Картирование генов на хромосомах крупного рогатого скота методом гибридизации соматических клеток Стрельченко Николай Степанович

Содержание к диссертации

Введение

Часть I. Обзор литературы 7

1.1.. Методы картирования генов 7

1.2.Гибридизация соматических клеток 10

I.3.Селективные и полуселективные методы выделения гибридных клеток 16

1.4. Элиминация хромосом в межвидовых гибридных клетках 25

1.5.Идентификация хромосом в кариотипах гибридных клеток 30

1.6.Идентификация продуктов действия генов 35

1.7.Статистические методы анализа хромосом в гибридных клетках 37

Часть 2. Экспериментальные исследования 39

2.1.Материалы и оборудование 39

2.I.I.Биологический материал 39

2.1.2.Посуда 39

2.1.3.Среды и реактивы 40

2.1.4.Прибрры и оборудование 41

2.2.Методики выполнения работы 42

2.2.1. Получение первичных культур клеток 42

2.2.2.Выделение лимфоцитов 43

2.2.3.Культивирование клеток 44

2.2.4.Слияние клеток 46

2.2.5.Окрашивание и анализ гибридных кариотипов 48

2.2.6.Электрофоретический анализ гибридных клонов 49

2.2.7.Статистический анализ гибридных клонов 51

Часть 3. Результаты исследования 54

3.1. Кариотипы родительских клеток 54

3.І.І.Характеристика кариотипа крупного рогатого скота 54

3.1.2.Характеристика перевиваемой линии клеток СН0-К1пРо~59

3.2.Поиск наилучших вариантов слияния клеток 62

3.3.Кариологический анализ гибридных клонов 66

3.4.Картирование полигенного признака про+ методами пря

мой и обратной селекции гибридных клонов 80

3.5.Анализ данных электрофоретического разделения экстрак

тов клеток гибридных клонов 85

3.б.Локализация генов ЛДГ-А,ЛДГ-В,Г6ФД и обсуждение полу

ченных результатов по картированию генов 91

Выводы 100

Список литературы

• Методы картирования генов
• Элиминация хромосом в межвидовых гибридных клетках
• Получение первичных культур клеток
• Кариотипы родительских клеток

Введение к работе

В современной генетике под термином картирование генов принято понимать локализацию участка ДНК,кодирующего синтез определенной полипептидной цепи, на метафазных хромосомах. Создание таких генетических карт может стать ключом для понимания процессов дифференцировки клеток, уточнения процессов видообразования и в решении ряда важных задач целенаправленной селекции.

Методическое решение проблемы картирования представляет большую сложность, несмотря на обилие различных подходов. К классическому методу картирования, с помощью которого была построена первая генетическая карта плодовой мушки дрозофилы, относится статистический анализ мейотических рекомбинантов(91) С дальнейшим развитием генетики появились другие методы, с помощью которых создавались генетические карты различных видов животных и человека. Биологические особенности живых существ различных видов, классов и типов накладывают ограничения на возможность широкого применения какого-либо одного метода. Особую сложность в этом плане вызывала работа с сельскохозяйственными животными. Об этом свидетельствуют весьма скудные сведения о локализации генов на их хромосомах (39).С уверенностью можно сказать, что в настоящее время не существует универсального метода,применяя который можно построить полные генетические карты всех многоклеточных организмов.

Открытие явления гибридизации соматических клеток(21) дало возможность исследователям освоить новый метод картирования генов, в т.ч. и у сельскохозяйственных животных. Смысл нового метода сводится к получению in vitro нового - 5 -типа клеток, анализ которых позволяет установить связь "ген-хромосома". При слиянии соматических клеток отдаленных видов в культуре образуются гибридные клетки с суммарным геномом исходных родительских клеток. Элиминация хромосом в последующих генерациях гибридных клеток приводит к тому,что генетический материал, преимущественно одной из родительских форм, частично редуцируется. Этот процесс носит спонтанный характер и дает возможность получения гибридных клонов с различным составом хромосом.

Сопоставление фенотипического проявления маркерных генов с кариологическим анализом клонов позволяет установить связь "маркер-хромосома". Здесь возможны два пути локализации. Первый сводится к выявлению определенной хромосомы, а второй к поиску синтенных групп генов, т.е. генов, локализованных в одной хромосоме.

Целью настоящей работы является изучение вопросов частной генетики крупного рогатого скота с использованием современных достижений в области цитогенетики и электрофоретичее-ких методов разделения ферментов в анализе гибридных клонов соматических клеток.

Задача, обусловленная постановкой цели в данной работе, сводится к следующему положению: используя экспериментальный подход в области гибридизации соматических клеток картировать группу генов крупного рогатого скота. Для решения поставленной задачи было решено картировать гены, кодирующие синтез ферментов ДЦГ, Г6ФД и полигенный признак про⁺, который кодирует гены коровы, компенсирующие при гибридизации проли-новую недостаточность в клетках перевиваемой линии СН0-КІ про". Выбор этих генов был продиктован следующими сообра- жениями:

Лактатдегидрогеназа состоит из двух типов субъединиц, кодируемых двумя независимыми генами.

Ген глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа (Г6ФД) у многих млекопитающих локализован в Х-хромосоме (96) .Поэтому с нашей стороны было логично предположение о локализации его у крупного рогатого скота тоже в Х-хромосоме, что позже было подтверждено литературными данными (62).В связи с этим, правильность локализации этого гена могла послужить одним из ориентиров достоверности полученных данных.

При электрофорезе вышеупомянутые ферменты у клеток китайского хомячка и коровы имеют различную электрофорети-ческую подвижность,что упрощает их видовую принадлежность.

Группа генов про⁺ может использоваться как селективный маркер при отборе гибридных клеток

Таким образом в случае присутствия в гибридных клетках хромосом коровы,детерминирующих эти гены их фенотипи-ческое проявление будет всегда обнаружено.

Основное положение выдвигаемое на защиту состоит в обосновании возможности локализации вышеупомянутых маркерных генов с использованием следующих методических приемов: -гибридизации соматических клеток -прямая и обратная селекция гибридных клонов соматических клеток -кариологический и электрофоретический анализы гибридных клонов.

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Генетика соматических клеток, как самостоятельная отрасль генетики, определилась сравнительно недавно.Она возникла на основе работ по культивированию соматических клеток in vitrp3aAa4eft этого нового направления является изучение механизмов и законов наследственности на клеточном уровне. Одной из частных проблем генетики соматических клеток является создание генетических карт.

I.I. МЕТОДО КАРТИРОВАНИЯ ГЕНОВ.

В I960 году Понтекорво (102) высказал предположение,что ошибки,возникающие при мейозе,могут стать источником информации о рекомбинациях генов у человека,аналогично тому, как митотические рекомбинанты были использованы в генетическом анализе Aspergillus nid _# При совместном культивировании различных мицеллиев Aspergillus образовывались спонтанные гетерокарионы.Такие многоядерные мицелии,содержащие гаплоидные ядра могут существовать без дальнейших изменений. Однако, иногда два типа гаплоидных ядер внутри гетерокариона сливались в одно,и диплоидный мицеллий продуцировал вегетативные диплоидные споры.Необходимо отметить крайне малую вероятность этого события.В отдельных случаях хромосомы таких диплоидных ядер элиминируются и иногда имеют перестройки образованные митотическим кроссинговером.Подобные генетические изменения в единичных ядрах могут регистрироваться при отделении от мицеллия вегетативных спор.Сегрегация целых хромосом позволила установить группы локусов в соответствующих хромосомах и изучая частоту кроссинговерных перестроек определить линейный порядок генов на хромосоме.Данные полученные - 8 -этим путем послужили основой для построения генетической карты Aspergillus nidulans.

Подобный путь создания генетических карт неприемлем для генетики высших позвоночных.Это обусловлено низкой жизнеспособностью мутантов.Наиболее просто картировать гены,сцепленные с Х-хромосомой.Это было проиллюстрировано на примере нескольких локусов,известных как Х-сцепленных (84).

Установление локализации генов,находящихся в аутосомах, требует иного подхода.Первая генетическая карта плодовой мушки Drosophila была составлена Морганом (91).Создание этой карты базировалось на изучении частот мейотического кроссинговера.Использование статистического метода семейного анализа Никифоров (10) показал сцепленность трех казеиновых генов крупного рогатого скота и указал на относительное расстояние между ними.

Применение метода дозы генов позволило локализовать на хромосомной карте человека некоторые гены.Этот метод основан на том,что активность генов при трисомии достигает 150%, а при делециях - 50%.Вследствие ошибок,возникающих при мейозе, возникают различные варианты моносомиков и трисомиков, вызывающие различного рода генетические заболевания.Сюда можно отнести синдром Дауна (74),17-трисомию (40),синдром Тернера (46).

Фергюсон-Смит и его сотрудники описали метод картирования генов,который включает в себя тестирование гетерози-готности у пациентов с моносомией или делециями.Однако этот метод позволяет скорее исключить исследуемые гены из определенной хромосомы,чем гарантировать их наличие.Хотя такое исключение может дать и полезную информацию.Так например лока- - 9 -лизация локуса группы крови Eh. в коротком плече хромосомы I, лактатдегидрогеназы-В (ДЦГ-В) на коротком плече хромосомы 12 (112), а также локализация гена кислой фосфатазы эритроцитов в коротком плече хромосомы 2 (44) установлены именно этим путем.

