Содержание к диссертации
Введение
1. Системы гетерологичной экспрессии дрожжей saccharomyces cerevisiae и ріснїа pastoris (обзор литературы) 17
1.1. Продукция ре комби нантных белков в дрожжах Saccharomyces cerevisiae 17
1.1.1. Векторы экспрессии дрожжей Saccharomyces cerevisiae 20
1.1.2. Структура промоторов дрожжей Saccharomyces cerevisiae 22
1.1.3. Промоторы дрожжей Saccharomyces cerevisiae, используемые в биотехнологии 24
1.1.3.1. Промоторы генов, кодирующих гликолитические ферменты 24
1.1.3.2. Регулируемые промоторы 29
Промотор гена ADH2 29
Промоторы GAL-генов 31
Промотор гешРНОЗ 35
Транскрипционный активатор, кодируемый геном РН04 37
Белки регуляторы, кодируемые генами РНО80 и РН085 39
Белок, кодируемый геном РН081 40
1.1.4. Терминаторы транскрипции генов дрожжей Saccharomyces cerevisiae, используемые в биотехнологии 43
1.1.5. Зависимость уровня гетерологичной экспрессии от эффективности основных матричных процессов дрожжей Saccharomyces cerevisiae 46
1.1.5.1. Транскрипция 46
Роль DAS и DRS регуляторных последовательностей в эффективности транскрипции у дрожжей 46
Элонгация транскрипции 48
Терминация транскрипции , 48
Сплайсинг матричной РНК 49
1.1.5.2. Стабильность матричной РНК 50
1.1.5.2. Трансляция 53
Инициация трансляции 53
Элонгация трансляции 60
Терминация трансляции 62
1.1.6. Сворачивание (фолдинг) полипептидной цепи и шапероны 64
1.1.7. Постгрансляционная модификация белков 72
1.1.7.1. Удаление N-концевого метионина 72
1.1.7.2. Ацетилирование N-концевой аминокислоты 75
1.1.7.3. Фосфорилирование,гЧ-миристоилирование и фарнезилирование белков 76
1.1.8. Стабильность гетерологичных белков 77
1.1.8.1. АТФ-зависимый протеолиз с участием убиквитина 78
Сигналы деградации белков 82
1.1.8.2. Неспецифический АТФ-независимый протеолиз в вакуолях 85
1.1.9. Секреция чужеродных белков 87
1.1.9.1. Сигнальные последовательности 90
1.1.9.2. Протеолиз секреторных белков 95
1.1.9.3. Гликозилирование секреторных белков 99
1.1.9.4. Фолдинг секреторных белков 108
1.2, Продукция рекомбинантных белков в дрожжах Pichiapastoris 114
1.2.1. Особенности метаболизма метилотрофных дрожжей 116
1.2.2. Промоторы генов дрожжей Pichia pastoris, используемые в биотехнологии 119
1.2.2.1. Промотор гена АОХ1 119
1.2.2.2. Промотор гена GAP 121
1.2.2.3. Промотор TQUSLFLDJ 123
1.2.2.4. Промоторы генов PEX8,YPT1 123
1.2.3. Векторы экспрессии дрожжей Pichia pastoris 124
1.2.4. Секреция гетерологичных белков 130
1.2.4.1. Сигнальные последовательности 130
1.2.4.2. Протеолиз секреторных белков 133
1.2.4.3. Гликозилирование секреторных белков 135
1.2.4.4. Формирование дисульфидных связей и внутриклеточный транспорт секреторных белков 139
2. Материалы и методы 143
2.1. Материалы 143
2.1.1. Штаммы 143
2.1.2. Плазмиды 145
2.1.3. Условия культивирования штаммов 146
2.2. Методы 147
2.2.1. Трансформация бактерий и дрожжей 147
2.2.2. Выделение ДНК 148
2.2.3. Методы молекулярного клонирования 148
2.2.4. Полимеразная цепная реакция 148
2.2.5. Определение нуклеотидной последовательности ДНК 149
2.2.6. Электрофорез фрагментов ДНК 149
2.2.7. Выделение фрагментов ДНК из агарозных гелей 150
2.2.8. Определение концентрации белка 150
2.2.9. Электрофорез белков вПААГ 150
2.2.10. Дегликозилирование белков 150
2.2.11. Гибридизация рекомбинантных белков с моноклональными антителами 150
2.2.12. ИммуноферментныЙ анализ 151
2.2.13. Определение биологической активности ИФН и ИЛ-2 151
2.2.14. Определение активности кислых фосфатаз 152
2.2.15. Определение константы Михаэлиса 152
2.2.16. Ионообменная хроматография шозимов Кф на ДЭАЭ-целлюлозе 152
2.2.17. Гель-фильтрация Кф, рекомбинантных ИФН и HBsAg 152
2.2.18. Выделение митохондриальной фракции из клеток дрожжей 153
2.2.19. Определение активности цитохром С-оксидазы 153
2.2.20. Определение активности Р-галактозидазы 153
3. РЕЗУЛЬТАТЫ 154
3.1. Создание системы экспрессии гетерологичных генов под контролем промотора гена PHOS дрожжей Saccharomyces cerevisiae 154
3.1.1. Изучение изозимного состава кислой фосфатазы дрожжей -сахаромицетов 155
3.1.2. Зависимость синтеза Кф2 от уровня белков активаторов 161
3.1.3. Создание штаммов-суперпродуцентов кислых фосфатаз 162
3.2. Клонирование генов фибробластного интерферона человека и иммунного интерферона быка под контролем промотора гена PHOS дрожжей Saccharomyces cerevisiae 164
3.2.1. Получение рекомбинантной шгазмиды рНВІ 174
3.2.2. Влияние генотипа штамма-продуцента на продукцию фибробластного интерферона человека и иммунного интерферона быка 178
3.2.3. Выделение фибробластного интерферона человека и иммунного интерферона быка из клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae 183
