Содержание к диссертации
Введение
1. «Генетические механизмы регуляции функций митохондрий фосфатом у дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Рісша pastoris» (обзор литературы) 11
1. 1. Факторы, влияющие на наследование и функции митохондрий у дрожжей Cerevisiae и P. pastoris 11
1.1.1. Строение митохондрий и их динамика в ходе клеточного цикла 12
1.1.2. Транспортные системы митохондрий 17
Транспорт адениловых ну клеотидов 18
Транспорт фосфата 19
Мембранный потенциал митохондрий 20
1.1.3. Механизмы распределения митохондрий между материнской и дочерней клетками у дрожжей S. cerevisiae 22
Роль актинового цитоскелета в распределении митохондрий 23
Движение митохондрий по актиновому цитоскелету 28
1.1.4. Механизмы стабилизации митохондриального генома у дрожжей S. cerevisiae 29
Размер, копийность и генетический состав мтДНК 29
Сегрегация мтДНК и значение гомоплазмии 31
Супрессивность 33
Строение нуклеоидов 36
Бифункциональные белки митохондрий 41
1.1.5. Митохондриальные механизмы регуляции экспрессии ядерных генов 44
1.1.6. Наследование митохондрий и стабилизации мтДНК у дрожжей Р. pastoris 48
1.2. Метаболизм фосфата дрожжей S. cerevisiae P. pastoris 51
1.2.1. Фосфатазы дрожжей S. cerevisiae и P. pastoris 51
Щелочные фосфатазы 51
Кислые фосфатазы 52
1.2.2.Системы транспорта неорганического фосфата 53
1.2.3. Регуляция экспрессии генов репрессибельных кислых фосфатаз 54
Pho4p-Pho2p 56
Циклин-зависимая протеинкиназа Pho85 58
Циклины и субстраты 61
Роль Pho85p в регуляции клеточного цикла 61
Роль Pho85 в регуляции поляризационного роста клеток 66
Pho85p и регуляция Gcn4p 67
1.2.4. Метаболические интермедиаты в регуляции траскрипции РНО и ADE генов 68
1.2.5. Метаболизм полифосфатов 70
Модель накопления полифосфатов 73
1.2.6. Инозитолпирофосфаты. Новая форма внутриклеточного сигналинга73
1.2.7. Регуляция синтеза КФ у дрожжей P. pastoris 76
2. Материалы и методы 79
2.1. Основные обозначения 79
2.2. Штаммы и условия и культивирования 81
2.2.1. Штаммы 81
2.2.2. Плазмиды 81
2.2.3. Условия культивирования 84
2.3. МЕТОДЫ 85
2.3.1. Генетические методики 85
2.3.2. Молекулярно-биологические методики 87
2.3.3. Биохимические методики 89
2.3.4. Цитологические методики 91
2.3.5. Статистические методики 92
3. Результаты и обсуждение 94
3.1. Фенотипические проявления делении гена рн085 у дрожжей Р. pastoris 94
Влияние делеции pho85 на стрессоустойчивость клеток P. pastoris 95
Влияние делеции pho85 на катаболизм пролина у дрожжей P. pastoris 97
Изучение влияния делеции pho85 на накопление дыхательно некомпетентных клеток 99
Изучение влияния делеции pho85 на накопление ядерных ts мутаций 100
3.2. Изучение роли протеинкиназы Pho85 в наследовании мтДНК дрожжей S. cerevisiae 100
Изучение влияния дизрупции гена РН085 на частоту мутаций мтДНК 101
Оценка частоты и динамики возникновения дыхательно-некомпетентных клонов у штаммов с дизрупцией гена РН085 102
Оценка стабильности ДНК митохондрий на фоне дизрупции гена РН085 104
3.3. Изучение структуры цитоскелета на фоне дизрупции рно85 у дрожжей S. cerevisiae и P. pastoris 108
3.4. Изучение распределения митохондрий и их морфологии у штаммов с дизрупцией гена рн085 113
3.5. Поиск генов, мутации в которых стабилизируют наследование нуклеоидов на фоне дизрупции рн085 116
3.6. Поиск мультикопийных супрессоров дыхательной некомпетентности, возникающей на фоне дизрупции рн085 120
4. Роль протеинкиназы рн085 в регуляции функций митохондрий (заключение) 133
4. 1. Регуляция концентрации внутриклеточного фосфата 136
4. 2. Регуляция экспрессии генов, входящих в состав митохондриальных нуклеоидов 137
Выводы 140
Список литературы 141
- Строение митохондрий и их динамика в ходе клеточного цикла
- Циклин-зависимая протеинкиназа Pho85
- Влияние делеции pho85 на катаболизм пролина у дрожжей P. pastoris
- Регуляция экспрессии генов, входящих в состав митохондриальных нуклеоидов
Введение к работе
Актуальность темы. В основе адаптации микроорганизмов к условиям среды лежат изменения уровня экспрессии генов, которые влияют как на метаболизм, так и на структурную организацию клетки. Химический состав цитоплазмы оказывает существенное влияние на функцию эндосимбионтов. Митохондрии, в свою очередь, определяют пластичность метаболизма эукариотической клетки и обеспечивают адаптацию к воздействиям физических или химических факторов за счет регуляции синтеза АТФ, накопления активных форм кислорода и апоптоза. Изучение генетических механизмов, регулирующих функционирование митохондрий и стабильность митохондриальной ДНК (мтДНК), является актуальным направлением фундаментальных исследований.