К чисто визуальному картированию по праву можно отнести метод гибридизации in situ .Его суть сводится к прямой гибридизации на метафазных хромосомах копии меченной изотопами ДНК,полученной при обратной транскрипции определенного вида РНК Локализация ДНК на хромосомах устанавливается с помощью авторадиографии.Этим методом была показана возможность локализации единичных копий ДНК человеческого генома (60).

Открытие метода гибридизации соматических клеток (21) открыло новую эру в составлении генетических карт различных видов животного мира.Первым геном картированным с помощью этого метода был ген человеческой тимидинкиназы (тк~) (126). Последующее развитие методов дифференциальной окраски хромосом, дало возможность точно идентифицировать видовую принадлежность хромосом в гибридных клетках, а также различного рода транслокации и делеции хромосомного материала,что позволило более точно локализовать картируемые гены (52,68). ^{1.2. гибридизация соматических клеток.}

Генетически потенциальные возможности гибридизации соматических клеток были по достоинству оценены Клейном (67): "Гибридизация соматических клеток - точный инструмент для понимания действия посторонней цитоплазмы на ядро, клеточной дифференцировки, факторов, контролирующих митоз и злокачественность и генетику соматических клеток человека".

Факт спонтанной гибридизации клеток впервые был открыт Барским (21). Работая с двумя линиями мышиных фибробластов, при их совместном культивировании он обнаружил новый тип клеток. Последние пролиферировали гораздо активнее, чем клетки исходных линий, и содержали в кариотипе маркерные хромосомы обеих линий. Модальное число хромосом в среднем равнялось сумме модальных чисел хромосом линий, подвергнутых совместному культивированию.

Спонтанная гибридизация - явление довольно редкое. Поэтому открытие Харрисом (58) индуктора слияния стало революционной вехой в гибридизации соматических клеток. В качестве индуктора слияния был использован вирус парагриппа, или японский гемагглютинирующий вирус ^HVJ (56).

Агглютинирующее действие этого вируса было показано ранее Окадай (97). Однако Окаду больше интересовал механизм действия вируса, и свои исследования дальнейшей судьбы агглютинировавших клеток он не продолжил. Таким образом, Хар-рису впервые удалось получить межвидовые гетерокарионы искусственным путем (58). Суть использованного им метода сводилась к следующему: к суспензии клеток добавляли инактивированную форму вируса и встряхивали при +4С. Последующая инкубация клеточной суспензии при +37 С приводит к тому, что слипшие- - II - ся клеточные конгломераты сливаются и образуют поликарионы. В дальнейшее деление могут вступать гомо- и гетерокарионы типа I + I, 1+2, реже 2 + 2, 3 + I (14), другие поликарионы, имеющие большее число ядер, по мнению (14), нежизнеспособны, хотя, как показали недавние исследования (71),гибридные клетки образуются из поликарионов с большим числом ядер. И в том, и в другом случаях подтверждение обеих гипотез косвенные - поэтому вопрос о происхождении гибридных клеток можно считать открытым.

Инактивированная форма вируса HVJ стала универсальным индуктором слияния и в течение ряда лет широко использовалась для гибридизации соматических клеток (23,29,42,50,58,70,83, 89). Открытие Харриса также послужило толчком к поиску других индукторов слияния клеток. В настоящее время, благодаря этим поискам, известна целая группа вирусов, вызывающих образование гетерокарионов . Сюда можно отнести как ДНК - (14), так и РНК-содержащие вирусы (14).

Во избежание засорения посторонними нуклеиновыми кислотами при слиянии с помощью агглютинирующих вирусов был начат поиск веществ не биологического происхождения,способствующих слиянию клеток.Шло отмечено,что интенсивное слияние растительных протопластов при определенных значениях рН могут вызывать ионы кальция (66).

Было показано,что лизолецитин,образующийся в результате отщепления жирнокислотного радикала от фосфатидилхолина по эфирной связи фосфолипазой А,в низких концентрациях вызывает образование поликарионов (Ю5).Цитотоксический эффект может устраняться добавлением обезжиренных сывороточных белков.Исследования других липидных соединений позволили вы- - 12 -делить другие индукторы слияния,среди которых наиболее перспективным веществом является моноолеат глицерина (27).

При изучении веществ лектинового ряда было отмечено,что некотрые из них,в частности фитогемагглютинин (ФГА)усиливают интенсивность слияния клеток (III).

Слияние клеток может быть вызвано различными ферментными препаратами.Так,первые межвидовые гибридные клетки корова х норка были получены обработкой суспензии клеток холодным трипсином (123).Фосфолипаза С,воздействуя на мембранные липида,также вызывает агглютинацию и слияние клеток (114).

При совершенствовании методов микрохирургии стало возможным получение клеточных гибридов механическим путем (35). Результаты не зависят от рН,условия слияния строго контролируемы, однако применение этого метода требует наличия специального оборудования и определенных навыков исследователя, что не дает этому методу широкого распостранения.Другим недостатком указанного метода является то,что успешного слияния можно добитья только в стадии телофазы.Эти особенности ограничивают возможность получения большого количества гибридов.

В последнее время широкое распространение начинает получать полиэтиленгликоль (ПЭГ) (32,38,50,100,104,121,125). Простоту методических приемов и доступность материала можно отнести к его несомненным достоинствам.Механизм его действия пока неизвестен.Предполагается,что благодаря отрицательному заряду молекул полиэтиленгликоля в водном растворе двухвалентные ионы образуют мостики между ПЭГ и отрицательно заряженными углеводами,находящимися на поверхности клеточной мембраны,что способствует агглютинации клеток (66). - ІЗ -При последующем разведении ростовой средой суспензии клеток происходит их слияние.Способность ПЭГ выполнять роль индуктора слияния была установлена на растительных протопластах. В 1976 году Понтекорво показал,что ПЭГ способен индуцировать слияние животных клеток (104).

Дальнейшие исследования,где ПЭГ применялся в качестве индуктора гибридизации,показали,что слияние происходит при оптимальных значениях рН и мало зависит от температуры (32, 121).Сравнение индуцирующей способности ПЭГ к гибридизации по сравнению с вирусом Сендай установило,что первый не только не уступает,но в ряде случаев даже превосходит его (35, 125).Все это способствует успешной конкуренции ПЭГ с вирусом Сендай.

Что же происходит в клетке после слияния ? После агглютинации в месте контакта клеточная оболочка разрушается, и два ядра оказываются в одной цитоплазме.Судьба такой дву-ядерной клетки в дальнейшем может быть различной.Вероятно в одном случае они сливаются и образуют одно целое ядро (2,3), которое в дальнейшем может вступить в деление; в другом случае объединение ядерного хроматина происходит через деление. В обоих случаях клетка в конечном счете содержит одно ядро с объединенным генетическим материалом.Таким путем гомо- или гетерокарион превращается в синкарионную клетку (14).На этом этапе необходимо упомянуть о следующих двух феноменах:

I.Реактивация покоящегося ядра высокодифференцированных клеток при гибридизации.

2.Эффект преждевременной конденсации хромосом (ПКХ).

В нормальных условиях культивирования такие высокодиф-ференцированные клетки как эритроциты,лимфоциты,сперматозо- - 14 -иды,яйцеклетки и макрофаги не делятся.Синтез ДНК и РНК в таких клетках может отсутствовать полностью,либо частично редуцирован.При слиянии высокодифференцированных клеток с активно растущими перевиваемыми линиями происходит реактивация их покоящегося ядра.

Впервые подобное явление было отмечено Харрисом и др.(58) При радиоавтографическом исследовании синтеза ДНК и РНК в ядрах трех типов высокодифференцированных клеток были выявлены три закономерности: І.При синтезе РНК одной из родительских клеток такой синтез будет идти в обоих типах ядер гетерокариона.

2.Если в норме ни одна из родительских клеток ДНК не синтезирует, то в соответствующем гетерокарионе ДНК также не будет синтезироваться.

З.При синтезе ДНК,одной из родительских клеток подобный синтез будет идти в обоих типах ядер гетерокариона.

Из приведенных выше закономерностей можно сделать важный вывод,что репрессированный геном при гибридизации реактивируется и генетический материал обеих клеток в последующем ведет себя как единое целое.

Однако следует отметить,что при вступлении в митоз реактивированное ядро несколько запаздывает в развитии по сравнению со своим более активным партнером (58).В этом случае конденсация хромосом реактивированной клетки отстает от конденсации активного хроматина.Под микроскопом кариотип обеих клеток имеет различную степень спирализации хромосом (49).Это явление известно под названием преждевременной конденсации хромосом (ПКХ) (16).При слиянии перевиваемых линий клеток,находящихся на различных стадиях клеточного цикла, - 15 -также может наблюдаться явление ПКХ вследствие несинхронного вступления в митоз (Асинхронный митоз)(16).

