Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Филогения сумчатых и систематическое положение видов Monodelphis domestica и Didelphis virginiana 12
1.2. Цитогенетика сумчатых 13
1.3. Феномен инактивации Х-хромосомы у самок млекопитающих 16
1.4. Структура, происхождение и эволюция центра инактивации X-хромосомы 17
1.4.1. Гены, входящие в состав центра инактивации и элементы, вовлеченные в регуляцию процесса инактивации у мыши и человека 17
1.4.2. Ген Xist и его роль в процессе случайной и импринтированной инактивации Х-хромосомы у плацентарных 20
1.4.3. Происхождение и эволюция генов центра инактивации 22
1.4.4. Видоспецифичность генов центра инактивации, кодирующих нетранслируемые РНК 23
1.5. Модификации хроматина неактивной Х-хромосомы 24
1.6. Гипотезы происхождения импринтированной инактивации X-хромосомы 26
1.7. Аутосомные гены с импринтированной моноаллельной экспрессией 30
1.7.1. Организация кластеров генов с импринтированной моноаллельной экспрессией 31
1.7.2. Импринтированная моноаллельная экспрессия и роль нкРНК в кластерах Ig/2r, Kcnql, Ig/2 32
1.7.3. Эпигенетические модификации при импринтированной моноаллельной экспрессии генов 38
1.7.4. Аутосомньте гены с импринтированной моноаллельной экспрессией у сумчатых 40
Глава 2. Материалы и методы 44
2.1. Объект исследования 44
2.2. Работа с культурами клеток 44
2.2.1. Клеточные линии 44
2.2.2. Получение первичной культуры фибробластов лёгкого 44
2.2.3. Замораживание клеток 45
2.2.4. Размораживание клеток 45
2.3. Микробиологические методы работы 45
2.3.1. Приготовление компетентных клеток Е.coli 45
2.3.2. Трансформация 46
2. 4. Методы выделения ДНК 47
2.4. 1. Методы выделения геномной ДНК 47
2. 4. 2. Выделение ДНК ВАС-клонов 47
2. 4. 3. Метод выделения плазмидной ДНК 48
2. 5. Методики работы с ДНК 49
2. 5. 1. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции 49
2. 5. 2. Электрофорез ДНК в агарозном геле 49
2. 5. 3. Выделение фрагментов ДНК из гелей 50
2. 5. 4. Приготовление радиоактивно меченых зондов 50
2.5.5. Скрининг ВАС библиотек М. domestica и D. virginiana. 52
2.5.6. Анализ ДНК ВАС-клонов и геномной ДНК с помощью блот-гибридизации по Саузерну 52
2.5.7. Субклонирование фрагментов ДНК 53
2.5.8 Полимеразная цепная реакция (ПЦР). 53
2. 5. 9. Определение нуклеотидной последовательности ДНК 54
2. 5. 10. Контекстный анализ последовательности ДНК 55
2 6. Методы работы с РНК 55
2.6.1. Выделение тотальной РНК из культур клеток 55
2.6.2. Синтез кДНК методом обратной транскрипции (RT) 56
2.7 Цитогенетические методы 57
2.7.2. Приготовление препаратов метафазных хромосом 57
2.7.3. Приготовление зондов для флуоресцентной гибридизации in situ 57
2.7 4. Флуоресцентная гибридизация in situ 58
2.8. Выявление позднореплицирующегося хроматина 59
2.9. Иммунофлуоресцентное окрашивание метафазных хромосом 59
Глава 3. Результаты и обсуждение 62
3.1. Получение зондов и скрининг ВАС-библиотек 62
3.2. Сравнительное картирование Х-хромосом опоссумов 63
3.2.1. Установление порядка генов 63
3.2.2. Изучение организации Х-хромосом опоссумов с помощью микродиссекционных проб 69
3.3. Построение и анализ контигов ВАС-клонов, окружающих гены Slcl6a2 и Chicl М. domestica и D. virginiana 68
3.4. Отсутствие прямого ортолога генаXist у опоссумов 75
3.5. Модификации хроматина Х-хромосом у сумчатых 76
3.5.1. Модификации, характерные для активного хроматина 77
3.5.2. Модификации, характерные для неактивного хроматина 82
3.5.3. Общие тенденции в распределении модификаций хроматина Х-хромосом у сумчатых 84
3.6. Механизмы инактивации Х-хромосомы у сумчатых и плацентарных млекопитающих отличаются и, вероятно, имеют независимое происхождение 90
Заключение 92
Выводы 94
Список литературы 95
- Феномен инактивации Х-хромосомы у самок млекопитающих
- Получение первичной культуры фибробластов лёгкого
- Сравнительное картирование Х-хромосом опоссумов
- Отсутствие прямого ортолога генаXist у опоссумов
Введение к работе
Актуальность
Центр инактивации — один из наиболее важных регуляторных локусов генома млекопитающих, который отвечает за контроль экспресии генов целой хромосомы, изменение структуры и свойств хроматина.
