Содержание к диссертации
Введение
Г л а в а I. МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ МЕТАБОЛИЧЕСКИХ ПУТЕЙ У ДРОЖЖЕЙ (Обзор литературы)
1. Введение 8
1.1. Организация кластеров у дрожжей 10
1.2. Генетический подход к изучению
метаболизма у дрожжей 17
2. Регуляция утилизации галактозы 19
2.1. Генетический контроль утилизации галактозы .... 19
2.2. Механизмы регуляции утилизации галактозы .... 22
2.3. Влияние катаболитной репрессии на
утилизацию галактозы 29
3. Регуляция метаболизма инвертазы 32
4. Регуляция метаболизма аргинина 36
5. Постановка задачи 46
Г л а в а II. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
1. Основные обозначения 54
2. Основные штаммы и условия их культивирования .... 55
2.1. Штаммы 55
2.2. Условия культивирования штаммов 55
3. Методы 59
3.1. Определение активности кислых фосфатаз 59
3.2. Определение концентрации фосфата в культуральной среде 60
3.3. Качественное определение активности щелочной фосфатази 61
3.4. Получение глутантов с изменённой активностью кислой фосфатази 3 61
3.5. Метод гибридизации 63
3.6. Получение ревертантов 63
3.7. Тетрадный анализ 64
3.8. Анализ случайной выборки аскоспор 65
3.9. Получение митотических рекомбинантов 66
3.10. Статистическая обработка материалов 66
Г л а в а III. ВЫЯСНЕНИЕ ФУНКЦИЙ ГЕНОВ, КОНТРОЛИРУЮЩИХ СИНТЕЗ РЕПЕЕССИБЕЛЪНЫХ КИСЛЫХ ФОСФАТАЗ
1. Изучение генетического контроля синтеза кислой фосфатази 3 (кфЗ) 67
1.1. Идентификация генов, мутации в которых приводят к снижению активности кфЗ 67
1.2. Выяснение функций гена АСР5 69
1.3. Выяснение функций гена ACPI 70
2. Изучение ревертирования мутаций регуляторних генов 78
2.1. Ревертирование мутаций гена АСР2 78
2.2. Ревертирование мутаций генов АСР80, АСР8І, АСР82, АСР83, АСР84, АСР4 83
3. Идентификация генов, контролирующих транспорт фосфата у дрожжей 90
4. Картирование АСР-генов 98
5. Взаимодействие мутаций в гене АСР5 с мутациями
конститутивного синтеза в генах АСР4 и АСР82 103
Г л а в а ІV. ПОЯВПЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ЭЛЕМЕНТОВ ОБЩИХ В РЕГУЛЯЦИИ КИСЛЫХ И РЕПРЕССИБЕЛЪНОЙ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗ
1. Введение 108
2. Выяснение влияния мутаций в АСР-генах на активность репрессибельной щелочной фосфатази 109
3. Выяснение природы мутаций, одновременно блокирующих активность кфі и кф2 III
3.1. Разработка метода картирования мутаций в гене РН0І III
3.2. Изучение рекомбинации мутаций, одновременно приводящих к снижению активности кфі и кф2 118
4. Изучение взаимодействия генов AGP5 и РН0І 122
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 135
ШВОДЫ 148
ЛИТЕРАТУРА 149
- Организация кластеров у дрожжей
- Определение активности кислых фосфатаз
- Изучение генетического контроля синтеза кислой фосфатази 3 (кфЗ)
- Выяснение влияния мутаций в АСР-генах на активность репрессибельной щелочной фосфатази
Введение к работе
Проблема регуляции активности генов в процессе жизнедеятельности клетки является одной из основных в современной биологии. Ее решение позволит понять механизмы таких общебиологических явлений как морфогенез, дифференцировка при нормальном росте и опухолеобразовании, адаптация клетки к изменениям окружающей среды.
До недавнего времени наиболее интенсивно изучали регуляцию экспрессии генов у прокариотических организмов и бактериальных вирусов. Показано, что регуляция экспрессии генов у этих организмов^ основном,осуществляется на уровне транскрипции, а характерной чертой организации регуляторних систем является опе-рон, причём эффект регуляции достигается путём изменения скорости транскрипции оперонов за счёт взаимодействия ЕНК-полимеразы с участками инициации и терминации транскрипции. Посттранскрипционные процессы в регуляции у прокариот имеют второстепенное значение.