Какова дальнейшая судьба клеток с ПКХ? Рэй и Джонсон показали, что лишь немногие гетерокарионы,образованные при слиянии с митотическими клетками,способны дать жизнеспособные гибриды (125).Однако до сих пор остается неясным,могут ли ПК-хромосомы,прошедшие первое деление,нормально реплицироваться в последующем(49).

На основе проведенного анализа литературы можно сделать следующее заключение: слияние клеток может быть инициировано не только вирусом Сендай,но и рядом химических соединений, из которых наиболее перспективным является полиэтиленгли-коль; при слиянии высокодифференцированных клеток с перевиваемыми линиями возможно образование жизнеспособных гибридных клеток.

1.3. СЕЛЕКТИВНЫЕ И П0ЛУСЕЛЕК1ИВНЫЕ МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК.

Первые гибридные клетки,открытые Барским (21),были обнаружены благодаря более активной пролиферации по сравнению с родительскими клетками.К сожалению,подобное явление имеет место крайне редко (16).Поэтому в первых работах по гибридизации отбор гибридных клеток проводили изоляцией единичных клеток,выбранных случайным образом (116).Такой способ изоляции требует больших затрат труда.

Применение селективных методов позволяет избежать указанные трудности.Основным условием при использовании селективных и полуселективных методов для изоляции гибридных клеток является предоставление возможности роста гибридным формам и создание неблагоприятных условий культивирования не слившимся родительским клеткам.Такое условие мэжет быть осуществлено за счет использования разных селективных маркеров у гибридизуемых клеток и последующего компенсаторного действия генома гибридной клетки.

В зависимости от типа селективных маркеров методы делятся на три условные группы:

Селективные методы с использованием линий клеток резистентных к биологически активным веществам (БАВ).

Селективные среды с использованием линий клеток,имеющих ауксотрофные мутации.

Селективные методы с использованием непермиссивных условий культивирования.

Если ростовая среда содержит какое-нибудь биологически активное вещество (БАВ),то в популяции клеток происходит отбор мутантных форм,обладающих резистентностью к этому вещее- - 17-тву.При гибридизации линий,имеющих резистентность к различным БАВ,образуются гибридные клетки, которые, благодаря комплементарное генов,могут выживать в селективных средах,содержащих группы веществ,подавляющих рост негибридных клеток. Такой подход к выделению гибридных клеток был впервые применен Литлфилдом (77).В настоящее время этот метод является классическим и служит для выделения гибридных клеток,родительские формы которых резистентны к 5-бромдезоксиуридину (5-БУДР) и 8-азагуанину.Такие клетки имели повреждения ти-мидинкиназного гена (тк~) и гена,кодирующего синтез фермента гуанингипоксантинфосфорибозилтрансферазы (ГГФРГ"") .Гибридные клетки имели гены тк⁺ и ГГФРТ⁺, следовательно,они могли, используя запасной путь синтеза нуклеотидов из их предшественников, выживать в среде, содержащей гипоксантин, амино-птефш и тимидин (среда ГАТ).Эта среда была разработана ранее Шибальскими (122), но использовалась для других целей. Гипоксантин и тимидин в этой среде использовались как предшественники пуриновых и пиримидиновых оснований.Роль амино-птерина сводилась к блокированию основного пути синтеза нуклеотидов de novo из аминокислот и Сахаров.

Последующие исследования показали возможность использования клеточных линий,устойчивых к другим БАВ.Баркер и его сотрудники использовали селективную среду с оубаином при гибридизации клеток устойчивых к последнему (20).Резистентность к оубаину определяется устойчивостью фермента Na"jK⁺-зависимой аденинтрифосфатазы.Подобные линии клеток,имеющие двойную мутацию - недостаточность по ГГФРТ или тк в сочетании с резистентностью к оубаину,позволяют использовать сре-ду ГАТ с оубаином в концентрации 10 - 10" М.В этой концен- - 18 -трации оубаин подавляет рост нормальных диплоидных линий клеток.

Фишер применил аналогичный метод в сочетании с устойчивостью клеточных линий к метиловому эфиру нистатина (МЭН)(45). Последний не вызывает перестроек кариотипа и наиболее эффективен в концентрации 200 мкг/мл. Такие данные были получены при гибридизации клеток ВНК 21/с13 х А-9 и ВНК 2I/cI3 х В-82.

Кузано и его сотрудники применили среду ГАТ при работе с клетками,дефицитными по аденинфосфорибозилтрансферазе (афрт~) (70).Такой тип клеток был получен при селекции в присутствии 2-фтораденина.Кен (24) использовал для гибридизации линию клеток дефицитных по дезоксицитидиндезаминазе (дцц~), и линию клеток дефицитную по дезоксицитидинкиназе (дцк~).Такие линии обладают резистентностью к цитозинарабинозиду и 5-бромдезоксицитидину. Для выделения гибридных клеток использовали среду ГАТ с заменой тимидина на 5-метилцитидин.

Все рассмотренные выше селективные системы отличаются тем,что путь биосинтеза пуриновых и пиримидиновых нуклеоти-дов блокируется аминоптерином.Последний представляет собой аналог фолиевой кислоты и блокирует синтез тетрагидрофо-латредуктазы.Клетки,обладающие повышенным уровнем синтеза этого фермента, а следовательно,устойчивые к метотрексату, были получены и успешно использовались при гибридизации (78).

Сравнительно недавно Кен и его сотрудники разработали принципиально новую среду для селекции гибридных клеток (25). Ее принцип основан на подавлении аланозином синтеза аденозин-монофосфата и неспособности клеток использовать экзогенный аденозин.Селективная среда содержит аланозин,аденозин и ури-дин (среда ААУ).Аденозин служит источником аденозинмонофос- - 19-фата, но в концентрации 2 х 10 М детален из-за недостатка пиримидиновых оснований. Присутствие уридина снимает токсический эффект. Для получения клеток с недостаточностью по аденозинкиназе использовали селекцию против 2-фтораденина.

Устойчивость клеток не обязательно может определяться повышенным или пониженным уровнем синтеза только одного фермента. Резистентность может быть обусловлена целым комплексом факторов. Так, Минор и Роски получили клетки, резистентные к колхицину (87). Подобная устойчивость вызвана нарушением проницаемости клеточной мембраны.

Селективные среды могут применяться и против выделенных гибридных клеток. Такой подход может применяться как добавочное доказательство при картировании маркерного признака и носит название "обратной селекции". При обратной селекции производится отбор тех гибридных клеток, в которых отсутствуют хромосомы, с одним или несколькими маркерными генами. На рис.1 показан общий принцип обратной селекции.

Впервые этим методом удалось картировать ген тимидин-киназы человека (126). В своем обзоре, Госс приводит таблицу, когда метод обратной селекции помог локализовать маркерный ген, против которого была направлена обратная селекция. (52).

Селективное выделение гибридных клеток,полученных при гибридизации клеточных линий,имеющих ауксотрофные мутации, связано с введением в среду питательных компонентов,синтез которых нарушен в клетках.Принцип выделения ауксотрофных мутантов заимствован из генетики микроорганизмов.Он основан на том,что в результате мутаций клетки приобретают способность к пролиферации в зависимости от наличия в среде определенных (М⁺,М~)

Гибридные М клетки с маркерными генами

Селективная среда, удерживающая опре деленный маркерный ген (М⁺)

Гибридные клетки с маркерным геном

Гибридные клерки, вторично утратившие маркерный ген М

Селективная среда, направленная на утрату маркерного re-Hat обратная селекция)

Свободная элиминация хромосом, образование клеток М;М",

Рис.1. Общий принцип обратной селекции.Символами М*,М~ на схеме обозначено проявление фенотипа маркерного гена.

Минимальная среда с нехваткой одной или нескольких аминокислот,+5БУДР

Рис.2. Принцип выделения ауксотрофных мутантов. - 21 -питательных веществ.Такие нарушения возникают в результате повреждения в клетке метаболических путей синтеза этих веществ Селективная среда для отбора гибридных клеток такого типа не содержит питательных веществ,синтез которых нарушен.

Пак и Као предложили оригинальный метод выделения аук-сотрофных мутантов клеток эукариотов (108).Общая схема его приводится на рис.2.

Клетки,обработанные мутагеном,помещались в питательную среду,не содержащую какой-нибудь аминокислоты.В такой среде клетки, у которых нарушен путь биосинтеза этой аминокислоты, теряют возможность к пролиферации и синтезу ДНК. Другие клетки,не имеющие такой мутации,продолжают расти и включают 5-БУДР из ростовой среды в свою ДНК.Такая модифицированная ДНК подвержена действию света больше,чем обычная. При ультрафиолетовой экспозиции ДНК,включившая 5-БУДР,подвергается фрагментации,что в конечном счете ведет к гибели клетки.Затем селективную среду заменяют обогащенной,и клетки,утилизируя экзогенную аминокислоту и не имея модифицированной ДНК,продолжают рост.Для более эффективного включения 5-БУДР в среду иногда вводят аминоптерин.