3.2.4. Выяснение причин токсичности Р-ИФН человека для клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae 189
3.2.4.1. Влияние рекомбинантного Р-ИФН на синтез белка теплового шока Hsp82p 189
3.2.4.2. Изучение влияния мутацийphoSO ирко85 на жизнеспособность штаммов-продуцентов р-ИФН человека 192
3.2.4.3. Влияние рекомбинантного Р-ИФН и мутаций в гене РН085 на активность цитохром С-оксидазы 193
3.3. Клонирование генов интерферонов человека и животных, гена интерлейкина-2 человека под контролем промотора гена ЛОХ1 дрожжей Pichia pastoris 196
3.3.1. Создание штаммов дрожжей Pichia pastoris с мутациями в генах, гомологичных генам ADE2 и РН085 дрожжей Saccharomyces cerevisiae... 197
3.3.2. Создание штаммов дрожжей Pichia pastoris с дизрупцией гена РЕР4 201
3.3.3. Создание штаммов дрожжей Pichia pastoris, синтезирующих и секретирующих Р-ИФН человека 202
3.3.3.1. Создание вектора экспрессии pHIF 202
3.3.3.2. Определение нуклеотидной последовательности амплиф шифрованного renaIFNB2 человека 206
3.3.3.3. Создание вектора экспрессии pHIF2, обеспечивающего синтез нативного р-ИФН человека 208
3.3.3.4. Получение интегрантов дрожжей, несущих плазмиды pHIF и pHIF2 210
3.3.3.5. Оценка продуктивности штаммов 4-GS115/pHIF H4-GS115/pHIF2 212
3.3.3.6. Определение углеводного компонента рекомбинантного р-ИФН человека, секретируемого дрожжами Pichia pastoris 213
3.3.4. Создание штамма дрожжей Pichia pastoris, обеспечивающего синтез и
внутриклеточное накопление рекомбинантного Р-ИФН человека 215
3.3.4.1. Создание вектора экспрессии pHIVB 215
3.3.4.2. Оценка уровня продукции рекомбинантного р-ИФН человека штаммом 4-GS115/pHIVB 217
3.3.5. Создание штаммов дрожжей Pichia pastoris, синтезирующих и секретирующих аІб-ИФН человека 219
3.3.5.1. Создание вектора экспрессии pHIN 221
3.3.5.2. Получение штамма-продуцента а16-ИФН человека и оценка его продуктивности 221
3.3.6. Создание штаммов дрожжей Pichia pastoris, синтезирующих и секретирующих у-ИФН быка 221
3.3.6.1. Создание вектора экспрессии pPIC9(IFN-y) 221
3.3.6.2. Получение штамма-продуцента у-ИФН быка и оценка его продуктивности 221
3.3.7. Создание штаммов дрожжей Pichia pastoris, обеспечивающих синтез и внутриклеточное накопление у-ИФН быка 221
3.3.8. Создание штаммов дрожжей Pichia pastoris, синтезирующих и секретирующих интерлейкин-2 человека 221
3.3.9. Оптимизация условий культивирования штаммов-продуцентов рекомбинантных секреторных интерферонов 221
3.3.10. Разработка схемы очистки рекомбинантных а16-ИФН и р-ИФН
человека, секретируемых клетками дрожжей Pichia pastoris 221
3,4, Создание штаммов дрожжей Pichia pastoris - продуцентов синтаксина Б, пресинаптического глутаматного рецептора мозга крысы 221
3.4Л. Конструирование вектора экспрессии, обеспечивающего синтез и внутриклеточное накопление синтаксина Б 221
3.4.2. Получение интегрантов дрожжей Pichia pastoris, содержащих в геноме ген STX1B и оценка уровня продукции рекомбинантного синтаксина Б 221
3.4.3. Получение штаммов дрожжей Pichia pastoris, секретирующих рекомбинантный синтаксинБ 221
3.5. Клонирование гена, кодирующего структуру основного белка поверхностного антигена вируса гепатита В, под контролем промотора гена АОХ1 221
3.5.1. Конструирование вектора экспрессии, обеспечивающего секрецию рекомбинантного HBsAg adw и ayw серотипов 221
3.5.2. Получение штаммов дрожжей Pichiapastoris, секретирующих рекомбинантный HBsAg 221
3.5.3. Получение штамма дрожжей Pichiapastoris, обеспечивающего синтез и внутриклеточное накопление рекомбинантного HBsAg 221
4. Обсуждение 221
Влияние структуры вектора экспрессии и числа копий клонированного гена на уровень продукции гетерологичных белков 221
Влияние структуры лидерной области мРНК и присутствия редких кодонов на продукцию гетерологичных белков 221
Посттрансляционная модификация гетерологичных белков 221
Влияние особенностей метаболизма дрожжей S. cerevisiae и P. pastoris на фолдинг рекомбинантных белков 221
Стабильность гетерологичных белков 221
Влияние гетерологичных белков на жизнедеятельность клетки дрожжей 221
Секреция гетерологичных белков 221
Продукция синтаксина Б и HBsAg 221
Оптимизация условий культивирования штаммов-продуцентов 221
Выделение и очистка гетерологичных белков 221
Заключение 221
Выводы 221
Список литературы
- Продукция ре комби нантных белков в дрожжах Saccharomyces cerevisiae
- Транскрипционный активатор, кодируемый геном РН04
- Гибридизация рекомбинантных белков с моноклональными антителами
- Влияние структуры вектора экспрессии и числа копий клонированного гена на уровень продукции гетерологичных белков
Введение к работе