В настоящее время достоверно установлено, что у высших млекопитающих ген Xist (X inactive specific transcript) выполняет основные функции центра инактивации Х-хромосомы (XIC), который является главным локусом, управляющим процессом инактивации (Borsani et aL, 1991; Brockdorff et aL, 1991; Penny et aL, 1996; Herzing et aL, 1997). Сумчатые -самые древние млекопитающие, у которых наблюдается инактивация X-хромосомы у самок в раннем эмбриогенезе. Инактивация у сумчатых импринтированная (Sharman, 1971), неполная и тканеспецифическая (Cooper et aL, 1993). Она напоминает инактивацию в экстраэмбриональных тканях .высших плацентарных, и, по-видимому, является отражением предкового механизма инактивации. Данная работа направлена на исследование ранних этапов эволюции системы инактивации Х-хромосомы: исследование центра инактивации и эпигенетических механизмов процесса инактивации у сумчатых.
Так как последовательности Xist эволюционно лабильны, поиск центра инактивации у сумчатых с помощью гетерологичных зондов оказался безрезультатным. Можно было ожидать, что проект по секвенированию генома опоссума Monodelphis domestica даст ответ о наличии центра инактивации у сумчатых млекопитающих. Однако даже последняя версия базы данных проекта не дает полного представления о порядке генов и последовательностях Х-хромосомы опоссума. В данном исследовании была предпринята попытка выявить Xist сумчатых среди последовательностей, сцепленных с консервативными генами Chid и Slcl6a2, которые фланкируют центр инактивации у большинства плацентарных. Сравнение
9 последовательностей группы сцепления Chid - Slcl6a2 у сумчатых и плацентарных млекопитающих представляет огромный интерес, так как позволяет установить этапы эволюции процесса инактивации Х-хромосомы млекопитающих, а также имеет большое значение для понимания механизмов регуляции экспрессии генов и эволюции сложных регуляторных л оку сов, содержащих нетранслируемые ядерные РНК.
В качестве объекта в данной работе использованы два вида сумчатых: североамериканский вирджинский опоссум Didelphis virginiana и южноамериканский серый короткохвостый опоссум Monodelphis domestica, которые широко используются как лабораторный объект для генетических и эволюционных исследований (VandeBerg, 1990; Nesterova et al., 1997).
Цели и задачи работы
Цель работы — поиск генов центра инактивации и исследование модификаций хроматина активной и неактивной Х-хромосом у сумчатых.
Задачи:
Получить зонды Х-сцепленных генов опоссумов, ортологи которых фланкируют центр инактиваци у плацентарных (Slcl6a2, Chid) и расположены вблизи от него (Hprt, Pgkl, Sox2). Провести скрининг геномных ВАС-библиотек двух видов опоссумов с использованием полученных зондов и метода прогулки по хромосоме.
Провести сравнительное картирование Х-хромосом M.domestica и D.virginiana.
Для поиска гена Xist исследовать у опоссумов окружение генов Chid и Slcl6a2, тесно сцепленных и фланкирующих ген Xist у плацентарных, а также последовательности, представленные в проектах по секвенированию геномов сумчатых.
10 4. Исследовать модификации хроматина на активной и неактивной Х-хромосомах M.domestica.
Научная новизна
Настоящее исследование имеет большое значение для понимания процесса инактивации Х-хромосомы сумчатых млекопитающих, который до настоящего времени считался мало изученным. В работе впервые убедительно показано, что у сумчатых, несмотря на наличие процесса инактивации Х-хромосомы, не существует прямого ортолога гена Xist, ответственного за инактивацию Х-хромосомы у плацентарных. Впервые обнаружено, что неактивное состояние хроматина инактивированной X-хромосомы у самок сумчатых связано с триметилированием гистона НЗ по лизину в 9 положении.
