впервые продемонстрировать важную роль циклин-зависимой фосфопротеинкиназы Pho85p и активатора Pho4p в координации экспрессии генов различных метаболических путей и осуществлении связи метаболизма фосфора, азота и углерода.
Впервые показано, что белки Pho85p и Pho4p участвуют в глюкозной катаболитной репрессии гена СІТІ, кодирующего цитратсинтазу -первый и лимитирующий фермент цикла Кребса (Падкина и др., 2003).
Установлено влияние мутаций в генах РН085 и РН04 на катаболизм пролина, и, тем самым, впервые продемонстрирована генетическая связь между метаболизмами фосфора и азота (Попова и др., 2000).
Выявлен важный плейотропный эффект мутаций в гене РН085 -повышенная генетическая нестабильность митохондриального и ядерного генома, что указывает на роль Pho85p в поддержании стабильности генетического материала клетки (Самбук и др., 2003; Самбук и др., 2005).
Продемонстрировано влияние недостатка фосфата и мутаций в генах РНО на уровень экспрессии гена HSP82, кодирующего белок семейства Hsp90 (Самбук и др., 2002). Известно, что эти белки играют важную роль в формировании буферной системы, канализирующей процессы
развития у эукариот и нарушение их функций выявляет скрытые ресурсы изменчивости.
Проведен анализ последовательности ДНК pho85 у мутантов
коллекции, что позволило идентифицировать мутации, приводящие к
нарушению фолдинга киназы. Изучение спонтанных супрессоров
мутаций pho85-7 и pho85-3 выявило доминантные супрессоры, тесно
сцепленные с геном РН085, предположительно возникающие в гене
EGD1, кодирующем структуру белка - шаперона (Самбук и др., 2003).
Впервые идентифицирован ортолог гена РН085 у дрожжей Pichia pastoris и изучены плейотропные эффекты мутаций в этом гене (Падкина и др., 1998).
Предложена модель регуляции координированного ответа клетки на лимитирующий фактор и формирования адаптации в ответ на голодание по одному из лимитирующих факторов (Самбук, 2005).
Теоретическое и практическое значение работы Работа вносит существенный вклад в понимание механизмов координированной регуляции метаболизма и выявляет важную роль фосфорилирования белков в этом процессе. Полученные данные убедительно демонстрируют наличие генетической инфраструктуры в регуляции адаптивной нормы клетки и позволяют предложить возможный механизм ее реализации. Работа открывает новые перспективы для дальнейших исследований в этой области. Результаты работы использованы при составлении магистерской программы «Молекулярная и медицинская биотехнология» на биолого-почвенном факультете, в практикумах и лекционных курсах, а также при выполнении исследовательских работ бакалаврами, магистрами, аспирантами биолого-почвенного факультета. Штаммы Pichia pastoris, созданные в данной работе, использовали для получения продуцентов биологически важных фармацевтических препаратов.
16 Положения, выносимые на защиту
Выбор клеткой стратегии ответа на лимитирующий фактор определяется конкуренцией между фосфопротеинкиназами, контролирующими метаболические пути. При этом общий ответ на голодание инициируется специфическим ответом.
Тонкая корректировка экспрессии генов, кодирующих ферменты различных метаболических путей, осуществляется регуляторными белками системы, соответствующей лимитирующему фактору.
Генетические механизмы регуляции метаболических путей и принципы построения регуляторных моделей у эукариот
Выяснение последовательности биохимических реакций и механизмов регуляции метаболизма стало возможным благодаря сочетанию генетического и биохимического подходов, а также использованию микроорганизмов в качестве объекта исследований.
Первые работы в области биохимической генетики микроорганизмов были выполнены в 40-х годах прошлого века на Neurospora crassa и связаны с именами Д. Бидла и Э. Тэйтума. Итогом проведенных экспериментов с ауксотрофными мутантами стала гипотеза "один ген - один фермент" (цит. по Айала, Кайгер, 1988). Первоначально основное внимание исследователей было сосредоточено на изучении процессов регуляции метаболизма у бактерий, благодаря чему и были выяснены принципы координированной регуляции генов отдельных метаболических путей.
У бактерий гены, кодирующие ферменты одного метаболического пути, как правило, сцеплены. Ф. Жакобом и Ж. Моно была предложена модель, согласно которой, совокупность структурных генов, с прилегающей к ним регуляторной областью, образуют оперон (Jacob a. Monod, 1961). Регуляция оперона осуществляется на уровне транскрипции при участии факторов позитивного и негативного контроля, при этом все гены оперона транскрибируются на одну мРНК. Таким образом, организация оперона обеспечивает координированную репрессию или индукцию всех генов определенного метаболического пути.