Актуальность проблемы. Международная программа «Геном человека», в реализации которой принимали участие ученые различных стран, в том числе и России, была успешно завершена к концу XX века. Установление структуры генома человека явилось фундаментом для более глубокого понимания молекулярных процессов, происходящих в многоклеточных организмах. В результате этих исследований были выявлены десятки тысяч генов, полиморфизм которых отвечает за предрасположенность к различным заболеваниям, определяет индивидуальную чувствительность к медицинским препаратам. Полученная информация открывает перспективы для лечения заболеваний различной этиологии, дает возможность определить новые мишени для используемых лекарственных препаратов и ставит задачу создания лекарственных препаратов нового поколения на основе белков человека и животных. В первую очередь речь должна идти о белках-иммуномодуляторах, интерферонах и интерлейкинах, которые обладают широким спектром биологических активностей; активируют иммунную систему,' участвуют в формировании и регуляции защитных реакций организма, оказывают антивирусное, антимикробное, противоопухолевое, радиопротективное действие. Многообразие обнаруженных и изученных физиологических функций этих белков, несомненно, указывает на их потенциальную значимость для медицины. Без сомнения подобные препараты позволят проводить направленную терапию, действовать непосредственно на причину заболевания, снизить вероятность побочных эффектов. Получение интерферонов и интерлейкинов из традиционных источников весьма проблематично вследствие ограниченности ресурсов донорской крови, из которой выделяют эти белки, а также в связи с существующей опасностью заражения ВИЧ и вирусами гепатитов В, С. Таким образом, возникает практическая необходимость гетерологичной продукции этих белков.
12 Благодаря успехам генной инженерии созданы штаммы Е. сой -продуценты целого ряда цитокинов. В настоящее время в России зарегистрированы и применяются для лечения препараты рекомбинантных а2-интерферона человека («Роферон», Hoffman-La Roche AG, Швейцария; «Реальдирон», Biotechna, Литва; «Реаферон», Вектор-Медика; «Интераль», НИИ ОЧБ, Россия), (3-интерферона человека («Бетаферон», Schering AG, Германия), интерлейкина-1 человека («Беталейкин», НИИ ОЧБ, Россия), интерлейкина-2 человека («Пролейкин», Chiron Corp., США).
Использование рекомбинантных цитокинов восполняет дефицит эндогенных молекул, повышает эффективность иммунотерапии за счет целенаправленного восстановления иммунной дисфункции. В настоящее время иммунотерапия рекомбинантными цитокинами является одним из наиболее перспективных направлений иммуно фармакологии. Однако бактерии как прокариотические организмы не способны осуществлять посттрансляционную модификацию белков, характерную для эукариотических организмов, а вследствие условной патогенности прокариотических штаммов — продуцентов рекомбинантные белки могут содержать примеси эндотоксинов, поэтому длительное применение рекомбинантных белков бактериальной природы сопровождается нежелательными побочными эффектами.
В связи с этим возникла настоятельная необходимость поиска других организмов для продукции белков человека и животных. Системы экспрессии, созданные на основе многоклеточных эукариотических организмов (культура клеток млекопитающих, трансгенные растения и животные) позволяют получать аутентичные гетерологичные белки. Существенным недостатком этих систем является достаточная сложность работы с культурами клеток и трудоемкость получения трансгенных растений и животных, что увеличивает стоимость получаемых рекомбинантных белков.
13 Компромиссным решением является использование системы экспрессии дрожжей. Дрожжи являются эукариотическими микроорганизмами, поэтому способны обеспечивать корректную посттрансляционную модификацию белков человека и животных. У дрожжей подробно изучены механизмы регуляции матричных процессов и метаболизма, при работе с ними используются стандартные методы генной инженерии, дрожжи легко культивировать на относительно дешевых субстратах. Длительный опыт использования дрожжей Saccharomyces cerevisiae для производства хлеба и напитков свидетельствует о том, что они не являются патогенными для человека. Применение системы экспрессии дрожжей позволяет сочетать простоту бактериальных систем экспрессии и качество белка, получаемое в культуре клеток млекопитающих.
Инициатива создания штаммов дрожжей S. cerevisiae - продуцентов белков медицинского назначения в России принадлежит коллективу ученых лаборатории биохимической генетики Биологического НИИ СПбГУ. В результате их исследований были впервые получены и запатентованы в России штаммы дрожжей S. cerevisiae - продуценты интерлеикина-2, <х16-интерферона, р-интерферона человека и у-интерферона быка.