Практическая значимость
Практическое значение могут иметь: результаты сравнительного картирования геномов двух видов опоссумов; полученные микродиссекционные пробы Х-хромосом двух видов опоссумов, которые можно использовать в дальнейшем для изучения процессов инактивации, а также в других исследованиях для маркирования Х-хромосом данных видов; установленные в ходе данной работы нуклеотидные последовательности ВАС-клонов, которые позволили существенно дополнить данные проектов по секвенированию геномов опоссумов.
Апробация работы
Результаты работы представлены на второй международной конференции по инактивации Х-хромосомы (Париж, 17-22 сентября 2006 г.), на международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы Молекулярной и Клеточной Биологии» (Томск, 9 — 12 мая 2007 г.), международной конференции «Хромосома 2009» (Новосибирск, 2009 г.), семинарах и отчетных сессиях Института цитологии и генетики СО РАН.
По теме диссертации опубликованы две работы в рецензируемых зарубежных журналах, рекомендованных ВАК.
Вклад автора
Основные результаты получены автором самостоятельно. Микродиссекция Х-хромосом проведена д.б.н. Н.Б. Рубцовым и к.б.н. Т.В. Карамышевой. Скрининг генмных ВАС библиотек проведен совместно с к.б.н. А.И. Шевченко. Секвенирование ВАС клонов выполнено в Wellcome Trust Sanger Institute (Cambridge, UK). Анализ последовательностей ДНК проводился совместно с к.б.н. Е.А. Елисафенко.
Структура и объем работы
Диссертация состоит из введения, 3-х глав, заключения, выводов и списка литературы (116 наименований). Работа изложена на 106 страницах, содержит 13 рисунков и 4 таблицы.
Феномен инактивации Х-хромосомы у самок млекопитающих
У сумчатых и плацентарных млекопитающих в раннем эмбриогенезе у самок происходит подавление транскрипции и гетерохроматизация одной из двух генетически эквивалентных Х-хромосом. Предполагают, что это явление представляет собой механизм дозовой компенсации, который служит для выравнивания уровня экспрессии генов Х-хромосом в клетках самок и самцов (Lyon, 1961).
Сумчатые - наиболее древние млекопитающие, у самок которых происходит инактивация Х-хромосомы. Во всех тканях самок сумчатых происходит неслучайная импринтированная инактивация: инактивируется X-хромосома, унаследованная от отца (Хр) (Sharman, 1971). Неактивное состояние Хр является нестабильным, и зачастую наблюдается реактивация генов. Следует отметить, что инактивация у сумчатых затрагивает не все гены в равной мере, т.е. является неполной. Кроме того, в различных тканях инактивируются разные локусы Хр (Cooper et al., 1993).
У некоторых видов плацентарных млекопитающих, таких, как грызуны, импринтированная, неполная и нестабильная инактивация Хр происходит на предымплантационных стадиях развития эмбриона и сохраняется в клетках, из которых формируются внезародышивые органы -плацента и желточный мешок. В клетках, из которых формируются ткани собственно эмбриона, во время имплантации происходит реактивация Хр и последующий процесс случайной инактивации либо отцовской, либо материнской Х-хромосомы. Случайная инактивация, в отличие от импринтированной, охватывает большинство генов Х-хромосомы и стабильно поддерживается в ряду клеточных поколений.
Считается, что, импринтированная инактивация является исходной формой и может отражать предковый механизм данного поцесса, поскольку имеет место у сумчатых - древних представителейкласса млекопитающих.
Как случайная, так и импринтированная инактивация у плацентарных контролируется центром инактивации (X lactivation Centre, XIC) и геном Xist (X inactive specific transcript gene).
Доказательства существования единственного локуса, отвечающего за инактивацию Х-хромосомы, были получены в экспериментах на мышах с X -аутосомными транслокациями (Russell, 1963; Russell, Montgomery, 1970). Было обнаружено, что только одна часть Х-хромосомы, разделенной реципрокной транслокацией, способна инактивировать примыкающие аутосомные локусы. С помощью импульсного введения Н -тимидина в клеточные культуры с X - аутосомными транслокациями показано, что только один из продуктов транслокации подвергался инактивации, а другой оставался активным и не проявлял аллоциклической репликации. Был сделан вывод, что хромосомный материал остается активным до тех пор, пока не получит сигнала инактивации от Xic. Поэтому для инактивации любого района Х-хромосомы необходима физическая связь с центром инактивации (иначе говоря, в цис-положении) (Lyon, 1986; 1991).