Изучение дрожжей-аскомицетов позволяет исследовать механизмы регуляции функций митохондрий в зависимости от метаболического состояния эукариотической клетки. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris отличаются способом утилизации углерода: S. cerevisiae являются факультативными анаэробами, а метилотрофные дрожжи P. pastoris -облигатными аэробами.
Центральную роль в процессе передачи сигнала об изменениях окружающей среды играет фосфорилирование белков. Циклин-зависимые протеинкиназы (CDK), в том числе Pho85p, выступают важными регуляторами как клеточного цикла, так и транскрипции, обеспечивая прохождение клетки через фазу Gi/S, контроль полярности клеток, экспрессию генов метаболизма фосфата и передачу сигналов об изменениях окружающей среды (Carroll а. О'Shea, 2002).
Для большинства облигатных аэробов необходимым условием выживания является наличие функционально активных митохондрий. У человека делеции, дупликации или точковые мутации мтДНК могут стать причиной наследственных и спорадических заболеваний. В клетках дрожжей S. cerevisiae структура митохондриальных нуклеоидов подвергается ремоделированию с помощью метаболически регулируемых бифункциональных белков (Hsp60p, Kgd2p, Ilv5p). В настоящее время механизмы поддержания стабильности мтДНК, а также клеточные процессы, опосредованные ядерно-митохондриальными генетическими взаимодействиями, исследованы недостаточно.
Целью исследования являлось изучение сигнальной системы, обеспечивающей адаптацию митохондрий к изменениям концентрации фосфата у дрожжей S. cerevisiae и P. pastoris. В ходе работы решали следующие задачи: (1) сравнительная характеристика фенотипов мутантов pho85 дрожжей S. cerevisiae и P. pastoris; (2) определение частоты возникновения спонтанных мутаций мтДНК на фоне pho85 и динамики накопления дыхательно-некомпетентных (Gly~l[pef]) клонов у штаммов pho85; (3) изучение влияния дизрупции гена РН085 на поляризацию, транспорт митохондрий, а также на
4
стабильность нуклеоидов; (4) поиск супрессорных мутаций и
мультикопииных супрессоров дыхательной некомпетентности, возникающей на фоне мутаций pho85.