Дальнейшее изучение механизмов регуляции у бактерий выявило новые, более сложные уровни координации метаболизма. Несколько оперонов, регулируемых общим регуляторным белком и его лигандом эффектором, формируют регулоны. Регулоны делятся на глобальные и локальные. В состав глобальных регулонов входят опероны, гены которых участвуют в более чем одном метаболическом пути, тогда как локальные регулоны контролируют один процесс (Калинин, 2001).
Совершенно очевидно, что эукариотическая клетка. гораздо сложнее бактериальной и, естественно, что регуляция метаболизма осуществляется не только на уровне транскрипции, но и на всех этапах реализации генетического материала. Кроме того, у эукариот обособление отдельных метаболических путей и упорядочение процессов регуляции достигается образованием морфологических компартментов, между которыми распределяются различные функции клетки. Компартменты обеспечивают неслучайное распределение молекул и разобщение анаболических и катаболических путей. Мультиэнзимные комплексы являются молекулярными компартментами, которые защищают промежуточные продукты метаболизма определенного пути от разрушения другими ферментами и сокращают время протекания биохимических реакций (Rappsilbere/a/.,2000).
В основу первых регуляторных моделей эукариот легли принципы и критерии позитивного и негативного контролей, выработанные для моделей лактозного, триптофанового и гистидинового оперонов Е. coli (Douglas, Hawthorne, 1964). Несмотря на то, что в некоторых системах были обнаружены кластеры структурных генов: DAL1-DAL4-DAL2 (Cooper а. Lawther, 1974), GAL7-GAL10-GALI (Douglas, Hawthorne, 1964) у дрожжей и prnA-prnD-prnB-prnC у аспергилла (Arst, McDonald, 1975), гены одного метаболического пути у эукариот разбросаны по геному, что и определяет сложность механизмов координированной регуляции, которая зависит от наличия идентичных последовательностей ДНК в промоторных областях генов для связывания белков активаторов или репрессоров.
Традиционно для изучения генетического контроля регуляции метаболизма используется несколько подходов.
Первый заключается в отборе мутантов по большому числу генов, структурных и регуляторных, контролирующих определенный путь метаболизма, и анализе их взаимодействия. Мутации в структурных генах, кодирующих ферменты метаболического пути, рецессивны и приводят к отсутствию активности только одного фермента. Мутации в структурных генах эпистатируют проявление мутаций в регуляторных генах. Мутации в регуляторных генах, обеспечивающих позитивную регуляцию, как правило, обладают плейотропными эффектами и могут приводить к одновременному исчезновению активности нескольких ферментов данного метаболического пути. В таких генах возникают как рецессивные, приводящие к отсутствию активности ферментов, так и доминантные конститутивные мутации. Мутации, приводящие к конститутивной экспрессии соответствующих структурных генов, возникают в генах, осуществляющих негативный контроль. Такие мутации могут быть рецессивными или доминантными, однако для их фенотипического проявления обязательным условием является наличие нормальных аллелей структурных генов. Как правило, мутации в генах позитивного контроля эпистатируют проявление мутаций конститутивного синтеза. Изучение комбинаций различных мутаций позволило строить модели каскадной регуляции экспрессии генов. На первом этапе исследования механизмов регуляции метаболизма у эукариотических микроорганизмов, таких как дрожжи, аспергилл и нейроспора, эти модели были весьма популярны (Douglas, Hawthorne, 1964; Arst, McDonald, 1975).
Определение активности кислых фосфатаз
На поверхности чашек с выросшими культурами накладывали бумажные фильтры (плотные медленнофильтрующие, для тонких осадков), смоченные раствором субстрата а-нафтилфосфата в концентрации 2 мг/мл и красителя синего прочного Б в концентрации 4 мг/мл в 0, 05 М цитратном буфере (рН 3, 7 или 4,5). Значение рН буфера соответствовало оптимуму рН определяемой фосфатазы. Через 15 минут учитывали интенсивность окрашивания. В течение этого времени кф, локализованные на поверхности клеток отщепляют от субстрата а-нафтилфосфата фосфат. Получившийся в результате реакции а-нафтол образует с синим прочным Б соединение фиолетового цвета. Интенсивность окраски отражает активность кф (Самсонова, 1980).
Колонии дрожжей обрабатывали парами спиртового раствора иода в течение 2 мин. При наличии высокого уровня гликогена колонии окрашиваются в темно-коричневый цвет (Zurita-Martinez a. Cardenas, 2005).