В центр инактивации человека и мыши включают следующие гены: Slcl6a2, Cnbp2, Ftx, Епох (Jpx), Xist, Tsix, Xite, Tsx, Chic J, Cdx4 (Johnston et al., 2002; Rougeulle, Avner, 2003; Ogawa, Lee, 2003) (Рис. 2). Гены Xist, Tsix, Ftx, Епох (Jpx) и Xite кодируют нетранслируемые РНК. Гены Slcl6a2, Cnbp2, Tsx, Chic 1, Cdx4 кодируют белок. У человека Tsx является псевдогеном (Rougeulle, Avner, 2003). Ориентация генов (за исключением гена Slcl6a2) внутри Хіс у человека и мыши не отличается (за исключением гена Slcl6a2). Xic человека имеет размер примерно 2,3 млн.п.н., что в три раза превышает размер Xic мыши (Chureau et al., 2002). Xist — ключевой ген, регулирующий процесс установления транскрипионно неактивного состояния Х-хромосомы.
Кроме того, в Xic выявлены еще два гена, кодирующих ядерную РНК, — Enox(Jpx) и Ftx (Nesterova et al., 2002; Chureau et al., 2002). Их функции в процессе инактивации не известны, но район, в котором они локализуются, предположительно, является центром для связывания (nucleation centre) РНК Xist (Heard et al, 2001).
В XIC мыши имеются еще два гена, продуцирующих ядерную РНК, six, экспрессирующийся по анти-смысловой цепи к гену Xist, и Xite (X-inactivation intergenic transcriptional element). Как показано, они регулируют экспрессию Xist при импринтированной и случайной инактивации и задействованы в механизмах подсчета числа Х-хромосом на диплидный набор аутосом и выбора будущей неактивной Х-хромосомы (Lee, 2005).
Известно, что продукты белок-кодирующих генов, входящих в Xic, не участвуют в регуляции процесса инактивации. Однако последовательности, сцепленные с ними, важны для подсчета и выбора будущей неактивной X-хромосомы. Делеции последовательностей в районе генов Slcl6a2 (Augui et al., 2007), Tsx и Chicl, а также Cdx4 и двух генов, не входящих в XIC: Ррпх и Naplll, приводят к нарушению подсчета и дальнейшей инактивации X-хромосомы. Orthologous - 65o-i2ooKB genes
Получение первичной культуры фибробластов лёгкого
В работе использовали первичную культуру фибробластов легкого самки и самца М. domestica. Опоссумов умерщвляли методом цервикальной дислокации и окунали в 70% этиловый спирт. Легкое измельчали ножницами, переносили в трипсин и оставляли при 37С в С02-инкубаторе на 15 мин-1,5 ч. Суспензию тканей в трипсине собирали в коническую пробирку и центрифугировали 5-Ю мин. при 1000 об/мин. Осадок клеток переносили в культуральную емкость с необходимым количеством среды.
Для заморозки клетки снимали, как при пересадке, центрифугировали 5 мин при 1000 об./мин, супернатант сливали, к клеткам добавляли раствор, содержащий 10% ДМСО и 90% ростовой среды. Осадок аккуратно ресуспендировали и заливали суспензию в ампулы для заморозки клеток. Для медленного замораживания клеток ампулы в специальных пенопластовых боксах помещали кельвинатор на -70 С. Для хранения ампулы с клетками переносили в жидкий азот.
Ампулы с клетками быстро размораживали при 37С. Суспензию клеток переносили в коническую пробирку с культуральной средой и центрифугировали 5 мин при 1000 об./мин. Далее супернатант сливали, клетки ресуспендировали в ростовой среде и переносили в культуральную емкость.