Большинство молодых гибридных клеток неспособны подавлять рост родительских форм при +37 С.Хотя как упоминалось ранее,первые гибридные клетки были обнаружены благодаря более быстрому росту по сравнению с родительскими формами(21). Эфрусси и его сотрудники обнаружили,что подобный эффект возможен для ряда гибридных клеток при температуре +29 С (42, 116).Возможность использования температуры как селективного фактора при гибридизации соматических клеток животных с различной температурой тела была показана Гольдштейном (51).Та- - 22 -ким путем он выделил гибридные клетки галапагосской черепахи и золотистого хомячка.Подобным методом воспользовался и Зепп в сочетании его с составом селективной среды при отдаленной гибридизации (130).

Как аналог вышеизложенных методов селекции был разработан метод получения температурочувствительных мутантов (т.ч) Он основан на том,что клетки,имеющие соответствующие мутации, в отличие от нормальных,не способны расти при непермиссивной температуре (38-39),но хорошо пролиферируют при 33-34 С (93,124).

Выделение температурочувствительных мутантных клеток аналогично выделению ауксотрофных мутантов.В настоящее время трудно объяснить биохимическую природу существования т.ч. мутантов.Скорее всего в клетках происходят конформационные перестройки РНК и белков,которые денатурируют или инактивируют-ся непермиссивной температурой (14).

Осмотический шок,как и температура,может выступать в качестве селективного фактора.Так,Далпра установил,что клетки, культивируемые в постепенно повышаемой концентрации гипертонической среды,становятся к ней более резистентными.Эта резистентность несовместима с выживаемостью неадаптированных клеток.После гибридизации в гипертонической среде будут погибать те родительские клетки,которые не адаптировались к умеренно гипертонической среде.В основе метода лежит постепенная адаптация фенотипа,наследующаяся гибридными клетками (30).Метод получил подтверждение в экспериментах по слиянию гистохимически различных клонов ЕОЕ .

Сочетание всех этих методов с применением в гибридизации перевиваемых мутантных линий с высокодифференцированны- - 23 -ми клетками (эритроциты птиц,лимфоциты,сперматозоиды,макрофаги, фибробласты) расширяет возможности применения гибридизации соматических клеток в картировании генов.В тех случаях, когда селективная среда не может вызвать гибель нормальных диплоидных клеток,а размножение их in vitro связано с особыми условиями культивирования,действие селективных агентов направлено только против перевиваемой линии родительских клеток.Такой подход к выделению гибридных клеток принято называть полуселективным методом.Например,неслившиеся диплоидные фибробласты зачастую удаляются из смешанной культуры при посеве клеток в низкой концентрации (31). Возможность слияния лимфоцитов с перевиваемыми линиями клеток была впервые использована Набхольцем (92).Неслившиеся лимфоциты не адге-зируются ко дну культуральных сосудов и удаляются при простой смене среды.

Джонсон и его коллеги показали возможность скрещивания перевиваемой линии НеЬа со сперматозоидами быка (49).При гибридизации макрофагов с линией мышиных фибробластов ш(тк⁼) с применением селективной среды ГАТ были получены также жизнеспособные гибриды (130).

Эритроциты цыпленка скрещивали с L-мышиными клетками линии А-9 (ГГФРТ") (118). Как ив предыдущем эксперименте для выделения гибридных клеток использовалась среда ГАТ.

Таким образом, при слиянии высокодифференцированных клеток с перевиваемыми линиями ядро первых реактивируется и вступает в деление. Харрис и его сотрудники показали, что всегда, когда клетки, синтезирующие оба типа нуклеиновых кислот, сливают с клетками не синтезирующими их вообще или только частично, активная в этом отношении клетка будет ини- - 24 -циировать синтез соответсвующей нуклеиновой кислоты у не активного партнера (58).Эта закономерность дает возможность широкого применения полуселективных сред для получения гибридных клеток перевиваемых линий с нормальными диплоидными клетками.

Из всего сказанного можно заключить следующее:

Гибридные клетки могут быть выделены путем культивирования смеси гибридизуемых клеток на соответствующей селек тивной среде.

Для получения панели гибридных клонов при картировании хромосом наиболее удобно использовать полуселективные системы сред.

1.4. ЭЛИМИНАЦИЯ ХРОМОСОМ В МЕЖВИДОВЫХ ГИБРИДНЫХ КЛЕТКАХ.

Картирование генов человека методом гибридизации соматических клеток впервые было осуществлено благодаря спонтанному выпадению хромосом из кариотипа гибридной клетки мышь х человек (126). Вейс и Грин выращивали на селективной среде гибридные клетки мышь х человек.Клетки мыши были дефектны по тимидинкиназному гену (тк~), клетки человека WI-38 имели ген тк⁺. В селективной среде могли расти как гибридные так и человеческие клетки. Однако последние хотя и устойчивы к действию селективной среды, но растут медленно; гибридные же клетки, содержащие ген тк⁺, унаследованный от клеток человека, росли быстро, образуя дискретные колонии.

При анализе кариотипов гибридных колоний было установлено, что все клетки сохранили почти полный кариотип мыши и только отдельные хромосомы человека.Детальный анализ установил, что во всех гибридных кариотипах присутствует 17 хромосома человека, тогда как присутствие остальных варьировало. Это позволило предположить, что ген, кодирующий синтез ти-мидинкиназы человека, локализован в 17 хромосоме.Гибридные клетки, теряющие эту хромосому при спонтанной элиминации,теряли способность к дальнейшему росту.

Явление элиминации хромосом в межвидовых гибридных клетках вскоре получило подтверждение и у других исследователей (88,92,ИЗ).Было установлено, что сегрегация хромосом у межвидовых гибридных клеток является скорее правилом,чем исключением.

Механизм этого явления до сих пор остается неизвестным. Однако данные литературных источников свидетельствуют о влиянии целого комплекса факторов.Выше было показано, как дав- - 26 -ление факторов селективной среды приводит к отбору гибридов, имеющих 17 хромосому человека (126).При скрещивании соматических клеток животных различных видов, была установлена зависимость направления сегрегации хромосом от их видовой принадлежности (14,16).

Кроме того была установлена зависимость сегрегации от типа клеток животных, участвующих в слиянии (127).Несколько позже в лаборатории Минн показали преимущественную сегрегацию хромосом в высокодифференцированных клетках при их слиянии с культуральными перевиваемыми линиями (86), хотя результаты полученные Кросс свидетельствуют о некоторых исключениях из этого правила (29). Эти факты в какой-то степени можно объяснить тем, что при скрещивании клеток с различным периодом деления, будут элиминироваться хромосомы клеток с более продолжительным циклом деления (64).

Машсуя и другие (83) показали отрицательную корреляцию между скоростью роста гибридных клеток и скоростью сегрегации. После гибридизации клетки начинают довольно быстро терять хромосомы одного из родительских геномов. По мере дальнейшего роста клеток скорость сегрегации уменьшается и ка-риотип стабилизируется.

Для стабилизации кариотипа требуется, чтобы гибридные клетки прошли определенное число генераций. Для каждого типа гибридизуемых клеток длительность этого периода может варьировать от двух недель до трех-четырех месяцев (67,86). В стабилизированном кариотипе гибридных клонов остаются дискретные группы хромосом. Имея достаточно большое число гибридных клонов с различными вариантами хромосомных групп, можно определить связь присутствия или отсутствия хромосомы - 27 -с синтезом белкового продукта или его прекращением.Этот подход к определению локализации генов впервые был предложен Бодмеромйего сотрудниками (89,92). Вскоре он был применен Раддлом (ИЗ). Так на основе феномена элиминации хромосом у гибридных клеток была доказана локализация некоторых генов на определенных хромосомах.

Широта применения метода гибридизации соматических клеток дает ключ к построению генетических карт различных животных (13,15,38). Для этой цели необходимо с определенной гарантией предсказывать направление элиминации хромосом. Основываясь на литературных данных,представленных в таблице I, можно сделать вывод некоторых закономерностей (14).

Данные представленные в таблице I,позволяют сделать вывод, что в большинстве случаев при гибридизации перевиваемых линий грызунов (мышь, китайский хомячок, сирийский хомячок) с диплоидными клетками филогенетически отдаленных видов будут элиминироваться хромосомы диплоидных клеток.

Наиболее удобный вариант скрещивания как в отношении применения селективных сред, так и в вероятном направлении элиминации хромосом был предложен сотрудниками Стэнфордского университета (92). При гибридизации клеток мыши и человека в качестве источника диплоидных клеток человека они использовали лимфоциты, так как они являются высокодифференциро-ванными клетками и не размножаются in vitro при обычных условиях культивирования. Позже были получены аналогичные данные, касающиеся всех высокодифференцированных клеток, имеющих ядра (86).

Возможно ли управление механизмом элиминации хромосом ? В какой-то степени здесь можно дать утвердительный ответ.

Таблица I Направление элиминации хромосом в различных межвидовых гибридных клетках. |Видовая принадлежность!Источ-элиминируемых хромосом! ник

Ш/П! Видовая принадлежность гибридизуемых клеток

Человек+мышь

Человек+китайский хомячок

Человек+сирийский хомячок

Обезьяна+мышь %л+мышь

Цыпленок+мышь

Кенгуровая крыса+китайский хомячок

Цыпленок+китайский хомячок

Свинья+мышь

Корова+китайский хомячок

Лисица-fкитайский хомячок

Норка+китайский хомячок

Лошадь+мышь

Овца+китайский хомячок

Кролик+китайский хомячок

Кошка+китайский хомячок - 29 -Первые попытки управлять направлением элиминации хромосом изменением условий культивирования закончились неудачей(16).Отчасти эту неудачу можно объяснить близкой видовой принадлежностью гибридизуемых клеток.