Уровень продукции интерлеЙкина-2 оказался достаточно высоким, что позволило использовать полученный штамм для производства рекомбинантного белка. В настоящее время «Ронколейкин» (рекомбинантный интерлейкин-2 человека), производимый ООО «БИОТЕХ» (Санкт-Петербург) зарегистрирован Фармкомитетом МЗ РФ в качестве лекарственного препарата. Несомненными достоинствами «Ронколейкина» являются практически полное отсутствие побочных эффектов при его применении, что объясняется использованием в качестве продуцента непатогенных дрожжей, не содержащих токсических и пирогенных факторов, а также относительно низкая стоимость препарата. Эти факторы обусловили широкое применение
14 «Ронколейкина» для лечения септических состояний, ряда онкологических и инфекционных заболеваний.
Уровень продукции а16-интерферона и Р-интерферона человека дрожжами S. cerevisiae оказался явно недостаточным для производства этих белков. В связи с этим особый интерес представляют метилотрофные дрожжи Pichia pastoris. Достоинствами этих дрожжей является накопление значительной биомассы при культивировании на недорогих минеральных средах и более высокий уровень синтеза гетерологичных белков. Возможность интеграции интересующего гена в хромосомную ДНК дрожжей обеспечивает стабильность полученных штаммов - продуцентов. Кроме того, гликопротеины, секретируемые дрожжами P. pastoris, в отличие от дрожжей-сахаромицетов, не содержат терминальных а1,3-связанных маннозных остатков, которые являются сильными антигенными детерминантами. Это позволяет использовать в клинической практике и секреторные формы гетерологичных белков. Гликозилирование рекомбинантного белка повышает его стабильность, что имеет важное значение при выделении белка и использовании его в качестве лекарственного средства. Углеводный компонент играет существенную роль в функционировании гликопротеинов, он вовлечен в процессы связывания антител с антигенами, определяет степень иммуногенности некоторых антигенов, например, поверхностного антигена вируса гепатита В, что необходимо учитывать при создании соответствующей вакцины. Возможность получения секреторных продуцентов интерферонов человека и животных, интерлейкина-2 человека особенно актуальна в связи с тем, что природные интерфероны и интерлейкины являются секреторными белками и только в процессе секреции принимают правильную конформацию.
Целью работы является сравнительное изучение эффективности функционирования систем экспрессии гетерологичных генов у дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris и исследование влияния различных факторов на продукцию рекомбинантных белков.
15 В задачи исследования входит:
создание векторов экспрессии, обеспечивающих синтез и внутриклеточное накопление р-интерферона человека в дрожжах S. cerevisiae и P. pastoris, а также векторов экспрессии, обеспечивающих синтез и секрецию а 16-интерферона, р-интерферона, интерлейкина-2 человека, у-интерферона быка, синтаксина Б мозга крысы, поверхностного антигена вируса гепатита В клетками дрожжей P. pastoris;
получение коллекции мутантов дрожжей P. pastoris;
получение штаммов дрожжей S. cerevisiae и P. pastoris, экспрессирующих гетерологичные гены и синтезирующих белки человека, животных, вирусов, имеющие важное медицинское значение;
изучение влияния генотипа штаммов - продуцентов дрожжей S. cerevisiae на уровень продукции рекомбинантных интерферонов и выяснение возможных причин негативного влияния гетерологичных белков на жизнеспособность штаммов - продуцентов;
оптимизация условий культивирования штаммов — продуцентов и разработка схемы очистки рекомбинантных ссіб-интерфєрона и р-интерферона человека, у-интерферона быка;
сравнение эффективности систем экспрессии дрожжей S. cerevisiae и Р. pastoris и выяснение влияния особенностей метаболизма этих дрожжей на уровень продукции рекомбинантных интерферонов.
Научная новизна исследования. Впервые получены штаммы дрожжей Р. pastoris - продуценты а16-интерферона и р-интерферона человека, у-интерферона быка, синтаксина Б мозга крысы. Впервые получены ade2, pho85 мутанты P. pastoris. При вьыснении причин снижения жизнеспособности штаммов дрожжей S. cerevisiae - продуцентов р-интерферона человека получены данные о возможном функционировании этого гетерологичного белка в клетках дрожжей. Показано, что форма нахождения рекомбинантных
интерферонов в клетках дрожжей зависит от вида штаммов-продуцентов. Впервые предложена гипотеза, объясняющая более высокую эффективность работы системы экспрессии метилотрофных дрожжей и их устойчивость к негативным воздействиям гетерологичных белков.
Практическая ценность. Полученные штаммы дрожжей S. cerevisiae и Р. pastoris ~ продуценты аіб-интерферона, р-интерферона, интерлейкина-2 человека, у-интерферона быка, синтаксина Б, поверхностного антигена вируса гепатита В, могут быть использованы для производства рекомбинантных белков медицинского назначения в создаваемом "Центре малотоннажного производства медицинских препаратов методами генной инженерии", который включен в научно-инновационный блок Программы развития Петергофа как наукограда РФ. Условия оптимизации процессов культивирования штаммов - продуцентов, схема очистки рекомбинантных белков могут быть положены в основу технологического регламента для такого производства.