Механизмы регуляции экспрессии генов у эукариот исследованы в значительно меньшей степени, что связано со сложностью их генетической и клеточной организации и, как следствие, недостаточностью модельных объектов, удобных для решения этой проблемы. В последние годы на первый план среди подобных объектов, особенно в США И европейских странах выдвинулись дрожжи - Saccharomyces cerevisiae , одноклеточные эукариотические микроорганизмы, имеющие короткий жизненный цикл, хорошо изученные с генетической стороны, и позволяющие применять к ним весь арсенал методов молекулярной биологии и генной инженерии.
Одним из наиболее эффективных подходов к исследованию молекулярных механизмов регуляции является разработка генетических моделей, заключающаяся в выявлении регуляторних и структурных генов, контролирующих тот или иной путь биосинтеза,в выяснении их взаимодействий и последовательности функционирования.
Особенно удобна для изучения регуляции экспрессии генов кислая фосфатаза дрожжей, - один из основных энзимов метаболизма фосфора в клетке. Тот факт, что кислая фосфатаза экскрети-руется в культуральную среду облегчает выделение фермента и позволяет работать с признаком "наличие" или "отсутствие активности кислой фосфатази" как с обычным генетическим маркером.
Следует отметить, что изучение регуляции кислой фосфатази имеет не только теоретическое, но и практическое значение. Б настоящее время ферменты приобретают все большее значение в качестве природных катализаторов в биотехнологических процессах. Однако производство достаточного количества таких препаратов до сих пор не налажено и их приходится закупать за рубежом. По данным Главного управления микробиологической промышленности при Совете Министров СССР кислые фосфатазы причисляются к реактивам первой необходимости. Поэтому актуальной задачей является и получение штаммов сверхпродуцентов для их использования в промышленном производстве кислой фосфатазы.
У дрожжей Петергофских генетических линий кислая фосфатаза (кф) представлена тремя изозимами - конститутивной (кфі) и регулируемыми неорганическим фосфатом (кф2 и кфЗ). Ранее был продемонстрирован ряд генов, влияющих на активность и регуляцию синтеза кф2.
В настоящей работе показано, что регуляция экспрессии кф2 и кфЗ осуществляется общим механизмом. Идентифицирован и картирован новый ген, мутации в котором влияют на активность обоих изозимов.
При изучении ревертирования мутаций в различных АСР-генах установлено, что продуктами по крайней мере 4-х генов являются белки.
Выяснено, что один из исследованных генов (AGP80) контролирует активный транспорт фосфата в клетку и разработана методика селективного отбора мутантов по этому гену.
Идентифицированы общие элементы в регуляции активности кислых и щелочной фосфатаз. Это позволяет предполагать, что изучаемые гены могут играть важную роль в метаболизме фосфора в клетке.
На основании полученных результатов предложена модель регуляции экспрессии структурных генов для кислых фосфатаз.
Организация кластеров у дрожжей
Оперонная организация генов, кодирующих энзимы последовательных биохимических реакций, является для прокариот правилом, например, у Salmonella typnimurium до 10% генов образуют так называемые кластеры, состоящие из двух или более сцепленных генов foemerec , 1964).
У дрожжей, как и вообще у эукариот, структурные гены одного метаболического пути распределены по геному случайно. Исключение составляют немногочисленные кластеры генов, обнаруженные у грибОВ, HanpHMep:qaI-q.a2-qa3-qa4 И arom5 У НеЙроСПОры ( Case , Giles , 1968, 1976), prnA-prnD-prnB-prnC - у аспергилла ( Arst , Мс Donald , 1975) , FASI-FAS2 ( Burkl et al ., 1972) , URA2 ( Denis-Duphil, Kaplan , 1976), HIS4 A, B, G ( Pink , Styles , 1974), ADE5 » 7 ( Costello , Bevan , 1964), DAbI-DAL4-DAL2 ( Lawther et al.» 1974) GAL7-GALI0-GAbI ( Douglas , Hawthorne , 1964) у дрожжей. В ряде работ, рассмотренных в обзоре Козак ( Kozak, 1978) показано, что в начальных этапах инициации и элонгации существуют значительные различия между про- и эука-риотами. Они заключаются, в частности, в том, что структура иРНК про- и эукариот различна. Большинство иРНК прокариот по-лицистронны, при этом во внутренних сайтах эффективно осуществляется реинициация. Таким образом, у прокариот нет барьеров для инициации с внутренних промоторов. В то же время, рибосома эукариот не способна связываться с внутренними областями иРНК, т.е. эукариотические иРНК функционально моноцистронны (Petersen , мс baghlin , 1973). Кластеры, таким образом, могут быть либо тесно сцепленными генами, имеющими собственные промоторы, либо кодировать мультифункциональные полипептиды. Кластеры обоих типов идентифицированы у дрожжей.