Клетки E.coli (XL2Blue MRF ) выращивали в среде SOB (0.05% NaCl; 2% бактотриптон; 0.5% дрожжевой экстракт; 2.5 мМ КС1; 10 мМ MgCl2; рН 7.5) при 37С на качалке до оптической плотности 00550=0.55-0.65 о.е. Культуру охлаждали на льду 30 мин. Клетки собирали центрифугированием в течение 10 мин (3000 об./мин.) при 4С. Надосадочную жидкость сливали. Осадок суспендировали в 10 мл холодного буфера для трансформации FSB (ЮмМ ацетат калия, рН 7.5; 100 мМ КС1;45 мМ MgCl2; 10 мМ СаС12; 3 мМ гексааминохлорид кобальта), и инкубировали на льду 15 мин. Затем клетки повторно осаждали и суспендировали в 1.8 мл FSB. К получившейся суспензии осторожно по капле добавляли 65 мкл ДМСО и оставляли на льду на 15 мин. Затем к суспензии добавляли еще 65 мкл ДМСО и инкубировали на льду 15 мин. Готовые клетки замораживали аликвотами на сухом льду и хранили в морозильной камере при -80 С. Для трансформации использовали 50 мкл клеточной суспензии.
К 50 мкл компетентных клеток в пластиковой пробирке добавляли 0.1 мкг рекомбинантной плазмидной ДНК в буфере для лигирования или ТЕ (10 мМ Трис-HCl; рН 8.0; 1 мМ ЭДТА) и инкубировали 30 мин. на льду. Затем клеточную культуру подвергали тепловому шоку на водяной бане при 42С в течение 30 с. После этого к клетками добавляли 1 мл среды LB и инкубировали на качалке 1 ч при 37 С. 10-100 мкл клеточной суспензии высевали на чашку Петри с 1.5% агаром, который содержал 50 мкг/мл ампициллина, 0.04% X-gal (5-бромо-4-хлоро-3-индол-Ь-С)-галактозид), и инкубировали 10-15 часов при 37 С. При работе со штаммом XL2Blue в агар добавляли ИПТГ (изопропил-Ь-О-галактопиранозид) до концентрации 0.015%.
Клетки перевиваемых культур опоссума снимали с культуральных матрасов с помощью трипсина, переносили в культуральную среду, центрифугировали при lOOOg 3 мин, промывали фосфатным буфером и осаждали.
Осадок клеток дважды промывали 10 объемами буфера STE (0.15 М NaCl; 50 мМ Трис-HCl, рН 7.5; 20 мМ ЭДТА). Лизис клеток проводили 2-4 часа при 55С, предварительно добавив в суспензию протеиназу К до 10 мкг/мл и SDS до 1%. Очистку ДНК от белков осуществляли последовательной обработкой лизата фенолом, смесью фенол-хлороформ (1:1) и хлороформом. ДНК осаждали в 75% этаноле. Осадок ДНК собирали на стеклянную палочку, промывали в 70% этаноле и растворяли в подходящем объеме ТЕ-буфера (Слободянюк и соавт., 1994).
Сравнительное картирование Х-хромосом опоссумов
В ходе выполнения задачи по сравнительному картированию Х-хромосом М. domestica и D. virginiana впервые были установлены_порядок и взаимное расположение генов Sox3, Rbmx, Chid, Sld6a2, Pgkl, G6pd, Hprt на Х-хромосомах данных видов опоссумов. Для этого была проведена ДНК-FISH на обычных и механически растянутых хромосомах с использованием в качестве зондов отдельных ВАС-клонов, содержащих соответствующие гены (рис. 4). Небольшая акроцентричесая Х-хромосома М. domestica имеет следующий порядок генов: G6pd и Chid локализуются вблизи центромеры и в проксимальной области Х-хромосомы, Hprt, Rbmx, Sox3 — в центре большого плеча, Slcl6a2, Pgkl — в дистальной области. Таким образом, гены Chid и Slcl6a2, которые являются тесно сцепленными и фланкируют ген Xist у всех изученных видов плацентарных млекопитающих, разделены на Х-хромосоме М. domestica. У D. virginiana эти гены также разделены: Chid локализуется на коротком плече Х-хромосомы, в то время как Slcl6a2 — в теломерном районе длинного плеча (рис. 5).