На основе рекомбинантных интерферонов и интерлекина-2 могут быть созданы лекарственные препараты нового поколения, способные насытить фармакологический рынок России отечественными препаратами и заменить многие зарубежные аналоги. Поверхностный антиген вируса гепатита В может быть использован для разработки еще одной отечественной вакцины для профилактики этого опасного заболевания. Синтаксин Б мозга крысы может быть востребован в фармакологии при проведения исследований, направленных на создание лекарственных препаратов, которые избирательно действуют на различные типы нейрорецепторов.
Продукция ре комби нантных белков в дрожжах Saccharomyces cerevisiae
Достижения молекулярной биологии, генетики микроорганизмов привели к возникновению новой экспериментальной технологии, генной инженерии. Появилась реальная возможность создания штаммов микроорганизмов с заданными свойствами, что явилось одной из причин развития современной биотехнологии, особенно, направления, связанного с микробиологическим синтезом антибиотиков, аминокислот, белков высших эукариотических организмов, рекомбинантных субъединичных вакцин. Для того, чтобы производство биологически активных соединений микроорганизмами было рентабельным, необходимо использовать высокоэффективные штаммы-продуценты. Создание подобных продуцентов невозможно без знания особенностей организации генома и регуляции метаболизма микробной клетки. Поэтому неслучайно, первым объектом биотехнологии оказались бактерии Escherichia coli, у которых детально изучены процессы репликации, транскрипции, трансляции и механизмы регуляции активности генов. Штаммы Е. coli использовали и продолжают использовать для производства аминокислот, белков человека и животных (Дебабов и Лившиц, 1988).
Однако постепенно выявились существенные недостатки Е. coli в качестве продуцента рекомбинантных белков. Так оказалось, что Е. coli, которая является прокариотическим микроорганизмом, не способна осуществлять посттрансляционные модификации белковой молекулы, характерные для эукариотической клетки (протеолитическое процессирование/созревание, образование дисульфидных связей, фосфор ил ирование, гликозилирование). В результате этого рекомбинантные белки могут накапливаться в бактериальных клетках в нерастворимом, неактивном состоянии (Zabriskie a. Arcuri, 1986). Из-за наличия большого количества вирулентных фагов клетки Е. coli подвержены лизису, что затрудняет промышленное культивирование этого микроорганизма. Наконец, Е. coli является условно патогенным микроорганизмом, содержит токсические и пирогенные вещества, что значительно усложняет процедуру очистки рекомбинантных белков (Primrose, 1986).
В связи с этим были начаты работы по поиску других микроорганизмов, более подходящих для синтеза белков эукариотических организмов. Особое внимание исследователей привлекли дрожжи Saccharomyces cerevisiae, что было обусловлено целым рядом причин. Во-первых, дрожжи-сахаромицеты прекрасно изучены генетически, их легко культивировать на относительно простых средах, при работе с ними можно использовать методы молекулярной генетики и генной инженерии. Во-вторых, в отличие от Е. coli, дрожжи являются эукариотическими микроорганизмами и осуществляют посттрансляционную модификацию синтезированных рекомбинантных белков и их секрецию. Именно в процессе секреции многие рекомбинантные белки принимают правильную конформацию. В первую очередь это относится к белкам, которые являются секреторными и в исходном организме. В-третьих, дрожжи S. cerevisiae не содержат токсических и пирогенных веществ и не патогенны для человека (Spencer a. Spencer, 1983). В-четвертых, существует многовековая история применения этого рода дрожжей в пищевой промышленности, в результате чего хорошо освоены методы крупномасштабного культивирования, в процессе которого не происходит лизиса клеток (Eckart a. Bussineau, 1996; Pichuantes et al., 1996).
Таким образом, использование дрожжей для гетерологичной экспрессии является компромиссным вариантом и обеспечивает, с одной стороны, относительную простоту работы, как с бактериальными системами экспрессии, а, с другой стороны, позволяет получать аутентичные рекомбинантные белки, как в более дорогих и трудоемких бакуловирусных системах экспрессии и культуре клеток китайского хомячка (Cereghino а. Cregg, 1999).
Начиная с начала 1980-х годов, дрожжи S. cerevisiae успешно используются для продукции белков человека, животных, растений, особенно таких, которые трудно выделить в значительных количествах из традиционных источников (Romanos et al., 1992).
Экспрессия чужеродного белка в клетках дрожжей является сложным многоступенчатым процессом и включает в себя несколько этапов: клонирование интересующего гена в векторе, содержащем промотор и терминатор транскрипции, трансформация и стабильное поддержание гетерологичной ДНК в микробной клетке; транскрипция гена и синтез рекомбинантного белка и, наконец, выделение и анализ полученного продукта. Создание штамма-продуцента не заканчивается конструированием нужной плазмиды и трансформацией соответствующего штамма-реципиента. Длительный опыт использования дрожжей для гетерологичной экспрессии позволил выявить основные факторы, влияющие на выход рекомбинантного белка. Уровень продукции чужеродного белка зависит от эффективности вектора экспрессии, количества копий клонированного гена, генетической и митотической стабильности плазмиды, генотипа штамма-продуцента, стабильности матричной РНК, эффективности трансляции, корректного процессинга и устойчивости синтезированного рекомбинантного белка к протеолизу. Очевидно, что для получения высокоэффективных штаммов-продуцентов необходимо учитывать данные, полученные при изучении регуляции метаболизма, процессов транскрипции, трансляции, посттрансляционной модификации и секреции белков у дрожжей.