Определение активности проводили в трех повторностях по методике, предложенной ранее. Активность выражали в единицах Миллера (Миллер, 1976).
Клетки выращивали при 30 на качалке до середины логарифмической фазы роста (А55о=0.4-0.6), собирали центрифугированием, суспендировали в буфере А (50 тМ HEPES, рН 7.5, 50 тМ КС1, 5 тМ ЭДТА, 5% глицерин, 1 тМ ДТТ), добавляли PMSF до конечной концентрации 2 тМ . Клетки разрушали, встряхивая со стеклянными шариками, в течение 3 минут с охлаждением. Неразрушенные клетки и клеточные оболочки удаляли центрифугированием (7000 об/мин, 20 мин). Из супернатанта проводили дробное осаждение белков сульфатом аммония. Осадки собирали центрифугированием (20 000 об/мин, 20 мин) и диализовали против буфера А. Определение концентрации белка проводили по методу Брадфорд (Bradford, 1981). Электрофоретическое разделение белков осуществляли в 8% ПААГ в присутствии ДСН натрия (Hubscher, 1987).
После проведения электрофореза гель помещали на 15 мин. в буфер для ренатурации (4М мочевина, ЮмМ Трис-HCl, рН 8,0,20 мМ ЭДТА), затем на 15 мин. в буфер для переноса (25мМ Трис- НС1, 190мМ глицин, рН 8,3, 20% метанол). Электроперенос белков выполняли в течение 4 часов при напряжении 30-40V. Нитроцеллюлозный фильтр с иммобилизованными белками использовали в реакции гибридизации с ДНК и параллельно окрашивали 5 минут в растворе 0.5% амидошварца в 40% метаноле с 10% уксусной кислотой.
В качестве зонда для гибридизации, использовали равномерно меченый фрагмент промотора гена СІТІ, полученный в результате ГЩР, при этом смесь dNTP включала Р дезоксицитозинтрифосфат.
Белки, иммобилизованные на нитроцеллюлозном фильтре, инкубировали в течение ночи при 4 в буфере для гибридизации: ЮмМ HEPES, рН 7.9, 50мМ NaCl, О.ІмМ ЭДТА, ЮмМ MgCl, 1мМ ДТТ, 10% глицерин, 5% сухое обезжиренное молоко ("Carnation"). Далее фильтр переносили в 5 мл связывающего буфера того же состава за исключением сухого молока, добавляли фрагмент промотора гена СІТІ (Р ), poly (dl-dC) в концентрации 1 мг/мл и проводили реакцию гибридизации при комнатной температуре 1 час. Фильтры дважды отмывали в 50 мл буфера для гибридизации без ДНК, подсушивали и проявляли.
Структурно-функциональная характеристика киназы Pho85p и генетический анализ плейотропных эффектов мутаций pho85
Коллекция мутантов, синтезирующих КФ конститутивно, у дрожжей ПГЛ была получена М. Г. Самсоновой. Среди рецессивных мутантов были идентифицированы мутанты аср82 (Самсонова и др., 1980). Однако тест на аллелизм генам РНО саке-линий дрожжей не проводили.
Используя штамм 1-GRF18 в качестве исходного, мы получили коллекцию рецессивных мутантов, синтезирующих КФ конститутивно и аллельных аср82. Один из них C21-1-GRF18 был использован в экспериментах по картированию гетАСР82.
Предварительные эксперименты по индукции потерь хромосом у диплоидов, гетерозиготных по мутации аср82-21 и маркерам различных хромосом, при выращивании на среде с беномилом позволили предположить, что ген АСР82 может быть локализован в XVI хромосоме (из-за недостаточно большого объема выборки данные не приводятся).
Для уточнения локализации этого гена было изучено расщепление гибрида Д469 (c21-l-GRF18 х 4-Д466), генотипы штаммов представлены в табл.3. Так как фертильность диплоида была низкой (58,6%), для определения сцепления генов был использован диадный анализ, который в отличие от случайной выборки аскоспор позволяет определить сцепление не только генов, но и генов с центромерами (Захаров, Мацелюх, 1986). Оказалось, что гены АСР82 и RAD1 сцеплены (67P:2N:33T; %2 =178,31; Р ш 0,05). Расстояние между ними составляет 22,14 стрейнов или 22,06 сантиморганов. Ген RAD1 локализован в правом плече XVI хромосомы и сцеплен с центромером (Mortimer a. Schield, 1980). Для установления порядка расположения генов АСР82 и RAD1 относительно центромера был проведен анализ индуцированной УФ митотической рекомбинации диплоида 38-Б-П2156 х 59-Д437 (RADI АСР82 х radl-l аср82). Анализ частот митотической рекомбинации показал, что среди 53 гомозигот аср82/аср82 гомозиготы radl/radl (30) составили 56,6%, что позволило сделать вывод о том, что гены расположены в следующем порядке: центромер - RAD1-ACP82. (Самбук и др., 1991).