Научная новизна исследования. Впервые продемонстрирована роль компонентов .Р/ГО-регулона в контроле стабильности мтДНК дрожжей S. cerevisiae. Показано, что дыхательная некомпетентность, возникающая на фоне дизрупции гена РН085, обусловлена нарушением распределения нуклеоидов между материнской и дочерней клетками, и селективным преимуществом клеток [rhoO] на среде с глюкозой и высокой концентрацией фосфата. Выявлено, что дизрупция гена РН085 приводит к нарушению структуры цитоскелета в клетках дрожжей S. cerevisiae, вызывая качественные и количественные изменения в составе фракции термостабильных белков цитоскелета. Показано, что у дрожжей S. cerevisiae дополнительные мутации в генах РН04, РН081, РН084 и РН087, возникающие на фоне дизрупции pho85, нормализуют транспорт фосфата в клетку и восстанавливают дыхательную компетентность. Отсутствие протеинкиназы Pho85p у дрожжей S. cerevisiae приводит к снижению рН матрикса митохондрий, что свидетельствует об изменении мембранного потенциала митохондрий. Выявлено, что сверхпродукция белка внутренней мембраны митохондрий Diclp, обеспечивающего выведение фосфата из матрикса митохондрий, приводит к стабилизации мтДНК у штаммов pho85 дрожжей S. cerevisiae. Показано, что ген ILV5, кодирующий белок компактизации мтДНК, является мультикопийным супрессором дыхательной некомпетентности мутантов РН085. В ходе выполнения диссертационной работы были получены штаммы P. pastoris с делецией гена РН085 и проведена фенотипическая характеристика полученных мутантов. Делеция гена РН085 у P. pastoris приводит к конститутивному синтезу кислой фосфатазы (КФ), чувствительности к ионам кальция, повышенному уровню гликогена, но, в отличие от S. cerevisiae, не влияет на частоту возникновения термочувствительных мутаций и на стабильность мтДНК.
Практическая ценность. Чувствительность штаммов с делецией pho85 к повышенным концентрациям кальция позволяет использовать ген РН085 в качестве нового селективного маркера при создании штаммов-продуцентов гетерологичных белков дрожжей P. pastoris.
Штаммы и плазмиды, полученные в данной работе, используются при выполнении исследовательских работ студентами и аспирантами биолого-почвенного факультета.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на международных конференциях «Yeast Genetics and Molecular Biology Meeting» (Гётебург, Швеция 2003; Братислава, Словакия 2005; Торонто, Канада 2008; Манчестер, Великобритания 2009); международной школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва, Пущино, 2006); III и V съездах Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2004 и 2009).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ, из них 4 - в
5 изданиях, рекомендованных ВАК.
Структура и объем работы. Работа изложена на 183 страницах и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы, список литературы (374 наименований). Работа содержит 9 таблиц и 46 рисунков.
Строение митохондрий и их динамика в ходе клеточного цикла
Тонкая структура митохондрий дрожжей принципиально не отличается от органелл высших млекопитающих. От цитоплазмы митохондрию отделяет двуслойная наружная мембрана, заполненная осмиофобным межмембранным пространством. Внешняя мембрана исполняет роль "молекулярного сита" и не пропускает соединения с молекулярной массой более 5-10 кДа. Внутренняя мембрана имеет пузырчато-трубчатое строение и осуществляет контроль импорта белков в митохондрии, биосинтеза фосфолипидов и слияния митохондрий. Размеры и морфология крист зависят от энергетических потребностей клетки, типа обмена веществ и стадии роста культуры. Так, дрожжи с ярко выраженным аэробным типом обмена — облигатные аэробы (род Lipomyces) и слабо бродящие факультативные анаэробы (род Pichid) отличаются развитым мембранным аппаратом и содержат большое число сложно структурированных митохондрий с многочисленными кристами. У видов дрожжей, использующих брожение (Arxiozyma telluris, S. cerevisiae, S. pombe), мембранный аппарат выражен слабо, имеются лишь немногочисленные крупные митохондрии с неправильно ориентированными кристами, а у дрожжей низового брожения (S. carlsbergensis) кристы редуцируются (Paumard etal, 2002).
Еще большая вариабельность характерна для размеров и формы митохондрий, которые в соответствии с условиями в цитоплазме могут активно делиться и разветвляться, сливаться или уменьшаться в размере. Ядерные и митохондриальные деления имеют четкую корреляцию, конец делений митохондрий приходится на середину S фазы. Распределение митохондрий между материнской и дочерней клетками происходит в течение фаз S и G2, в результате, около половины митохондрий наследуется дочерней клеткой (Рис. 1). Ввиду того, что митохондрии не могут быть синтезированы de novo и передаются от материнской клетки дочерней, механизмы деления и распределения органелл приобретают особое значение (Yang etal., 1999).
Метод серийных ультратонких срезов и последующая реконструкция хондриома разных видов дрожжей продемонстрировали, что многочисленные отдельные митохондриальные профили, выявляемые на одиночных срезах митохондрий, часто представляют собой комиссуры одной большой, разветвленной митохондрии длиной 50-60 мкм и диаметром 0,2-0,6 мкм (Hoffinann a. Avers, 1973; Suzuki et al., 1976). Число митохондрий зависит от фазы роста и, соответственно, стадии клеточного цикла.