К кластерам первого типа относятся гены GAL7-GALIO-GALI (Douglas і Hawthorne» 1964),DTJEI-DUR2 ( Lemoine et al.,I978), РНОЗ-РН05 (Meyhack et al м 1982). В каждом случае гены имеют собственный промотор и транскрибируются независимо друг от друга, причём для кластера генов, кодирующих энзимы утилизации галактозы, показано, что ген GALI транскрибируется с иной, чем два Других гена, нити ДНК (St John ,Davis , 1981).
Кластеры другого типа представляют собой один сложный ген, кодирующий мультиФункциональный полипептид. К таким кластерам относятся гены РАБі-РАБг, кодирующие синтетазу жирных кислот ( КШт et al., 1972), TJEA2 ( Denis-Duphil et al ., I98I),ADE5,7 ( Costello,Bevan , 1964) ,БАЫ-БАЬ4-3)АЬ2 ( Lawther et al ., 1974), HIS4 ( Pink,styles , 1974). Поскольку организация кластера FASI-FAS2 отражает общие свойства кластеров этой группы, мы остановимся подробнее на его строении и биохимической организации продукта - синтетазы жирных кислот, осуществляющей превращение малонил- КоА в пальмитиновую кислоту (рис. I).
В работе Кюна с соавторами было показано, что мультиэнзим-ный комплекс синтетазы жирных кислот кодируется двумя генами PASI и PAS2.3TH гены тесно сцеплены И функционально сложны, каждый из них кодирует более,чем один компонент синтетазы жирных кислот (кшш et al ., 1972). Используя генетические и биохимические данные, удалось сопоставить энзиматические активности и соответствующие им гены. Оказалось, что ген РАЗікодирует полипептиднуго цепь f , a reHPAS2 - . В- цепь обладает четырьмя активностями: малонил-пальмитил-трансферазной, ацетил-транс-феразной, дегидрогеназной и редуктазной2.Л/-цепь обладает тремя энзиматическими активностями: активностью конденсирующего энзима, редуктазнойї, а также формирует белок - переносчик ацильных групп (рис. 2).
Определение активности кислых фосфатаз
Качественное определение активности кислых фосфатаз (Сам-сонова, 1979). На поверхности чашек с выросшими культурами накладывали бумажные фильтры (плотные медленнофильтрующие, для тонких осадков),смоченные раствором субстрата Л-нафтилфосфата в концентрации 2 мг/мл и красителя синего прочного Б в концентрации 4 мг/мл в 0,05 М цитратном буфере {рН 3,7 или рН 4,5). Значение рН буфера соответствовало оптимуму рН определяемой фосфатази. Через 15 минут учитывали интенсивность окрашивания. В течение этого времени кислые фосфатазы, локализованные на поверхности клеток отщепляют от субстрата JL-нафтилфосфата фос 60 фат. Получившийся в результате реакции &-нафтол образует с синим прочным Б соединение фиолетового цвета. Интенсивность окраски отражает активность кислых фосфатаз.
Количественное определение репрессибельных кислых Фосфатаз (Падкина и др., 1974) проводили на суспензии клеток, выращенных в жидкой среде ПЕН. Активность фосфатазы определяли колориметрическим методом, основанным на способности кислых фосфатаз отщеплять от субстрата пара-нитрофенилфосфата (пНФФ) фосфат, в результате чего образуется пара-нитрофенол (ПНФ), имеющий максимум поглощения в области 410 нм.
В стационарной фазе роста культуры дрожжей (культивирование проводили при 20С) отбирали суспензию клеток для определения активности кислых фосфатаз, локализованных на поверхности клеток, а также находящихся в культуральной среде. Реакционная смесь содержала 0,9 мл цитратного буфера (0,05 М, рН 4,5), 15мкм пНФФ и аликвоту суспензии клеток в общем объеме пробы I мл. После инкубации в течение 20 мин при 33С реакцию останавливали добавлением 0,5 мл Днраствора вгаон и определяли поглощение при длине волны 410 нм ( на спектрофотометре Perkin Elmer"). Удельную активность кислой фосфатазы выражали в условных единицах в виде отношения поглощения пНФ при длине волны A JQ в расчёте на мутность суспензии (Aggg). Все эксперименты проводились в трёх повторностях.