Успехом были увенчаны попытки Понтекорво повлиять на направление элиминации хромосом (103).Гибридные клетки ЗТЗ х W3/3 обычно обладают очень стабильным кариотипом.Перед слиянием ту или другую линию подвергали облучению рентгеновскими лучами.После слияния гибридные клетки теряли хромосомы, принадлежащие облученным клеткам.Другой его подход состоял в том,что перед слиянием родительские клетки выращивали в среде с 5-БУДР.Он включался в ДНК и после слияния гибридные клетки подвергали действию света.В сенсибилизированной ДНК,как и в первом опыте,возникали скрытые разрывы,что приводило к запрограммированной элиминации.Понтекорво отмечает возможность того, что при импульсном включении 5-БУДР в синхронизированных культурах будет происходить его избирательное включение в отдельные хромосомы в соответствии с временем их репликации(103). Недостатком этого метода является фрагментация хромосом.Засорение фрагментированными кусочками ДНК генетического материала гибридных клеток ведет к трудно идентифицируемым обломкам хромосом,что в конечном счете будет приводить к противоречивым результатам при картировании хромосом.

Основной вывод,который можно сделать на основании анализа материала,изложенного в этом разделе,следующий: при гибридизации соматических клеток отдаленных видов с перевиваемыми линиями клеток грызунов в большинстве случаев идет элиминация хромосом клеток отдаленных видов. - ЗО -

1.5. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ХРОМОСОМ В КАРИОТИПАХ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК.

Как уже упоминалось ранее,в кариотипе гибридной клетки содержится приблизительно суммарный набор хромосом родительских клеток.С течением времени, в результате элиминации хромосомный набор одной из слившихся клеток (реже обеих (117)) редуцируется (13,15,62,65,118).На этом этапе процесс элиминации замедляется и кариотип гибридных клеток стабилизируется (16).

В первых работах по гибридизации наличие гибридного карио-типа определялось присутствием в нем маркерных хромосом (21). Такие хромосомы должны были четко отличаться друг от друга и не иметь аналогов со скрещиваемой линией клеток (124).Окраска по стандартному методу с орсеином не выявляет характерных особенностей индивидуальных пар хромосом (14).Кариограммы ка-риотипов строили по величине и положению центромеры.Относительно положения центромеры метафазные хромосомы делятся на 4 типа: метацентрические,субметацентрические,субтелоцентри-ческие или акроцентрические и телоцентрические.

Индивидуальная идентификация хромосом кариотипа стала возможна только после развития цитологических методов сегментированного окрашивания хромосом.Группа методов,позволяющих получить сегментированную исчерченность,носит название методов дифференциального окрашивания.Впервые такую сегментированную исчерченность удалось получить при обработке хромосом красителями акридинового ряда.Отдельные участки хромосом после окрашивания производными акридина обладают различной степенью флюоресценции (19,22).Рисунок таких сегментов был строго индивидуален для каждой пары хромосом.Такая сегментация получила название Q-сегментов. - ЗІ -

Приблизительно в тоже время было найдено,что после обработки преператов метафазных пластинок в слабом растворе трипсина с последующей окраской в растворе красителя Гимзы,на хромосомах образуются сегментированные участки с различной плотностью окрашивания (47).Этот тип исчерченности был назван методом G-сегментов.Интересно отметить,что плотноокрашенные G-сегменты ( G⁺ ) примерно совпадают по локализации с флюоресцентными Q-сегментами.Вполне вероятно,что в механизме обоих явлений лежит неравномерность связывания комплекса ДНК-белок по всей длине хромосомы,что обеспечивает в свою очередь неравномерное связывание красителя (14).

Связывание различных красителей из их смеси в определенных условиях может зависеть от видовой принадлежности хромосом. Так, мышиные хромосомы при рН=І0 в растворе Гимза окрашиваются в красный цвет,а хромосомы человека в синий.Такое окрашивание существенно облегчает межвидовую дифференцировку хромосом и может использоваться для выявления транслоциро-ванных участков (47).

Появление нового цитологического метода потребовало разработки условий проведения эксперимента (стандартизация) и создания номенклатуры хромосомных перестроек.В 1971 году на Парижской конференции была принята номенклатура G-сегментов хромосом человека (98).Ниже приводятся общие принципы построения номенклатуры для описания кариотипов домашних животных и человека на примере кариотипа человека,поскольку эти же принципы были положены в основу создания номенклатуры для описания кариотипов домашних животных,принятой на I Международной конференции по стандартизации кариотипов домашних животных (106).

Согласно Денверовской номенклатуре,(98), нормальный кариотип обозначается 46,ХУ, кариотип женщины 46,XX.Введение добавочных знаков "+" и "-" перед порядковым номером хромосомы обозначает присутствие или отсутствие этой хромосомы в описываемом кариотипе.Например,обозначение 47,ХХ+17 - расшифровывается так: в кариотипе женщины присутствует добавочная 17 хромосома (17-трисомия).Длинное плечо хромосомы обозначают " q",короткое "р".Области хромосомных плеч нумеруются последовательно от центромеры к концам плеч.Границы между локализациями сегментов в областях проводятся по их середине и нумеруются в том же порядке,что и области.Делеции принято обозначать " del ",а транслоцированные участки - "t".Ha основе принятых обозначений можно описывать кариотипы,имеющие хромосомные перестройки.Обозначение 46,ХУ, t(4,6)(pI2;qI3) свидетельствует, что в кариотипе мужчины имеется транслоцированный участок из короткого плеча (I область,2 сегмент) 4 хромосомы в длинное плечо (I области,3 сегмент) 6 хромосомы.Делеция в 8 хромосоме (2 области I и 2 сегментов в длинном плече может быть записана так: " del (8)(q.2I2)".

Аналогичные обозначения введены и для описания кариоти-пов домашних животных (76).Так как хромосомы коровы,за исключением половых,представлены акроцентрическими и телоцен-трическими,обозначения плеч длинных и коротких относительно положения центромеры не вводятся и тем самым облегчается форма записи и ее чтение.Необходимо упомянуть,что до сих пор нет единого мнения относительно морфологии хромосом коровы (здесь речь идет о аутосомах).Так,Лин и его сотрудники полагают, что все аутосомы представлены телоцентрическими хромосомами (76).другие исследователи приводят идиограммы,где ауто- - 33 -сомы коровы представлены акроцентрическими хромосомами (5). Такое расхождение во мнениях вызвано,видимо,тем,что на различных этапах метафазы морфология хромосом изменяется от ак-роцентрических к телоцентрическим (5).При анализе кариотипов лимфоцитов,подлежащих слиянию в нашем эксперименте, в одних и тех же метафазных пластинках находились как акроцентричес-кие, так и телоцентрические хромосомы.

Диплоидное число хромосом у крупного рогатого скота равно 60.Впервые это показал Краллинер (69) и несколько позднее Макино (80).Этими исследователями было также показано,что 58 хромосом из этого числа являются аутосомами и представлены телоцентрическими хромосомами убывающей величины.Половые хромосомы X и У представлены метацентрическими хромосомами соответственно большего и меньшего размеров (56).Таким образом, из нормального диплоидного кариотипа крупного рогатого скота можно было идентифицировать,с определенной долей точности, первую пару (самая большая по размерам пара телоцентрических хромосом и 29 пару (наименьшая в кариотипе пара телоцентрических хромосом),а также X и У хромосомы по их форме (II).

Первую попытку идентификации отдельных хромосом коровы сделал Хенсен (61).Для окрашивания хромосом он использовал акридиновые красители,а выявление Q-сегментов проводилось флюоресцентной микроскопией.Из-за не совсем четкого распределения Q-сегментов этот метод не получил широкого распостра-нения.Последующие исследования показали большую перспективность метода получения G-сегментов для идентификации хромосом крупного рогатого скота (43,54,58).К одной из первых работ,посвященных вопросу идентификации хромосом у сельскохозяйственных животных, в нашей стране надо отнести работу - 34 -выполненную в лаборатории Яковлева (П).Продолжая дальнейшее цитогенетическое изучение кариотипа крупного рогатого скота Лин и его сотрудники предложили простой и хорошо воспроизводимый метод трипсин-Гимза (76).В этой же работе было приведено детальное описание кариотипа крупного рогатого скота с обозначением нумерации областей и сегментных полос,находящихся внутри областей.Однако в последующей своей работе,выдвинутой для стандартизации (106) стр.147 5 и 7 хромосомы были поменяны местами по отношению к первоначальной работе (76), хотя в качестве иллюстративного материала использовалась раскладка той же самой метафазы.С нашей точки зрения более удачным являлся первый вариант,поэтому для идентификации хромосом мы использовали номенклатуру и раскладку приведенную в первоначальном источнике (76).