Следует отметить, что ген РН085 бьш картирован в правом плече XVI хромосомы (Gilliquet et al., 1990). Фенотип мутантов pho85 и аср82, а также их локализация позволили сделать вывод об идентичности генов РИ085 и АСР82.
Фенотипическая характеристика мутантов pho85 Штаммы сЗ-, с7-, с21- 1-GRF18, несущие рецессивные мутации в гене РН085, а также штамм cl0-l-GRF18, несущий мутацию в гене РИО80, были получены с помощью ЭМС (Самбук и др., 1991). У мутантов оценивали активность КФ в условиях репрессии фосфатом и способность расти на средах, содержащих в качестве источника углерода этанол или глицерин, а также рост при 37С (табл.4). В качестве контроля приведен исходный mraMMl-GRF18(p/ioi). Таблица 4.
Как видно, в отличие от исходного штамма и мутанта pho80-10, все мутанты pho85 плохо растут при 37С (Ts), а сЗ- и с7- 1-GRF18, кроме того, не растут на среде с этанолом и глицерином в качестве источника углерода, что не противоречит данным, полученным в отношении мутантов pho85 в других лабораториях. Следует отметить, что генетический анализ этих признаков для мутантов pho85 в работах зарубежных авторов проведен не был, возможно, вследствие низкой фертильности гибридов (Santos et ah, 1995).
Анализ фенотипических проявлений мутантов pho85, полученных с помощью химического мутагенеза, выявил их различия. Для характеристики мутаций pho85 -3, -7, -21 проводили секвенирование фрагментов гена РН085 штаммов сЗ-, с7-, c21-l-GRF18, а также 1-GRF18, амплифицированных с помощью ПЦР. Сравнение нуклеотидной последовательности амплифицированного фрагмента гена РН085 штамма 1-GRF18 с последовательностью гена РН085, представленной в базе данных Станфордского университета, не выявило отличий (http://www/sdsc.edu/Kinases/pk_home.html).
Координация метаболизма в ответ на лимитирующий фактор
Важную роль в регуляции метаболизма азота у эукариот играют киназы Torlp и Tor2p (Tate a. Cooper, 2003). На среде с хорошим источником азота киназы Тог1,2р активны и фосфорилируют белок Ure2p, который удерживает в цитоплазме активатор генов NCR - Gln3p. Кроме того, киназы Тог1,2р определяют локализацию в цитоплазме комплекса Rtg 1,3 - Mkslp (Tate et al, 2002) (Рис. 42, A).
Голодание по азоту, как и добавление рапамицина, ингибитора киназ Тог1,2р, приводит к распаду комплекса Ure2p-Gln3p и поступлению Gln3p в ядро, что влечет за собой активацию генов NCR (Сох et al, 2004). Так как глюкоза и фосфат не лимитированы, то киназа Snflp неактивна, а циклин-киназный комплекс Pho80p-Pho85p активен и фосфорилирует Pho4p, оставляя его в цитоплазме (рис. 42, Б).
По данным Боера с соавт. при культивировании дрожжей в хемостате в среде с низкой концентрацией сульфата аммония (фосфат и глюкоза не лимитированы) экспрессия 51 гена повышается более, чем в 10 раз, а экспрессия 15 генов - понижается в 10 раз. Активируются гены, кодирующие пермеазы с высоким сродством к субстрату - источнику азота - DUR3 (пермеаза мочевины), DAL4, DAL5 (пермеазы аллонтоина), PUT4 (пермеаза пролина), GAP1 (общая пермеаза аминокислот), а также гены, кодирующие ферменты метаболизма азота и деградации белков. Экспрессия этих генов повышается даже в отсутствие соответствующих индукторов.
Экспрессия генов, кодирующих транспортные белки с высоким сродством к глутамину GNP1, пермеазы лейцина, валина В АР2, гистидина HIP1, глюкозы НХТ2, аквапорины AQY2, YLL053C и пермеазу ионов железа РЕТЗ, снижена более, чем в 10 раз (Boer et al, 2003). Как видно, при недостатке азота происходит значительное усиление транскрипции генов транспорта и катаболизма азота, тогда как реакция генов, кодирующих ферменты других метаболических путей, оказывается не столь очевидной.