Транскрипционный активатор, кодируемый геном РН04
Белок Pho4p имеет молекулярную массу 33,9 кДа (Legrain et al., 1986). В N-концевой области расположен активирующий домен, в центральной части -участки взаимодействия с белком активатором Pho2p и с негативным регулятором Pho80p. ДНК-связывающий домен, содержащий спираль-виток-спиральную структуру, находится в С-концевой области (Ogawa a. Oshima, 1990). Обнаружена значительная степень гомологии ДНК-связывающих доменов Pho4p и транскрипционных факторов млекопитающих (семейство Мус белков, MyoD, El2, Е47), которые связываются с ДНК в виде димера и узнают палиндромную последовательность CANNTG (E-box). Pho4p также взаимодействует с промотором гена РН05 в виде гомодимера, в образовании которого участвует цистеин, находящийся в 300 положении (Shao et al., 1998).
Делеционный анализ промотора гена РН05 выявил два сайта связывания белка, кодируемого геном РН04: UAS1 и UAS2 (Bergman, 1986; Vogel et al., 1989). Изучение структуры хроматина промотора гена РН05 показало, что в неактивном состоянии (в условиях репрессии) регуляторная область гена содержит 4 нуклеосомы, которые закрывают UAS2, сайты связывания белка Pho2p и TATA бокс (рис. 4). UAS1 находится в коротком гиперчувствительном участке и доступен для связывания Pho4p (Aimer а. Horz, 1986).
В условиях дерепрессии синтеза Кф2 Pho4p находится в ядре (O Neill et al, 1996), связывается с UAS1 при помощи С-концевого домена, при этом активирующий домен Pho4p разрушает нуклеосомную структуру промотора гена РН05 (Svaren et а/.,1994). После этого происходит взаимодействие Pho4p с UAS2, а также Pho2p с собственным сайтом связывания (Aimer et al, 1986; Svaren a. Horz, 1997).
Транскрипционный активатор, кодируемый геном РН02
Белок Pho2p, также известный, как Bas2p и Grf 1 Op, имеет молекулярную массу 63,4 кДа и относится к гомеодоменным белкам (Sengstag a. Hinnen, 1987; Burglin, 1988). Гомеодомен представляет собой консервативный ДНК-связывающий домен, найденный у большого числа эукариотических транскрипционных факторов (Affolter et al, 1990). Специфичность связывания с ДНК определяется последовательностью аминокислот в N-концевом фрагменте гомеодомена (Justice et ah, 1997). Характерной особенностью гомеодоменных белков является их способность к взаимодействию с другими транскрипционными факторами и кооперативному связыванию с ДНК. При этом один и тот же гомеодоменный белок может выступать в качестве коактиватора транскрипции различных генов.
Pho2p является плейотропным активатором. Совместно с белком Swi5p он регулирует экспрессию гена НО (Brazas et al., 1995; McBride et al., 1997). В комплексе с белком Baslp Pho2p активирует транскрипцию некоторых генов биосинтеза пуринов (Daignan-Fornier a. Fink, 1992; Rolfes et al,, 1997; Zhang et al, 1997) и обеспечивает базальный уровень транскрипции гена HIS4 (Arndt et al, 1987). Pho2p принимает участие в регуляции экспрессии генов TRP4 (Braus et al., 1989), CYC1 (Sengstag a. Hinnen, 1988). Оба белка-активатора биосинтеза кислых фосфатаз, Pho2p и Pho4p, регулируют транскрипцию гена СІТІ на среде с глюкозой и глутаминовой кислотой (Padkina et al., 1996; Падкина и ДР., 2003).
Синтез Кф2 зависит от совместного действия белков Pho2p и Pho4p. Pho4p является основным активатором биосинтеза Кф2, определяет базальный уровень транскрипции гена РН05. Функция Pho2p до конца не выяснена. Дрожжи, несущие мутацию в гене РН04, не способны синтезировать Кф2 при увеличении дозы гена РН02, В то же время, отсутствие Pho2p может быть в значительной степени компенсировано белком Gcn4p, активатором общего контроля биосинтеза аминокислот (Белова и др., 1992), или суперпродукцией Pho4p (Berben et al., 1988). При помощи дигибридной системы было обнаружено взаимодействие Pho2p и Pho4p in vivo и показано, что за связывание отвечает участок Рпо4р, расположенный между 200 и 247 аминокислотами (Hirst et al., 1994). Pho4p, лишенный этого фрагмента (Pho4-Л), не взаимодействует с Pho2p и не способен связываться с UAS1 промотора гена РН05. В то же время, укороченный Pho4p взаимодействует с UAS2 и активирует транскрипцию гена Р-галактозидазы, клонированного под контролем данной регуляторной области (Barbaric et al., 1998). Возможно, одна из функций Pho2p состоит в том, чтобы обеспечить связывание Pho4p с UASI. При трансформации мутанта pho2pho4 плазмидами, несущими нативный ген РН04 и ген РН04-А, было показано, что у второго трансформанта активность Кф2 в 2,5 раза выше (Barbaric et al., 1998). Подобные результаты позволяют предположить, что Pho4p содержит домен, репрессирующий его активность. У Pho4p-A этот домен, возможно, удален. Не исключено, что в физиологических условиях Pho2p снимает негативное влияние этого домена и активирует Pho4p (Shao et al., 1996).