Перевиваемые линии соматических клеток китайского хомячка и мыши в среднем содержат 20-22 и 50-55 хромосом соответственно. В кариотипе китайского хомячка число акроцентричес-ких хромосом колеблется от 3 до 5, тогда как в кариотипе мышиных клеток число акроцентрических и телоцентрических хромосом у различных линий колеблется от 34 до 39ЛІ6).

Учитывая все вышеизложенное можно сделать следующее заключение, что для идентификации хромосом крупного рогатого скота лучше использовать метод получения G-сегментов и в качестве перевиваемой линии при гибридизации предпочтение следует отдавать линиям китайского хомячка.

1.6. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПРОДУКТОВ ДЕЙСТВИЯ ГЕНОВ.

Любой белковый продукт,синтезированный в клетке на основе информации генов,может быть идентифицирован с помощью арсенала физико-химических методов разделения.Для анализа белковых продуктов гибридных клеток метод должен отвечать следующим требованиям:

I.Достаточная чувствительность к малым количествам белка при анализе клеточных экстрактов.

2.Простота и стабильность в воспроизведении результатов.

3.Возможность массового анализа при работе с большим количеством гибридных клонов.

Наиболее полно соответствует этим требованиям метод разделения белков при электрофорезе.В зависимости от типа носителя (среда,в которой происходит разделение) качество разделения для различных белков варьирует.К основным типам носителей при анализе экстрактов гибридных клеток относят поли-акриламид,крахмал и ацетат целлюлозы (8,15,34,37).Особую популярность получили первый и последний типы носителей. Поли-акриламидный гель по разрешающей способности несколько превосходит целлогель,но уступает ему в трудоемкости при воспроизведении (7).

Идентификацию полос,обладающих ферментативной активностью проводят с помощью специфического окрашивания.Поскольку в нашей работе ставилась задача идентификации дегидрогеназ (ЛДТ и ГбФД), стоит упомянуть о общем принципе положенном в основу определения большинства дегидрогеназ.При дегидратировании субстрата ферментом,кофермент переходит в восстановленную форму,после чего она окисляется до исходной,отдавая два Н⁺ производному соли тетразолия восстанавливая его до нерас- - 36 -творимого формазана.Активатором этой,последней реакции служит феназинметасульфат.Формазан-вещество темно-синего цвета,нерастворимое в воде,локализуется в месте присутствия фермента (7).

Для определения фенотипического проявления генов существуют иммунологический и иммунофоретический методы.Обладая высокой спецефичностью,реакция антиген - антитело отчетливо проявляется в виде преципитационных полос.Так методом иммунофо-реза удалось идентифицировать митохондриальную малатдегидро-геназу в экстракте гибридных клеток человек х мышь (52).Антисыворотку для таких целей получают,иммунизируя животных соответствующими очищенными ферментами.

Установление локализации гена на хромосоме достигается также при помощи специальных методов культивирования на селективных средах и применения методов обратной селекции.Классическим примером такого дитального определения фенотипического выражения генов является локализация гена контролирующего синтез фермента тимидинкиназы человека (126).

1.7. СТАТИСТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА ХРОМОСОМ В ГИБРИДНЫХ КЛЕТКАХ.

В гибридных клетках при прочих равных условиях культивирования элиминация хромосом происходит спонтанно (13,38,115). Даже в субклональных линиях гибридных клеток трудно найти две такие,которые имеют одинаковый набор хромосом,оставшихся после элиминации.Однако,если проанализировать состав нескольких клеток одного клона,то можно отметить,что одни хромосомы встречаются более часто,чем другие.Отсюда можно заключить,что какая-то группа хромосом является наиболее типичной для исследуемого клона.Таким образом,фенотипическое выражение какого-либо маркерного гена можно считать присущим этой группе хромосом; и наоборот - отсутствие маркерного белка позволяет сказать,что данный ген не локализован в этих хромоеомах.Такая постановка вопроса ставит две задачи перед кариологическим анализом:

I.Какой минимум клеток небходимо проанализировать,чтобы иметь представление о хромосомном составе,который будет характеризовать данный клон ?

2.В каком минимальном количестве клеток должна присутствовать хромосома,чтобы считать ее типичной для всего клона ?

Ответ на первый вопрос можно найти путем построения кривой гетерогенности хромосомного состава (17).В настоящей работе образец такой кривой приведен на стр.68 -На основе такого графика можно построить еще одну кривую,основанную на усредненных данных.Угол наклона этого графика свидетельствует о вариабельности хромосомного состава.Чем более разнороден состав хромосом гибридного клона,тем больший угол будет образовывать кривая с осью абсцисс,следовательно,тем большее - 38 -количество клеток необходимо проанализировать.У идеального клона,все клетки которого представлены одинаковым набором хромосом,кривая гетерогенности хромосомного состава представляет прямую линию (14).

Второй вопрос представляет отдельную проблему.Так,если среди 20 метафазных пластинок только в одной присутствует I копия 9 хромосомы,то нельзя утверждать,что эта хромосома типична для всего клона.Но это не дает ответа на вопрос,при каком минимальном количестве копий хромосом будет наблюдаться фенотипическое проявление гена,сцепленного с этой хромосомой.В различных литературных источниках эта величина колеблется от 3% до 50% (15,26).

Интересный подход в решении этой проблемы был предпринят Г^гбцовым и его соавторами (15). Однако, даже используя его необходимо также учитывать,что этот процесс определяется целым комплексом факторов.Для снижения роли этих факторов условия подготовки клеточных лизатов должны быть строго стандартизованы, хотя и в этом случае для каждого фермента необходимо определять пороговый уровень присутствия хромосом.

ЧАСТЬ 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ.

2.I.I.Биологический материал.

В работе использовали перевиваемую линию клеток фибро-бластов яичника китайского хомячка СН0-К1^ПР"\Указанная линия клеток была предоставлена О.В.Евграфовым,сотрудником Лаборатории цитогенетики Института общей генетики АН СССР.Данный клон имел нарушение в метаболическом пути синтеза аминокислоты пролина.Невозможность синтезировать самостоятельно эндогенный пролин,поставила жизнеспособность клона в зависимость от наличия в ростовой среде экзогенного пролина.Присутствие последнего обеспечивалось смесью сред 199 и Игла в соотношении 1:1.В модельном и параллельном экспериментах использовалась перевиваемая линия клеток мышиных фибробластов В-82 предоставленная О.С.Капицей сотрудником Лаборатории генной инженерии Института общей генетики АН СССР.Этот клон имел нарушенный синтез тимидинкиназы (тк~).

Клетки коровы,использованные в эксперименте,являлись-лимфоцитами ,выделенными из крови теленка и первичной культурой фибробластов легочной ткани эмбриона коровы.Этот материал был получен от животных черно-пестрой породы на Московском мясокомбинате № I.

2.1.2.Посуда.

Перевиваемые линии и первичные культуры клеток выращивали в флаконах Павицкого,изготовленных из йенского стекла немецкой фирмой Eaiso terra .Горло флаконов закрывали профлом-бированной алюминевой фольгой толщиной 0,14 мм.Благодаря неполной герметичности при таком закрытии обеспечивался кон- - 40 -такт с внешней средой.Это позволяло поддерживать культивирование клеток в атмосфере с Ъ% 00^

Клонирование и субклонирование клеток проводилось в чашке Петри.Они были изготовлены из пластика фирмой Flow Laboratories. Дальнейшее культивирование гибридных клеток проводилось в 100 мл флаконах Павицкого.Для роста гибридных клонов и первичных культур использовали флаконы,в которых ранее росли перевиваемые линии (9).Такая предварительная обработка новой посуды способствует лучшему росту гибридных клеток.После использования посуду для культивирования ополаскивали горячей водой,для удаления остатков содержимого и внутреннюю часть обрабатывали концентрированной хромовой смесью на протяжении 3-4 часов.Затем стеклянная посуда споласкивалась 2.-3 раза водой и обрабатывалась І н HCI для удаления остатков хромовой смеси.Дальше посуду подвергали 15-кратному ополаскиванию теплой водопроводной водой,10-кратному - дистиллированной и 5-кратному бидистиллированной.Чистую посуду высушивали,закрывали алюминевой фольгой,стерилизовали сухим жаром при 180С 2-3 часа.

Особое внимание надо обращать на режим мойки посуды потому, что, как показал опыт,при использовании в качестве моющего средства детергентов,гибридные клетки растут хуже,хотя родительские перевиваемые линии почти на это не реагируют.

2.1.3.Среды и реактивы.

Для культивирования клеток в качестве ростовой среды использовали среды 199 и Игла отечественного производства (Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР).Для промывочных операций использовался раствор Хэнкса,изготовляемый - 41 -тем же институтом.Снятие клеточного монослоя и трипсиниза-цию тканей для первичных культур проводили готовым 0,25% раствором забуференного трипсина (рН=7,5)(коммерческий препарат отечественного производства).Во всех экспериментах использовали эмбриональную сыворотку коров,производимую в Лаборатории биохимии вирусов Института микробиологии и эпидемиологии им.Н.Ф.Гамалеи.По ряду предварительных тестов (эффективность клонирования и токсичность) некоторые партии ее превосходят аналогичную сыворотку,производимую фирмами капиталистических стран.