От стадии роста и типа обмена дрожжей зависит также и химический состав органелл. Митохондрии состоят преимущественно из белков, липидов, нуклеиновых кислот, а также кофакторов и субстратов. Основную фракцию липидов составляют фосфолипиды. У активных аэробов до 75% всех фосфолипидов клетки приходится на митохондриальную фракцию. В условиях глюкозной репрессии, анаэробиоза или в результате добавления специфических ингибиторов митохондриогенез подавляется и существенно меняется липидный состав клеток, наблюдается значительное уменьшение содержания фосфолипидов: фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина, дифосфатидилглицерина. Минорная фракция липидов содержит нейтральные липиды - стерины, которые также чрезвычайно важны для функционирования митохондрий. Было показано, что подавление синтеза эргостерина в анаэробных условиях и при глюкозной репрессии сопровождается уменьшением дыхательной активности и деградацией митохондрий (Ferreira et aL, 2004).
Динамично протекающие процессы слияния и деления митохондрий обеспечивают лабильность хондриома и регуляцию функций органелл за счет механизмов генетического контроля структуры и функционирования митохондрий в соответствии с потребностями клетки в АТФ (Bereiter-Hahn а. Voth, 1994). Основными компонентами слияния и деления митохондрий являются мембранные белки Mmml, MdmlO, Mdml2 и Mmm2, образующие структуру мембранного митохора (Burgess et aL, 1994; Berger et aL, 1997; Sogo a. Yaffe, 1994; Yaffe, 2003). Митохор связывает митохондрии и мтДНК с актиновыми тяжами, что обеспечивает контролируемое передвижение органелл и их ДНК в клетке (Simon et aL, 1995; Catlett a. Weisman, 1998; Boldogh et aL, 2003; Pfanner et aL, 2004). Для образования трубчатых структур митохондрий и наследования мтДНК необходимы также белки внутренней мембраны митохондрий - Mdm31 и Mdm32, которые взаимодействуют с комплексом мембранного митохора через Mmml р. Делеции MDM10, MDM12, МММ1 и МММ2 летальны на фоне делеций генов MDM31 и MDM32. Делеции генов mmml, mdmlO, mdml2 или ттт2 приводят к характерному изменению морфологии органелл: образованию гигантских, круглых, деполяризованных митохондрий (Dimmer et aL, 2005).
Предложено несколько моделей, объясняющих деление митохондрий, с участием белков Dnml, Fisl, Mdvl, Caf4 и Mdm33. Первым идентифицированным белком-регулятором деления митохондрий стал динамино-подобный белок с ГТФ-азной активностью Dnml (Bleazard et aL, 1999). Делеции гена DNM1 приводят к образованию сложной сети неразделенных митохондрий. Сходным фенотипом обладают и штаммы с делецией гена FIS1, кодирующего интегральный белок наружной мембраны митохондрий (Mozdy et aL, 2000). Штаммы с делециями mdvl, caf4 или mdm33 имеют измененную структуру митохондрий с нарушенным разделением и наследованием органелл (Tieu a. Nunnari, 2000; Griffin et al, 2005).
Согласно одной модели слияния и деления митохондрий, регуляция осуществляется гетеротримерным белковым комплексом Dnmlp/ Mdvlp/ Fislp. При этом Dnmlp выступает в роли механо-фермента, растягивающего мембрану митохондрий (Danino a. Hinshaw, 2001; Naylor et al., 2006). Согласно другой модели, стабильный комплекс Fislp-Mdvlp приводит к олигомеризации Dnmlp (Tieu et al, 2002). При этом, блок деления митохондрий не приводит к гибели клеток, что указывает на существование других механизмов регуляции деления митохондрий в ходе цитокинеза, в мейозе, а также при споруляции диплоидных клеток (Gorsich a. Shaw, 2004).