В рамках задачи по сравнительному картированию для более детального изучения организации Х-хромосом М. domestica и D. virginiana с помощью микродиссекции были получены ДНК-зонды полных метафазных Х-хромосом каждого вида (Shevchenko et al., 2007). Микродиссекционные пробы М. domestica и D. virginiana обнаруживали один интенсивный сигнал вдоль всей Х-хромосомы на метафазных пластинках соответствующих видов (рис. 6, А, В). При гибридизации проб D. virginiana на метафазные хромосомы М. domestica и проб М. domestica на метафазные хромосомы D. virginiana было обнаружено, что эти пробы локализуются преимущественно в эухроматиновых районах Х-хромосом противоположных видов и отсутствуют в районах гетерохроматина (рис. 6, С, D). Эухроматин представлен единым блоком на Х-хромосоме М. domestica и в виде трех разделенных блоков на Х-хромосоме D. virginiana. Общее количество эухроматина Х-хромосом, идентифицированного с помощью микродиссекционных проб, одинаково у обоих видов, в то время как размер гетерохроматиновых блоков увеличен на Х-хромосоме D. virginiana, что привело к увеличению общего размера Х-хромосомы. По литературным данным, подобного рода различия в размерах Х-хромосом описаны для видов с разным числом хромосом в диплоидном наборе и связаны с различиями в содержании конститутивного гетерохроматина между видами (Svartman, Vianna-Morgante, 1999). Небольшие эухроматиновые районы Х-хромосомы D. virginiana, которые располагаются в центре короткого плеча и в дистальной части длинного плеча, могли возникнуть из одного предкового блока в результате инверсий. Район, вовлеченный в перицентрическую инверсию, расположен выше Hprt и включает в себя гены Chid и G6pd. Точка разрыва инверсии, перенесшей эухроматиновый район на конец большого плеча Х-хромосомы у D. virginiana, локализуется ниже генов Slcl6a2 и Pgkl, так как эти два гена не вовлечены в эту перестройку (рис. 6, Е). Slcl6a2 и Chid М. domestica и D. virginiana. Для реализации задачи по поиску ортолога гена Xist у опоссумов было проведено исследование организации последовательностей, окружающих гены Slcl6a2 и Chid, _ортологи которых- у плацентарных тесно сцеплены с Xist. Были сгенерированы протяженные контиги.
Нуклеотидные последовательности, фланкирующие встройку в рекомбинантной ДНК ВАС-клонов, дающих позитивные ответы на Slcl6a2 и Chid — ген-специфические пробы, были идентифицированы с помощью секвенирования при использовании универсальных праймеров Т7 и SP6. Каждый участок с определенной нуклеотидной последовательностью ("конец ВАС-клона") был проанализирован программой RepeatMasker (Pearson and Lipman, 1988) для обнаружения и маскировки повторов. На уникальные участки последовательностей были подобраны праймеры (табл. 4). Полученные ПЦР-продукты были тестированы с помощью Саузерн-блот гибридизации с геномной ДНК опоссумов, гидролизованной рестриктазой EcoRI, для того, чтобы убедиться в уникальности паттерна гибридизации и затем использовать эти пробы для дальнейшего скрининга ВАС-библиотек.
Каждый вновь изолированный клон был проверен с помощью FISH, чтобы убедиться, что он имеет туже самую локализацию на Х-хромосомах опоссумов, что и исходный ВАС-клон, последовательность конца которого служила в качестве зонда.
Взаимное расположение ВАС-клонов, полученных в результате прогулки по хромосоме, определяли с помощью блот-гибридизации, используя зонды на участки, фланкирующие встройки ВАС-клонов и различные экзоны последовательностей генов Chid и Slcl6a2. Таким образом, были получены контиги, окружающие гены Slcl6a2 и Chid у М. domestica и D. virginiana (рис. 7), которые затем по возможности дополнили последовательностями, полученными в результате выполнения проекта по секвенированию генома М. domestica (http://penome.ucsc.edu/ и http://www.ensembl.org/) и другими доступными последовательностями. Полное секвестрование ВАС-клонов ОМ 191G11, ОМ 158F12, ОМ 068С1, LBNL3 266N1 и VMRC-6 529L22 было проведено в Wellcome Trust Sanger Institute, Cambridge, UK. Последовательности доступны в EMBL под номерами: CR385029, CR387999, CR387990, CU075922 и CR753179 соответственно.
Отсутствие прямого ортолога генаXist у опоссумов
Таким образом, в результате проведенной работы показано, что, несмотря на значительные различия в размерах и морфологии Х-хромосом, у М. domestica и D. virginiana количество Х-сцепленного эухроматина и его генетическое содержание одинаково у обоих видов опоссумов. Установлено, что различия в морфологии Х-хромосом у опоссумов связаны с перицентрической инверсией у D. virginiana, в результате которой у данного - - вида-произошел-перенос-через центромеру небольшого эухроматинового участка, и сформировалось малое плечо Х-хромосомы. Различия в размерах Х-хромосом опоссумов, вероятно, связаны с амплификацией видоспецифических повторов, произшедшей в результате инверсий у D. virginiana, которая привела к формированию прицентромерного и прителомерных блоков гетерохроматина и к увеличению размеров X-хромосомы у данного вида.