Изучение генетического контроля синтеза кислой фосфатази 3 (кфЗ)
В восьми опытах по облучению штаммов 93-ІГ-ЇЇІ88 (асрЗ-93рЬо 1-93) и П.І-38Б-П2І56 (асрЗ-1 phol-059) было получено 44 мутанта со сниженной активностью кфЗ. Выживаемость в опытах варьировала в незначительных пределах (2,0-6,0$).,В контрольных вариантах, среди 4580 клонов, мутантов, не имеющих активности кфЗ обнаружено не было. 7 штамма 93-ГГ-ПІ88 было отобрано 37 мутантов, у штамма ПІ-38Б-П2І56 - 7 мутантов. 27 мутантов были полностью лишены фосфатазной активности при 30С, а у 17 мутантов активность кфЗ была снижена ( leaky)(табл.5).
Для выявления генов, мутации в которых блокируют активность кфЗ, полученные мутанты были скрещены с тестерными штаммами, несущими мутации в генах ACPI и АСР2. При этом мутанты, полученные у штамма 93-ІГ-ПІ88, скрещивали со штаммами п Ю-, ПІІ-38Б-П2І56 (асрІ-ІО, асрІ-ІІ), П2-38Б-ЇЇ2І56 (аср2-2), а мутанты, отобранные у штамма ПІ-38Б-П2І56, скрещивали со штаммами пЗ-І-99-ПЧІ 188 (асрІ-3), п64-І-99-ІГ-ПІ88 (аср2-54). Генотипы и происхождение штаммов представлены в таблице 3.
Выяснение влияния мутаций в АСР-генах на активность репрессибельной щелочной фосфатази
Неспецифическая щелочная фосфатаза дрожжей локализуется в вакуолях и её синтез регулируется неорганическим фосфатом (Schurr, jagil » 1971). Функцией этого фермента является расщепление полифосфатов, сопровождающееся выходом энергии, и обеспечение клетки фосфатом при его недостатке. Синтез репрессибельной щф подавляется при увеличении концентрации неорганического фосфата.
С целью выяснения возможного влияния мутаций АСР-генов на активность репрессибельной щелочной фосфатазы проводили качественное определение активности этого фермента. Суммарные данные по качественному определению активности ЩФ представлены в таблице .
Из таблицы 28 видно, что мутации в двух генах - АСР2 и АСР5 снижают активность и репрессибельных кислых и щелочной фосфатаз. Следует отметить, что наиболее чёткие мутации, блокирующие активность репрессибельных кислых фосфатаз и щелочной фосфатазы возникают в гене АСР2. Принимая во внимание тот факт, что мутанты acp2 на среде, не содержащей фосфата, растут хуже, чем остальные АСР-мутанты, можно высказать предположение, что этот ген кодирует один из центральных этапов в регуляции метаболизіла фосфора в клетке.
Активность репрессибельных кислых и щелочной фосфатаз у различных мутантов по генам АСР в условиях репрессии и дерепрессии
Из этой же таблицы следует, что глутации в гене ACPI не приводят к снижению активности репрессибельной щелочной фосфатази. Это может служить подтверждением, что ген ACPI кодирует структуру кфЗ. В то же время отсутствие влияния мутаций в гене ACPI на активность щелочной фосфатази, не противоречит и предположению о том, что ген ACPI кодирует структуру фактора позитивного контроля, специфичного для системы регуляции кислых фосфатаз. Следует отметить, что в системе регуляции кислых фосфатаз саке-линий дрожжей идентифицирован ген РН02, мутации в котором также не влияют на активность щф ( Toh-e et al., 1976), и функцией которого является позитивный контроль синтеза кислой фосфатазы и пермеазы неорганического фосфата.
Мутации в генах АСР4, АСР80, ACP8I, АСР82, аср83, аср84 приводят, как видно из таблицы 28, к конститутивному синтезу всех репрессируемых фосфатаз: кф2, кфЗ и щелочной фосфатазы. Отсюда следует, что:,все изученные регуляторные гены АСР2, АСР5, АСР4, АСР81-аср84 контролируют общие этапы репрессии по крайней мере двух основных энзимов метаболизма фосфата: кислой и щелочной фосфатаз.
![Идентификация и характеристика генов, влияющих на поддержание и фенотипическое проявление прионоподобного детерминанта [ISP+], у дрожжей Saccharomyces cerevisiae](/i/i/4278/150135.png "Идентификация и характеристика генов, влияющих на поддержание и фенотипическое проявление прионоподобного детерминанта [ISP+], у дрожжей Saccharomyces cerevisiae Аксенова Анна Юрьевна")