Основными регуляторами слияния митохондрий у дрожжей являются ГТФазы наружной и внутренней мембран митохондрий Fzol и Mgml соответственно, а также белок наружной мембраны Ugol (Shepard a. Yaffe, 1999; Fritz et al, 2001). Белок Mgml присутствует в клетке в двух формах: полноразмерный белок интегрирован в мембрану митохондрий, а укороченная форма связывается только с внутренней мембраной. «Длинная» форма белка участвует как в слиянии органелл, так и в тубуляции митохондрий. При этом только укороченная форма Mgmlp может взаимодействовать с Ugolp и Fzolp (Sesaki et al., 2003). Образование укороченной формы Mgmlp происходит за счет действия протеазного комплекса внутренней мембраны Pcplp/ Rbdlp/ Ugo2p (Herlan et al., 2003). Процессинг Mgmlp зависит от мембранного потенциала митохондрий. Следовательно, на этом уровне морфология органеллы и развитие крист внутренней мебраны могут регулироваться энергетическим состоянием клетки (Herlan et al, 2004).
Процесс слияния митохондрий можно разделить на три этапа: фиксация органелл, слияние наружной и слияние внутренней мембран. За осуществление первого этапа отвечает белок Fzol, который фиксирует две митохондрии друг относительно друга с помощью биспиральных (coiled-coil) доменов (Koshiba et ah, 2004). В месте контакта происходит соприкосновение наружной и внутренней мембран митохондрии в результате связывания белков Fzol и Mgml белком Ugol (Sesaki a. Jensen, 2001). Слияние мембран зависит от присутствия ГТФ. Белок Mdm30p контролирует содержание Fzolp в наружной мембране. Комплексы инактивированных белков Fzol отправляются на убиквитин-зависимую протеолитическую деградацию, что ведёт к слиянию органелл. Мутации гена, кодирующего необходимую для протеолиза субъединицу протеосомы Rpnlp, приводят к фрагментации митохондрий, что, возможно, происходит за счет нарушения деградации Fzolp (Sesaki a. Jensen, 1999). Несмотря на то, что многие компоненты регуляции морфологии и динамики органелл уже известны, знания о механизмах регуляции остаются достаточно фрагментарными.
Циклин-зависимая протеинкиназа Pho85
Ключевую роль в регуляции экспрессии генов РНО играет циклин-зависимая протеинкиназа (CDK) Pho85p. Впервые мутации в гене РН085 были идентифицированы, как рецессивные мутации конститутивного синтеза КФ2 (Самсонова и др., 1975; Самсонова и др., 1980; Uesono et al, 1987; Самбук и др., 1991). Впоследствии были выявлены плейотропные эффекты мутаций pho85. Значение протеинкиназы не ограничивается регуляцией транскрипции, Pho85p, как и большинство CDK, участвует в контроле клеточного цикла. Несмотря на многие выполняемые протеинкиназой функции Pho85 не является необходимой для жизнеспособности дрожжей, что делает её удобной моделью для исследований функционирования CDK.
Протеинкиназа Pho85p участвует в регуляции клеточного цикла, процессов аутофагии, утилизации пролина и ответа клетки на стресс (Попова и др., 2000; Wang et al, 2001; Carroll et al, 2001). Поэтому не удивительно, что помимо конститутивного синтеза КФ2, делеция гена РН085 приводит к медленному росту с задержкой в фазе Gb накоплению гликогена, измененной морфологии клеток, дефектам споруляции, а также к нарушениям полярности клеток: нерегулярному делению, деполяризации актина, дефектам эндоцитоза (Gilliquet a. Berben, 1993; Measday et al, 1997; Tennyson et al, 1998; Lee et al, 1998). Многие функции Pho85p связаны с передачей сигналов об изменениях условий окружающей среды (Carrol а. О Shea, 2002; Bomeke et al, 2006).