Гибридизация рекомбинантных белков с моноклональными антителами
Перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану после разделения в ПААГ проводили по ранее описанной методике (Al-Maghrebi et al., 2002). Нитроцеллюлозную мембрану с иммобилизованными на ней белками инкубировали 2 часа при 37 в буфере TBST (10 мМ трис-HCl, рН 8,0, 150 мМ
NaCl, 0,05% твин-20, 1% BSA), затем 2 часа при 37 с моноклональными антителами к Р-ИФН человека (Boehringer) или а2-ИФН и у-ИФН человека («Протеиновый контур», Санкт-Петербург), или синтаксину Б крысы (предоставлены д-ром Смирновой, Франция), белку S вируса гепатита В (ООО «Хема-Медика», Москва), разведенными в том же буфере, после чего трижды промывали буфером TBST и инкубировали 1 час при 37 с конъгогатом видоспецифических антител и пероксидазы хрена («Протеиновый контур», Санкт-Петербург). После отмывки фильтра буфером PBST (58 мМ Na2HP04, 17 мМ NaH2P04, 68 мМ NaCl, 0,1% твин-20) проявляли белковые комплексы, используя DAB (3, 3-диаминобензидин тетрагидрохлорид) или, в случае синтаксина Б, люминесцентный субстрат ECL (Amersham, США).
Для определения содержания HBsAg использовали тест-систему Вектогеп B-HBs-антиген-стрип (ЗАО «Вектор-Бест»).
Количество рекомбинантного аІб-ИФН человека определяли при помощи набора реактивов ProCon IF2plus («Протеиновый контур», Санкт-Петербург). Определение содержания интересующих белков проводили по методикам, предложенным фирмами - изготовителями.
Биологическую активность рекомбинантных а 16-ИФН и р-ИФН человека определяли по подавлению цитопатическои активности вируса везикулярного стоматита в первичной культуре L-41 кожно-мышечной ткани эмбрионов человека, чувствительной к ИФН а-типа (Liu et al., 2001). В качестве стандарта использовали человеческий лейкоцитарный интерферон ОСО 42-28-90-87 (ГИСК, Москва).
Биологическую активность рекомбинантного ИЛ-2 человека определяли по способности обеспечивать пролиферацию ИЛ-2-зависимых Т-лимфоцитов мыши линии CTLL-2 (Gearing a. Thorpe, 1988). В качестве стандарта использовали BRMP reference reagent human IL-2 (NCI, США).
Определение активности Кф проводили по ранее описанной методике (Падкина и др., 1974). В качестве субстрата использовали п-НФФ натрия. Ферментативную активность выражали в мкМ п-нитрофенола (п-НФ), образующегося при 30 за 1 мин, принимая коэффициент молярной экстинкции п-НФ при длине волны 410 нм равным 12500 (Biggs, 1954), или в условных единицах поглощения при длине волны 410 нм. Удельную активность Кф выражали в мкМ п-НФ/мин-мг белка или в виде отношения поглощения п-НФ при длине волны 410 нм к густоте клеточной суспензии, измеренной при длине волны 550нм.
Способ определения константы Михаэлиса Кф для п-НФФ натрия приведен ранее (Падкина, 1978; Краснопевцева и др., 1986).
Разделение изозимов Кф проводили по ранее описанным методикам (Падкина, 1978; Краснопевцева и др., 1979; Краснопевцева и др., 1986).
Хроматографию рекомбинантных ИФН проводили на сефакриле S100 или S200, уравновешенном 50 мМ Na-ацетатным буфером (рН 5,5), содержащим 0,25 М NaCl. При гель-фильтрации в денатурирующих условиях в состав буфера дополнительно включали 0,1% ДСН, 2,5 мМ ЭДТА, 2 мМ ДТТ. Фракционирование HBsAg проводили на сефарозе 4В, уравновешенной 50 мМ Na-фосфатным буфером (рН 8,0), содержащим 5 мМ ЭДТА.
Дрожжи выращивали в среде ПЕП до середины логарифмической фазы роста. Получали сферопласты, обрабатывая клетки литиказой (Sigma). Сферопласты промывали 1,2 М сорбитом, суспендировали в 10 мМ трис-НС1 (рН 7,5), содержащем 0,6 М маннит, 1 мМ PMSF, и разрушали в гомогенизаторе. Полученный гомогенат осветляли центрифугированием при 5000 об/мин, митохондрии осаждали из супернатанта при 14000 об/мин в течение 20 мин. (Zinser a. Daum, 1995).
Активность фермента определяли при 22 в 1 мл 40 мМ К-фосфатного буфера (рН 6,2), содержащем 0,1% Triton Х-100 и 25 мкМ восстановленного цитохрома С (Sigma). Реакцию запускали добавлением фракции митохондрий. Окисление цитохрома С регистрировали при 550 нм. За единицу активности принимали уменьшение оптической плотности/мин/мг белка (Storrie а. Madden, 1990).
