Введение к работе
Актуальность. Явление инактивации одной из двух Х-хромосом у самок высших млекопитающих впервые было описано Мэри Лайон (Lyon, 1961). Инактивация Х-хромосомы - это сложный многостадийный процесс. Важнейшую функцию в регуляции этого процесса выполняет локус Х-хромосомы, получивший название «центр инактивации» (Xic). У мыши в процессе инактивации X-хромосомы задействованы ген Xist и комплементарный к нему ген Tsix, кодирующие нетранслируемые ядерные РНК, минисателлитный локус DXPas34 и район Xite (Boumil, Lee, 2001). Эти участки Х-хромосомы регулируют процесс импринтированнои и случайной инактивации, а также ответственны за определение числа Х-хромосом в клетке и выбор будущей неактивной X-хромосомы. Однако в структуре локуса Xic других видов высших млекопитающих (крыса, корова, собака, шимпанзе, человек) не обнаружено таких элементов как DXPas34, Tsix и Xite (Chureau et al., 2002). Сравнительный межвидовой анализ последовательностей локуса Xic может быть информативен для выявления функционально значимых районов, принимающих участие в процессе инактивации Х-хромосомы у млекопитающих.
Данная работа направлена на исследование структуры 5'-конца гена Tsix обыкновенных полевок рода Microtus, выявление консервативных генетических элементов в локусе Xist/Tsix, установление взаимного расположения генов Cdx4, Chid, Pgkl, Slcl6a2, которые у мыши и человека составляют генетическое окружение гена Xist. Предполагается, что последовательности ДНК, сцепленные с этими генами, являются составной частью центра инактивации и содержат регуляторные элементы, необходимые для функционирования локуса Xic (Clerc, Avner, 2003).
Одной из основных функций гена Tsix считают его подавляющее влияние на экспрессию Xist, задействованного в инактивации Х-хромосомы мыши (Lee, 2000; Sado et al., 2001). Показано, что в экстраэмбриональных тканях мыши экспрессия Tsix импринтирована на Х-хромосоме, унаследованной от матери (Takagi, 1978). Однако у человека не обнаружено импринтированнои инактивации Х-хромосомы (Migeon, Do, 1979). У обыкновенных полевок с помощью биохимических маркеров показано, что в экстраэмбриональных тканях инактивированы гены отцовской X-хромосомы, а Х-хромосома, унаследованная от матери, остается активной (Нестерова, Закиян, 1994). В настоящей работе установлена связь инактивации отцовской Х-хромосомы, обнаруженной на биохимическом уровне, с импринтингом генов Xist и Tsix.
Проведено исследование транскрипционной активности
последовательностей ДНК в окружении генов Xist и Tsix полевки, поскольку ранее было показано, что соотношение смысловой и антисмысловой транскрипции в 5'- и 3'-фланкирующих районах гена Xist оказывает существенное влияние на регуляцию экспрессии этого гена у мыши (Nesterova et al, 2003).
Цель и задачи работы: Исследовать организацию, генетическое окружение и характер экспрессии последовательностей ДНК локуса Xist/Tsix у обыкновенных полевок рода Microtus.
Задачи:
1. Провести определение и контекстный анализ нуклеотидной последовательности 5'-конца гена Tsix у Microtus rossiaemeridionalis с целью
выявления консервативных генетических элементов, участвующих в процессе инактивации Х-хромосомы полевок.
-
Определить локализацию генов Cdx4, Chid, Pgkl, Slcl6a2, которые составляют окружение локуса. XistlTsix у мыши и человека.
-
Исследовать специфичность экспрессии последовательностей локуса XistlTsix в отношении цепи ДНК, хромосомы, пола и стадии развития в соматических и экстраэмбриональных тканях обыкновенных полевок.
Научная новизна. Впервые была определена нуклеотидная последовательность 3'-области гена Xist обыкновенных полевок. Показано, что в районе, гомологичном мажорному промотору гена Tsix мыши, расположена точка инициации транскрипции антисмысловой РНК гена Xist полевки, и, следовательно, локализована зона промотора гена Tsix полевки. Паттерн экспрессии гена Tsix, модулируемый промотором полевки, сходен с таковым мыши. Консервативность мажорного промотора и сходство экспрессии гена Tsix у мыши и полевки свидетельствуют о важности антисмысловой транскрипции в регуляции экспрессии гена Xist и процесса инактивации Х-хромосомы у грызунов.
Впервые выявлена перестройка порядка генов в локусе Xic полевки, в результате чего последовательности минорного промотора Tsix и района Xite оказались замещены геном Slc7a3 и окружающими его последовательностями ДНК. При исследовании транскрипции последовательностей локуса XistlTsix полевки показано отсутствие проявления регуляторного района Xite и минорного промотора гена Tsix на функциональном уровне. Установлено, что соотношение транскрипции смысловой и антисмысловой цепей ДНК в локусе XistlTsix у мыши и полевки обеспечивается за счет экспрессии различных районов локуса.
Положения, выносимые на защиту:
-
Центр инактивации Х-хромосомы обыкновенной полевки перестроен по сравнению с Xic мыши и фланкирован геном Slc7a3 с 5'-стороны гена Tsix. В 3'-фланкирующей области гена Xist локализован район инициации транскрипции антисмысловой РНК, представляющий собой промотор гена Tsix.
-
Регуляция экспрессии генов Xist и Tsix у полевки и мыши обеспечивается за счет транскрипции разных районов локуса Xic.
-
Экспрессия генов Xist и Tsix в экстраэмбриональных тканях полевки импринтирована.
Практическая значимость. Результаты данной работы позволяют разъяснить роль различных генетических компонентов в окружении генов Xist и Tsix в процессе инактивации Х-хромосомы. Обнаружены различия в регуляции процесса инактивации Х-хромосомы у мыши и полевок, участие различных районов локуса XistlTsix в этом процессе. Высказано предположение о существовании альтернативных способов регуляции процесса инактивации X-хромосомы у разных видов высших млекопитающих.
Апробация работы. Результаты работы представлены на второй международной конференции по инактивации Х-хромосомы (Париж, 17-22 сентября 2006 г.), на международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы Молекулярной и Клеточной Биологии» (Томск, 9-12 мая 2007 г.), на международной конференции «Хромосома 2009» (Новосибирск, 31 августа - 6 сентября 2009 г.), семинарах и отчетных сессиях Института цитологии и генетики СО РАН.
По теме диссертации опубликовано две статьи в рецензируемом отечественном и зарубежном журналах.
Вклад автора. Основные результаты получены автором самостоятельно. Контекстный анализ нуклеотидных последовательностей ДНК и поиск регуляторньїх районов в локусе XistlTsix полевки проводился совместно с А.И. Шевченко и Е.А. Елисафенко. Скрининг геномной библиотеки, эксперименты по исследованию экспрессии последовательностей локуса XistlTsix полевки и РНК-FISH анализ выполнялись совместно с А.И. Шевченко. Обработка данных FISH экспериментов проводилась автором совместно с Н.А. Мазурок.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения,' трех глав, заключения, выводов и списка литературы (154 наименования). Работа изложена на 111 страницах, содержит 19 рисунков и 5 таблиц,