Pho85p относится к пролин-направляемым серии—треониновым киназам, т. е. фосфорилирует субстрат по серину или треонину, которые связаны с N-концом пролина (O Neill et al, 1996). Циклин-зависимая протеинкиназа Pho85p имеет характерное для большинства протеинкиназ трехмерную структуру, а именно: каталитический домен, осуществляющий перенос фосфата с АТФ на белок состоит из двух долей, соединенных через «гибкий шарнир» (Hanks а. Hunter, 1995). В аминокислотной последовательности Pho85p (305 АК) существуют три консервативные области: сайт фосфорилирования Y22, последовательность PSTAIRE для связывания с циклином и последовательность, имеющую третичную структуру Т-петли (De Bondt et al, 1993). Т-петля содержит важные регуляторные элементы: это прежде всего сайт ТІ 7, в результате фосфорилирования которого происходит подавление активности белка. Этот сайт ингибирования локализован в глицин — богатом участке Pho85p, который служит фиксатором фосфата при связывании с АТФ. Фосфорилирование по сайту ТІ7, с одной стороны, влечет уменьшение сродства CDK к субстрату, с другой - может влиять на ориентацию АТФ в молекуле в результате изменения конформации Т-петли. Так называемый мотив PSTAIRE находится в al спирали, и при рассмотрении третичной структуры локализуется во впадине между двумя долями белка. За связывание с циклином отвечает N-доля белка, которая состоит из слоев pi и р2 (Ducommun et al, 1991; Рис. 16).
В генетическом смысле наиболее подробно изучены консервативные сайты белка. Так, замена Y18F приводит к нарушению взаимодействия протеинкиназы Pho85p с циклином Pho80p, а для взаимодействия с циклинами Pell и PcllO фосфорилирование Y18 не критично (Wilson et al, 1999). Возможно, Y18 служит для выбора соответствующего циклина протеинкиназой Pho85. Мономерной формы Pho85p в клетке всегда много, хотя присутствует и высокомолекулярная фракция комплексов CDK с циклинами и субстратами. Циклины, объединяясь с соответствующими субстратами, конкурируют за взаимодействие с CDK (Wilson et al., 1999).
Несмотря на высокую степень консервативности CDK, последствия мутаций в консервативных сайтах протеинкиназ не всегда одинаковы. Так, Cdc2p делящихся дрожжей Schizosaccharomyces pombe имеет в Т-петле дополнительный сайт фосфорилирования Y15, мутации в нем приводят к конститутивной активации CDK, тогда как мутации по сайту Y15 в РН085 S. cerevisiae нейтральны (Matsuyama et al, 2006).
Pho85p имеет высокий процент гомологии с CDK Cdc28p, тем не менее, при сравнении характера наследования ряда мутаций CDC28 и РН085 были выявлены существенные отличия. Мутации CDC28, затрагивающие три консервативных АК сайта D144, Р154 и D207, являются доминантно-негативными, в то время как при введении аналогичных мутаций в последовательность РН085 доминантно-негативного характера наследования не обнаружено. Известно, что для активации Cdc28p и Cdc2p важным является фосфорилирование ТІ40, для функционирования Pho85 это фосфорилирование не обязательно (Nishizawa et al, 1999). Таким образом, регуляции Cdc28p и Pho85p существенно отличаются, несмотря на высокую степень гомологии АК последовательностей этих протеинкиназ (Santos et al, 1995).
Циклины и субстраты
Известно, что именно циклины определяют субстратную специфичность CDK. На данный момент известно 10 циклинов и 19 субстратов CDK Pho85p (Табл. 4; Measday et al, 1997; Huang et al, 2007).
В соответствии со структурой циклины Pho85p подразделяются на две группы. Первая группа объединяет циклины, сходные по строению с Pho80p: это семейство включает наряду с самим Pho80p циклины Рсібр, Рс17р, Рс18р и Pel Юр. Пик экспрессии PCL7 наблюдается в интервале от середины до поздней S-фазы (Lee et al, 2000).
Связываясь с циклинами группы Pho80, CDK Pho85 участвует в регуляции метаболических процессов и в передаче сигналов об изменениях условий окружающей среды (Carroll a. O Shea, 2002).
Остальные циклины Pell, Рс12, Рс19, Clgl и Рс15 образуют семейство Pell, 2 (Measday et al., 1997). Гены PCL9 и PCL2 экспрессируются с поздней М до ранней Gi-фазы, в то время как Pell является циклином поздней Gi-фазы.
Большое количество циклинов Pho85p определяет широкий спектр субстратов и выполняемых функций (Табл. 4). Важную роль CDK Pho85p играет в посттрансляционной модификации белков, а также участвует в процессе деградации ряда белков, таких как Sicl, Gcn4, Swi5, Ashl, обеспечивая регуляцию клеточного цикла и ответ клетки на изменения окружающей среды.