Влияние структуры вектора экспрессии и числа копий клонированного гена на уровень продукции гетерологичных белков
При конструировании плазмиды pHIN применяли те же приемы, что при получении плазмиды pHTF для экспрессии гена IFNB1 человека (Падкина и др., 2000а). Плазмиду pJDB(MS105) (Мясников и др., 19886) использовали в качестве матрицы для амплификации гена IFNA16 человека при помощи ПЦР.
В качестве прямого праймера служил олигонуклеотид 5 ccgc /cgggaaaaga74jTgatctgcctcag-3 , содержащий сайт для рестриктазы Xhol, а также триплеты для лизина и аргинина непосредственно перед первым (TGT) код оном гена IFNA16 для последующего отщепления сигнальной последовательности а-фактора от рекомбинантного белка. В качестве обратного праймера использовали олигонуклеотид 5 ggaa#cctcaatccttccttcttaatcct-3 , который содержит сайт для рестриктазы EcoRI. Амплифицированный ген IFNA16 человека размером 510 п.о. обрабатывали рестриктазами Xhol и EcoRI и лигировали с плазмидой рР1С9, предварительно обработанной этими же рестриктазами.
Далее при помощи рестрикционного анализа доказывали соответствие полученной плазмиды искомой плазмиде pHIN (рис. 49) (Падкина и др., 2002).
На следущем этапе проводили определение нуклеотидной последовательности гена IFNA16, амплифицированного при помощи ПЦР, которая в этом случае была тождественна последовательности нативного гена (Grenefa/., 1984).
Плазмиду pHTN обрабатывали рестриктазой Bglll, полученным линейным фрагментом, содержащим ген IFNA16 человека, промотор и терминатор гена АОХ1, трансформировали штамм 4-GS115 {his4 ade2 pho85::ADE2 рер4::РН085) дрожжей P. pastoris и отбирали интегрантов фенотипа His Muf.
Для доказательства интеграции экспрессионной кассеты в геном дрожжей проводили ПЦР с хромосомной ДНК интегрантов и с теми же праймерами, что при первоначальной амплификации гена IFNA16, Образование фрагмента ДНК 510 п.о. подтверждало интеграцию чужеродного гена в хромосому дрожжей.
Для оценки уровня продукции а 16-ИФН штамм 4-GS115/pHIN (His+ Muf) выращивали в тех же условиях, что штаммы-продуценты [3-ИФН человека. Содержание рекомбинантного белка в культуральной жидкости оценивали при помощи электрофореза в ПААГ в присутствии ДСН и последующей гибридизации с моноклональными антителами к а2-ИФН человека. Параллельно проводили разделение белков исходного штамма, выращенного в идентичных условиях.
При сравнении спектра белков у штамма-продуцента 4-GS115/pHIN обнаруживаются две дополнительные белковые полосы, дающие четкую положительную реакцию с антителами к а2-ИФН человека: основная - с молекулярной массой около 20 кДа, что соответствует молекулярной массе ос16-ИФН, и минорная - около 22 кДа (рис. 50).
Секретируемые рекомбинантные белки не проявляются реактивом Шиффа и, следовательно, не являются гликопротеинами, как и нативный а 16-ИФН. Причиной появления минорной фракции а16-ИФН с молекулярной массой 22 кДа, вероятно, может быть неправильный процессинг белка в процессе секреции.
Сопоставление интенсивности окрашивания полосы рекомбинантного белка с молекулярной массой 20 кДа и полосы маркерного белка (Р-лактоглобина) позволило заключить, что клетки дрожжей штамма 4-GS115/pHIN секретируют не менее 15 мг а16-ИФН человека на литр культуральной среды, что превышает, как минимум, в 15 раз продуктивность штаммов дрожжей-сахаромицетов ВКПМ Y789 и ВКПМ Y790 (Мясников и др., 1988а; Мясников и др., 19886). Биологическая активность рекомбинантного ссІб-ИФН человека составляла 3x10 МЕ/мг. Это дало основание запатентовать штамм 4-GS115/pHIN (ВКПМ Y-2949) в качестве продуцента лейкоцитарного интерферона-16 человека (Падкина и др., 2002).
Ген IFNG быка, как уже упоминалось, был клонирован и экспрессирован в клетках дрожжей-сахаромицетов. Уровень продукции составлял 10 мг рекомбинантного белка на литр культуры (Мясников и др., 19896). Использование в качестве штамма-продуцента рер4 мутанта 2P4-GRF-18 позволило нам повысить выход у-ИФН до 14 мг/л. Однако в обоих случаях гетерологичный белок накапливался внутри клеток в агрегированном состоянии, и требовались специальные процедуры для перевода его в растворимое состояние. Кроме того, рекомбинантный у-ИФН, в отличие от нативного, не являлся гликопротеином, что могло оказывать влияние на его стабильность и растворимость (Sareneva et ah, 1995).
Для получения гликозилированного секретируемого у-ИФН быка мы решили использовать продуценты на основе дрожжей P. pastoris. Учитывая, что уровень продукции аІб-ИФН и Р-ИФН человека в данных дрожжах значительно выше, чем в дрожжах S. cerevisiae, мы надеялись также увеличить выход рекомбинантного у-ИФН быка.
Ген IFNG быка амплифицировали при помощи ПНР, используя в качестве матрицы плазмиду pYGIB (Мясников и др., 19896). При выборе праймеров руководствовались теми же принципами, что и при амплификации генов IFNB1 и IFNA16 человека