В то же время известно, что при аэробном культивировании дрожжей в хемостате в среде с лимитирующей концентрацией азота и избытком остальных компонентов, особенно глюкозы, происходит снижение скорости накопления биомассы, усиливается скорость дыхания и накапливается избыток АТФ (Larsson et al, 1997). Таким образом, очевидно, что недостаток азота влияет как на метаболизм азота, так и на метаболизм углерода (гликолиз и цикл Кребса) и фосфора.
Основным процессом, обеспечивающим клетки дрожжей энергией при росте на глюкозе является гликолиз. В среде с лимитирующей концентрацией азота и избытком остальных компонентов, накапливается избыток АТФ (Larsson et al, 1997). Так как АТФ ингибирует активности фосфофруктокиназы и пируваткиназы, недостаток азота может регулировать активность ферментов гликолиза на посттрансляционном уровне (Larsson et al, 2000). Обнаружен эффект и на уровне транскрипции. Показано, что гены PFK1 и PFK2, кодирующие фосфофруктокиназу, ингибированы при азотном голодании (DeRisi et al, 1997). Генетический механизм ингибирования пока не известен.
Цикл Кребса у дрожжей, растущих на среде с глюкозой, блокирован не полностью. Внутриклеточная концентрация глутамата или глутамина зависит не только от природы источника азота, но и от доступности а-КГ. При росте на глюкозе наблюдается индукция ферментов цикла Кребса, но они используются исключительно для синтеза а-КГ, а не для производства энергии (Liu, Butow, 1999). Низкий уровень азота влияет на транскрипцию генов, кодирующих ферменты цикла Кребса.
При росте в среде с пролином в концентрации 0,005% (источники углерода и фосфора не лимитированы) гены PUT1 и PUT2 активируются Gln3p и обеспечивают продукцию глутамата. В этих условиях значительно усиливается экспрессия гена GLN1, кодирующего глутаминсинтетазу, и полученный глутамат превращается в глутамин, при этом поступление глутамата в цикл Кребса снижается, так как наблюдается сдвиг реакций в сторону синтеза глутамата и глутамина (Kuruvilla et al, 2001).
При росте дрожжей в среде с "хорошим" источником азота (высокая внутриклеточная концентрация глутамата) экспрессия генов PYC1, СІТІ, ACOl, ЮНІ, IDH2, кодирующих ферменты, катализирующие промежуточные стадии синтеза а-КГ, значительно редуцирована. Недостаток источника азота ведет к снижению концентрации глутамата, что является сигналом к активации их транскрипции.
В регуляции экспрессии генов PYC1, СІТІ, ACOl, ЮНІ, ЮН2 глутаматом принимают участие белки-активаторы Rtglp и Rtg3p (Komeilli et al, 2000; Sekito et al, 2000). На среде с хорошим источником азота (среда с глюкозой) Rtglp и Rtg3p локализованы в цитоплазме и образуют комплекс с белком Mkslp (рис.42, А). При переносе на среду с мочевиной или пролином эти белки транспортируются в ядро, что приводит к немедленной экспрессии контролируемых ими генов (Sekito et al, 2000)(рис.41, Б). Делеция MKS1 приводит к пятикратному повышению уровня цитратсинтазы Citlp. Мутации rtgl и rtg2 приводят к отсутствию индукции генов PYC1, СІТІ, ACOl, ЮНІ, ЮН2 и к ауксотрофности по глутамату. Восстановление роста мутантов rtg2 на среде без глутамата происходит за счет мутаций в гене MKS1 (Dilova et al, 2002; Sekito et al, 2002). Известно, что в передаче сигнала о голодании по азоту к Rtglp/Rtg3p принимают участие и Torl,2p (Tate et al, 2002). Таким образом, гены, кодирующие ферменты метаболизма углерода, способны воспринимать сигналы о недостатке источника азота в среде с помощью сигнального пути, вовлекающего Torl,2p .
![Идентификация и характеристика генов, влияющих на поддержание и фенотипическое проявление прионоподобного детерминанта [ISP+], у дрожжей Saccharomyces cerevisiae](/i/i/4278/150135.png "Идентификация и характеристика генов, влияющих на поддержание и фенотипическое проявление прионоподобного детерминанта [ISP+], у дрожжей Saccharomyces cerevisiae Аксенова Анна Юрьевна")