Растворы полиэтиленгликоля для инициации гибридизации готовили смешиванием стерильной среды Игла с автоклавирован-ной навеской полиэтиленгликоля.Для получения G-сегментов на препаратах хромосом применяли трипсин "Дифко"(1:250).Стимуляция ростовых свойств лимфоцитов проводилась добавлением фитогемагглютинина (ФГА) типа М,производимый фирмой Gibco.

Реактивы для проведения электрофореза использовались из набора фирмы "Реанал" с предварительной их очисткой (7).

2.1.4.Приборы и оборудование.

Источники питания для проведения электрофореза - Б5-49 со стабилизацией по току.Стерильность при пересеве и подобного рода работ с клетками достигалась проведением работ в боксе с ламинарным потоком стерильного воздуха (фирма ВАВСО). Инкубация клеток проходила в термостате с принудительной циркуляцией воздуха и автоматической подачей СОр; тип прибора C0-2I,изготовлен фирмой ЯВО Bacharach. .Фотографии препаратов проводили на микроскопе фирмы Reichert.

2.2. МЕТОДИКИ ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ.

2.2.1.Получение первичных культур клеток.

Эмбрионы коров оперировали под ламинаром с соблюдением условий стерильности.Отпрепарированную ткань легкого эмбриона коровы помещали в раствор Хэнкса со следующим содержанием антибиотиков: пенициллин - 600 ед/мл,стрептомицин - 600 мкг/мл В этом растворе ткань отмывали от крови двойной сменой Хэнкса с антибиотиками.Отмытую ткань нарезали мелкими кусочками в свежей порции этого раствора и промывали 3-4 раза для удаления клеток крови и обрывков соединительной ткани. Измельченную ткань трипсинизировали в 0,25% растворе трипсина 30-40 минут при комнатной температуре.Суспензию клеток отбрасывали,а оставшиеся кусочки трипсинизировали 2-3 раза по I часу.Эмбриональная ткань в отличие от тканей взрослого животного легче подвергается трипсинизации.Достаточное количество клеток можно набрать и при однократной трипсинизации. В 20-25 мл среды 199 с 20% содержанием сыворотки эмбриона коров добавляли 1-2 мл суспензии трипсинизированных клеток .Содержание антибиотиков в такой ростовой среде составляло 300 ед/мл пенициллина и 300 мкг/мл стрептомицина.Культивирование осуществлялось в 100 мл флаконах Павицкого.

На следующий день ростовую среду заменяли на свежую с меньшей концентрацией антибиотиков (пенициллин - 200 ед/мл, стрептомицин - 200 мкг/мл).При смене среды удалялись неад-гезированные к стеклу клетки и кусочки ткани.

Если ткань брали нестерильно,тогда применяли другой способ обработки.Нестерильную ткань помещали в 70% раствор этанола на 1-2 минуты.Остатки спирта на ткани удаляли 5-кратной последовательной отмывкой в растворе Хэнкса с высоким содер- - 43 -жанием антибиотиков пенициллин - 1000 ед/мл,стрептомицин -1000 мкг/мл.После отмывки денатурированную ткань обрезали стерильными ножницами и разрезали на мелкие кусочки.Дальнейшая последовательность операций такая же как описано в предыдущей методике.

В случае взятия ткани от взрослых животных после трип-синизации выдерживали посевную концентрацию 5 х 10 клеток на 100 мл матрас.При более низкой концентрации клеток резко снижается адгезивная способность фибробластов легкого коровы.

Полученные такими методами первичные культуры проходили 4-6 пассажей.

2.2.2.Выделение лимфоцитов.

Вследствие низкой скорости реакции оседания эритроцитов (РОЭ) у коровы,выделение лимфоцитов требует специальных приемов .Кровь у телят собирали в стерильные флаконы с помощью донорских комплектов ВК-І0-0І однократного использования. В В качестве антикоагулянта использовали натриевую соль гепарина (конечная концентрация - 10 ед/мл; I мг=130 ед).

Первоначально лимфоциты выделяли частичным лизисом цельной крови в 0,1% растворе тритона Х-100.Раствор тритона готовили на растворе Хэнкса.Этот метод несмотря на его простоту, оказался малоперспективным,т.к.после двухкратного воздействия остается мало жизнеспособных лимфоцитов,ориентировочно 25-30%%.

Наиболее подходящим вариантом выделения лимфоцитов оказался метод очистки лимфоцитов в верографин-фиколловом градиенте (75,99).Для этого готовили 10% раствор верографина и - 44 -доводили его плотность 6% раствором фиколла (Picoll 400 ) d=I,076 г/мл.Стерилизовали такой раствор фильтрацией через фильтр GS фирмы Millipore с диаметром пор 0,22 мкм.

В стерильную пробирку под ламинаром вносили 3 мл этого раствора и сверху осторожно наслаивали 2 мл гепаринизирован-ной крови.Пробирку закрывали алюминевой фольгой и центрифугировали 30 минут при 1000 об/мин (радус ротора 22 см).После прохождения смеси клеток крови через градиент плотности в пробирке образовываются 4 зоны: от дна кверху - слой эритроцитов; прозрачный верографин-фиколловый раствор; тонкий слой суспензии лимфоцитов; плазма крови.Слой лимфоцитов осторожно удалялся стерильной пастеровской пипеткой и его суспендировали в 10 мл раствора Хэнкса с содержанием антибиотиков 500 ед/мл пенициллина и 500 мкг/мл стрептомицина.Суспензию лимфоцитов трехкратно отмывали в этом растворе.

Дальнейшая судьба лимфоцитов зависела от цели эксперимента. Для культивирования с целью получения метафазных пластинок, их помещали в 199 среду с 15% эмбриональной сывороткой и добавкой фитогемагглютинина.

2.2.3.Культивирование клеток.

Культивирование клеток первичной культуры проходило в 199 среде с 15% эмбриональной сыворотки; антибиотики - пенициллин - 200 ед/мл,стрептомицин - 200 мкг/мл.Перевиваемая линия В-82 росла на среде Игла с 10% добавкой эмбриональной сыворотки,а СН0-К1^пР"на смешанной среде 45% 199 и 45% Игла с 10% сыворотки.Во избежание микробной контаминации к ростовым средам добавляли антибиотики: пенициллин - 100 ед/мл,стрептомицин - 100 мкг/мл.

При заражении культивируемых линий микрофлорой использовались следующие метода спасения клеток: 3-х кратная промывка клеточного монослоя высокими дозами антибиотиков пенициллина - 600 ед/мл,стрептомицин - 600 мкг/мл.В случае поражения дрожжевой микрофлорой,эти меры не были эффективны. Если в культуру попадали грибки,то довольно хорошие результаты давал следующий метод:

В ростовую среду вводили тимидин в конечной концентрации 200 мкг/мл; через 2-3 часа добавляли аминоптерин и 5-БУДР в конечных концентрациях 0,2 мкг/мл и 50 мкг/мл,соответственно. Инкубация продолжалась 15-17 часов.Затем клетки отмывали раствором Хэнкса,заменяли среду на нормальную и экспонировали на свету 4-5 часов.Через 1-2 дня грибки,адге-зированные на стенках культурального сосуда отваливались и удалялись при последующей смене среды.Эта мера обычно применялась, если культуральный матрас был единственный и обработка микостатином не давала эффекта.

Клонирование гибридных клеток проводили по общепринятому методу (9).Спустя 2-3 недели после слияния на селективной среде образуются колонии гибридных клеток.Изоляция колоний проводилась следующим образом.Из чашек Петри удаляли среду и ополаскивали их раствором Хэнкса.Выбранную колонию окружали цилиндриком из стекла высотой 5-7 мм пришлифованный край которого был смазан силиконом.В цилиндрик вносили 0,3-0,4 мл трипсина и оставляли на 10-15 минут.С помощью пастеровской пипетки клетки суспендировали внутри цилиндрика в указанном объеме трипсина и суспензию клеток вносили в пластиковую чашку диаметром 35 мм с 2 мл нормальной ростовой среда.Через 15-20 дней образовавшийся в чашке моно- - 46 -слой снимали трипсином и переносили в 100 мл матрас с нормальной ростовой средой.

Исходные линии пересевали 1:5 один раз в неделю и два раза меняли среду.Гибридные клетки имели более длинный репродуктивный период,поэтому смена среды осуществлялась через 2-3 дня и І раз в 10 дней делали пересев.

Для получения метафазных пластинок использовали колхицин в конечной концентрации 0,4 мкг/мл.Через 3-4 часа среду удаляли,клетки снимали трипсином,отмывали,гипотонизирова-ли в 0,075 М KCI при +37С и фиксировали двойной сменой фиксатора метанол - уксусная кислота в соотношении 3:1.Более детальное описание этого метода приведено в прописи (90).

Получение метафазных пластинок из культуры лимфоцитов проводили аналогичным путем с предварительной инкубацией в среде с присутствием ФГА тип М.Для этого 2 мл стерильной ге-паринизированной крови добавляли к 8 мл 199 среды с 0,3 мл стандартного раствора ФГА.Такую микрокультуру инкубировали при +37С на протяжении 72 часов.Дальнейшая обработка проводилась по методу (76).