Роль Pho85p в регуляции клеточного цикла
Основные механизмы контроля клеточного цикла отличаются высокой степенью консервативности. Ключевую роль в регуляции клеточного цикла играют CDK. Геном дрожжей содержит 23 гена, кодирующих циклины, и 6 генов CDK: Cdc28, Pho85, Kin28, Srbl0/Cdk8, Sgvl/Burl и Ctkl.
Влияние делеции pho85 на катаболизм пролина у дрожжей P. pastoris
У дрожжей S. cerevisiae скорость роста клеток определяется источником азота: пролин и мочевина относятся к так называемым «бедным» источникам азота, а соли аммония являются примером «богатого» источника азота. Pho85p и белок-активатор Pho4 участвуют в регуляции генов катаболизма пролина у сахаромицетов. Мутанты pho85 S. cerevisiae не способны расти на средах с пролином и глюкозой в качестве источника углерода (Попова и др., 2000). Штаммы 85-3-GS115 были охарактеризованы по способности роста на средах с пролином в концентрации 0,005%) и 0,46% в качестве источника азота и с глюкозой, метиловым, этиловым спиртами и глицерином в качестве источников углерода (Табл. 7).
Оказалось, что штаммы pho85 P. pastoris не растут на среде с пролином в концентрации 0,005%, когда в качестве источника углерода используется глицерин, но на среде с глицерином и 0,46%) пролина 85-3-GS115 растут нормально.
Биосинтез пролина у дрожжей S. cerevisiae осуществляется в цитоплазме, в то время как катаболизм избытка пролина с получением глутамата происходит в митохондриях (Takagi, 2008). Мутанты pho85 дрожжей S. cerevisiae не способны расти на средах с пролином в концентрации 0,005 % и 0,46 %, когда в качестве источника углерода используется глюкоза. Это объясняется нарушением функционирования ферментов катаболизма пролина и нарушением функций пермеаз Put4p, которая работает на низких концентрациях пролина, и Gaplp, общей пермеазы аминокислот, работающей при высоких концентрациях пролина (Попова и др., 2000).
Наши результаты позволяют предположить, что киназа Pho85p у дрожжей P. pastoris влияет на транспорт пролина гомологом пермеазы Put4 в зависимости от источника углерода.
Регуляция экспрессии генов, входящих в состав митохондриальных нуклеоидов
У мутантов pho85 экспрессия гена ILV5 снижена в 2,6 раза, что указывает на участие протеинкиназы в регуляции транскрипции этого гена (Ogawa et ai, 2000). Ген ILV5 является мультикопийным супрессором дыхательно-некомпетентного фенотипа у штаммов pho85, по-видимому, за счет усиления компактизации мтДНК. Протеинкиназа Pho85p может участвовать в контроле экспрессии ILV5 и координировать компактизацию мтДНК в соответствии с регулируя изменениями условий окружающей среды, опосредованно активность транскрипционного фактора Gcn4p (Рис. 46-В).
Таким образом, отсутствие в клетке функциональной протеинкиназы Pho85p приводит к потере мтДНК на средах с глюкозой и высокой концентрацией фосфата за счет нарушения регуляции поступления фосфата в клетку и в митохондриальныи матрикс, что приводит к снижению рН гомогената органелл и, вероятно, к изменению мембранного потенциала митохондрий. В этих условиях изменение распределения зарядов митохондриальной мембраны сказывается на работе АТФазы, которая начинает закачивать протоны в матрикс, т. е. функционировать на глюкозе как на несбраживаемом субстрате, что приводит к селективному преимуществу клеток без мтДНК с блоком функций F0 субъединицы АТФазы. Кроме того, протеинкиназа Pho85p участвует в контроле экспрессии ILV5 и координации компактизации мтДНК в соответствии с изменениями условий окружающей среды. Следовательно, в ходе эволюции сахаромицетов сформировались регуляторные сети, управляющие функциями митохондрий не только в ответ на качество источника углерода и азота, но и в ответ на изменение концентрации неорганического фосфата.
![Идентификация и характеристика генов, влияющих на поддержание и фенотипическое проявление прионоподобного детерминанта [ISP+], у дрожжей Saccharomyces cerevisiae](/i/i/4278/150135.png "Идентификация и характеристика генов, влияющих на поддержание и фенотипическое проявление прионоподобного детерминанта [ISP+], у дрожжей Saccharomyces cerevisiae Аксенова Анна Юрьевна")