Картирование генов показало, что Х-хромосомы опоссумов в ходе эволюции претерпели перестройки, в результате которых гены Chicl и Slcl6a2, тесно сцепленные у курицы и плацентарных млекопитающих, оказались разделены на Х-хромосомах опоссумов. При этом у D. virginiana имеется дополнительная по сравнению с М. domestica инверсия, в результате которой Cdx4 и Chicl были перенесены на малое плечо Х-хромосомы и отдалены центромерой и блоком прицентромерного гетерохроматина от основной массы Х-сцепленных генов, таких как Sox3, Rbmx, Slcl6a2, Pgkl, G6pd and Hprt, облигатно подвергающихся X инактивации у плацентарных млекопитающих. Можно отметить, что у D. virginiana ген G6pd, избегающий инактивации, располагается ближе к генам Cdx4 и Вгх, чем инактивирующийся ген Pgkl, тесно сцепленный с Slcl6a2.
Показано, что картированные ранее на Х-хромосоме опоссумов гены ЬпхЗ и Raslllc (Duret et ah, 2006) непосредственно сцеплены с геном Chicl. Ген Fipl сильно дивергировал и не является функциональным геном, тогда как ген ЬпхЗ продуцирует мРНК, имеет нативную открытую рамку считывания (Duret et al., 2006), и, очевидно, функционирует как белок-кодирующий ген, а не как нетранслируемая ядерная РНК, подобная Xist. Таким образом, у сумчатых, несмотря на наличие у них процесса инактивации, предполагаемый район локализации XIC не гомологичен XIC млекопитающих, а имеет сходство с генами Fipl и ЬпхЗ курицы, и, очевидно, не выполняет функций центра инактивации. Следует особо подчеркнуть, что дивергировавшие фрагменты гена Fipl и ген ЬпхЗ опоссумов гомологичны соответствующим генам курицы лишь" на 60% и практически утратили сходство с генами Tsx и Xist плацентарных млекопитающих, которое было отмечено для генов Fipl и ЬпхЗ курицы (Duret et al., 2006). Существует небольшая вероятность, что район, содержащий гены Fipl, ЬпхЗ, Raslllc был дуплицирован на Х-хромосомах опоссумов, и другая еще неизученная копия этого района окажется более сходной с геном Xist, чем та, которая исследована. О такой возможности свидетельствует, например, произошедшая в данном районе генома у опоссумов дупликация гена Cdx4. Тем не менее, полученные к настоящему моменту результаты свидетельствуют, что у опоссумов не существует прямого ортолога гена Xist и инактивация Х-хромосомы у сумчатых, в отличие от плацентарных млекопитающих, происходит без участия данного гена. В заключение можно отметить, что мы не отрицаем полностью возможность участия какой бы то ни было РНК в процессе инактивации Х-хромосомы у сумчатых, так как этот процесс у опоссумов сопровождается модификациями хроматина, такими как ацетилирование гистонов и поздняя репликация, установление которых зачастую связано с некодирующими ядерными РНК.
Известно, что у сумчатых, в отличие от плацентарных, инактивация X-хромосомы является неполной и тканеспецифичной. Еще одной особенностью инактивации Х-хромосом сумчатых является реактивация неактивной Х-хромосомы в перевиваемой культуре клеток. Поэтому в работе по исследованию модификаций хроматина Х-хромосом М. domestica наряду с перевиваемыми культурами фибробластов легкого, полученными ранее в лаборатории, использовали первичные культуры фибробластов легкого самки и самца. Изначально все клетки в перевиваемых культурах имели диплоидный набор хромосом, однако в процессе длительного культивирования в большинстве клеток произошла полиплоидизация, и клетки приобрели тетраплоидный набор хромосом. При этом в ряде случаев в перевиваемых культурах наблюдается элиминация хромосом, в том числе половых. В экспериментах с использованием первичных культур анализировали 30 метафазных пластинок, с использованием перевиваемых культур — 50. Применяемые антитела широко используются в исследованиях модификаций хроматина у млекопитающих, кроме того, специфическая гибридизация с определенными районами модифицированных гистонов была проверена в лаборатории в культурах клеток человека, мыши и полевки.