Инкубация клеток,как перевиваемых линий так и гибридных клеток проходила в атмосфере 99% влажности и 5% С0 с принудительной циркуляцией воздушной смеси при +37С.

2.2.4.Слияние клеток.

В основу рассматриваемых ниже методов положена оригинальная пропись Дэвидсона (32).Учитывая замечания при поиске оптимальных условий слияния (100), было апробировано 3 следующих метода:

I.Слияние в монослое.

2.Слияние монослой + суспензия.

3.Слияние в суспензии.

Для слияния клеток В-82 + корова применяли раствор поли-этиленгликоля (MB 3000) в концентрации 33%, поскольку, как показано в работе (100), линия В-82 чувствительна к цитоток-сическому действию ПЭГ-3000. При гибридизации клеток СН0-КІ + корова был использован ПЭГ в концентрации 50%.

Для слияния в монослое 2 х 19 клеток фибробластов лег-кого эмбриона коровы смешивали с 2 х 10 клеток перевиваемой линии СН0-КІ или В-82. Площадь посева в 100 мл матрасе сос- р тавляла 28 см . Ростовая среда добавлялась в количестве 10 мл на флакон. Совместное культивирование продолжалось на протяжении одной генерации от 12 до 24 часов. Монослой отмывали от следов сыворотки раствором Хэнкса 2-3 раза. Остатки жидкости удаляли. На угол ребра матраса добавляли 4 мл раствора ПЭГ соответствующей концентрации в зависимости от типа сливаемых клеток. Потом флакон поворачивали в нормальное положение, давая возможность слою ПЭГ-ля полностью покрыть монослой клеток. С этого момента начинался отсчет времени. , Окончанием инкубации кяеток в присутствии ПЭГ считалось время разбавления средой раствора ПЭГ. Разбавленный таким образом ПЭГ удалялся. Затем клетки 3-х кратно отмывали раствором Хэнкса или средой Игла без сыворотки. По окончании заменяли промывочный раствор на ростовую среду 199 с 20 % сыворотки и инкубировали в термостате при 37^й С. Через час среду заменяли на свежую и продолжали инкубировать 48-72 часа. После клетки снимали со стекла трипсином и засевали в концентрации 2 х 10 кл/мл на селективную среду.

При слиянии клеток в варианте монослой + суспензия. - 48 -Клетки перевиваемых линий засевали в 100 мл флакон в количестве 2 х 10 на матрас. Через 12-24 часа их отмывали от сыворотки раствором Хэнкса и добавляли 5 х 10 лимфоцитов, выделенных в верографин-фиколловом градиенте, отмытых и суспендированных в 10 мл 199 среды. В таком состоянии их оставляли на ночь в термостате при +37 С. За это время лимфоциты седиментировали на дно и очень слабо адгезировались к стеклу. На следующий день 199 среда осторожно удалялась и в матрас добавляли соответствующий раствор ПЭГ. Остальные операции проводились как описано выше.

Слияние клеток в суспензии проводилось следующим Обра ні с. зом: 10 клеток перевиваемой линии и 5 х 10 лимфоцитов коровы, выделенных по методу (75) смешивали, центрифугировали при 800є в течение 10 минут и добавляли I мл раствора ПЭГ требуемой концентрации. Клетки суспендировали в этом объеме и выдерживали от І до 3 минут. Затем, по окончании периода инкубации, клетки суспендировали в 9 мл среды Игла и центрифугировали;, при 1000 є 10 минут. Такую отмывку от следов ПЭГ повторяли еще два раза. После этого клетки засевали в 100 мл флакон в 10 мл 199 среды с 20 % сыворотки и инкубировали в течение ночи при +37 С. Утром среду заменяли на свежую. При этой операции параллельно удалялись неслившиеся и погибшие клетки, а также лимфоциты.

В ростовой среде клетки инкубировали в течение 48-72 часов, после чего снимали трипсином и засевали 2 х 10 клеток на 100 мл матрас с соответствующей селективной средой.

2.2.5. Окрашивание и анализ гибридных кариотипов.

Препараты хромосом приготовляли по методу предложенному (90). Для получения G-исчерченности хромосом препа- - 49 -раты обрабатывали по методу Лин и его сотрудников. В отдельных случаях, где не требовалась индивидуальная идентификация хромосом, препараты окрашивали в 0,067 М фосфатном буфере, рН=6,8. Необходимо отметить, что четкость проявления G-cer-ментов зависит от качества трипсина.

Рабочий раствор трипсина готовили смешиванием I мл 5 % раствора трипсина на бидистиллированной воде с 20 мл 0,005 М фосфатного буфера и 20 мл 0,02 % версена. Раствор доводили до рН=8,0 добавлением 5 % I^COg. Время обработки препаратов в этом растворе варьировало от 60 до 120 секунд. Затем препараты проводили через серию спиртов возрастающей концентрации и окрашивали в растворе Гимза на 0,067 М фосфатном буфере, рН=6,8. Время окрашивания от 3 до 5 минут. Важно отметить, что красящий раствор должен быть свежим.

От каждого гибридного клона исследовали 20 метафазных пластинок. Съемка метафазных пластинок проводилась под микроскопом фирмы Reichert при увеличении от 600^х до 1000^х. на пленку"Микрат-200". Фотографии печатали на контрастной фотобумаге "Унибром". Для проявления пленки и бумаги использовали проявитель № I.

Фотографии индивидуальных хромосом коровы вырезали и сравнивали со схемой, предложенной Лин (76). Количество копий хромосом регистрировалось на специальной карточке. Такая форма заполнялась на каждый клон. За образец была взята аналогичная карточка из обзора Рингерца (14). Сумма копий хромосом в 20 метафазах .каждого клона приводится в таблице 4. 2.2.6.Электрофоретический анализ гибридных клонов. Для анализа фенотипического проявления генов был использован электрофорез на 7% полиакриламидном геле.Электрофоре- - 50 -тическому разделению подвергали клеточный экстракат.Дня его приготовления 2 х 10 клеток суспендировали В 0,25 мл лизиру-ющего буфера.Состав его следующий: 0,005 М фосфатный буфер рН=7,0,20 мг НАДФ (натриевая соль) и 5 мкл 2-меркаптоэтанола на I литр фосфатного буфера.Клетки разрушали ультразвуком (частота источника 22 кГц), 5-кратным воздействием продолжительностью 60 секунд с интервалом в I минуту.Разрушенные клетки центрифугировали при 4000 об/мин 60 минут и к удаленному супернатанту добавляли 0,25 мл 40% сахарозы.

Хорошее разделение ферментов ЛДТ и Г6ФД было достигнуто при использовании прерывистой системы буферов (7).В нашем эксперименте была применена система № I по (7).Гелевый буфер трис-HCI, рН=8,З.В качестве электродного буфера использовали трис-глициновый буфер рН=7,5.Образцы наносили по 20 мкл в каждый карман геля.Плотность тока 15 ма/см .Длительность разгонки 2-3 часа.Окрашивание проводили в инкубационной смеси, приготовленной по прописи,которая приведена в обзоре Ко-рочкиным (8).

Состав инкубационной смеси для выявления ЛДТ (8): Лактат натрия 5 мл

0,1 М фосфатный буфер (рН 7,0) 100 мл Никотинамидадениндинуклеотид (НАД) 30 мг Нитросиний тетразолий (НСТ) 30 мг

Феназинметосульфат (ФМС) 2 мг

Состав инкубационной смеси для выявления Г6ФД (8): Фосфатный буфер 0,1 М (рН 7,0) 100 мл Никотинамидадениндинуклеотидфосфат(НАДФ)20 мг Глюкозо-6-фосфат,натриевая соль 200 мг Феназинметосульфат 2 мг - 51 - Нитросиний тетразолий (НСТ) 20 мг

При приготовлении инкубационных смесей особое внимание следует обратить на последовательность внесения ингредиентов смеси.Время развития окраски I час при +38С.Зоны локализации окрашиваются в темно-синий цвет.

2.2.7.Статистический анализ гибридных клонов.

Для определения локализации генов в хромосомах небходи-мо дать математическое обоснование.Это обоснование может иметь вид различных критериев,изменяющих свои величины в зависимости от того с какой хромосомой сцеплен ген,кодирующий синтез какого-либо фермента.Такие критерии были пред-ложены Кавмидовым (26); это Л , vp , ОР-статистика.

Метод определения vp был предложен Пирсоном в 1900 году как критерий для определения совпадения или расхождения экспериментального распределения с теоретическим (б).

При характеристике любого клона по двум показателям -наличию фермента и хромосомы - возможны 4 следующих комбинации: хромосома есть/фермент есть (+/+)>хромосомы нет/фермент есть (-/+).хромосома есть/фермента нет (+/-),хромосомы нет/фермента нет (-/-).Для каждой хромосомы и одного фер мента общее количество клонов может быть разнесено по этим группам.Числовые значения в этой таблице служат основой для вычисления л и vp .В данном случае за основу нулевой гипотезы принимается предположение,что с данной хромосомой ген,кодирующий фермент не сцеплен и распределение клонов по четырем графам таблицы чисто случайное.При возрастании Л случайность будет переходить в закономерность.В этом случае пороговая величина будет определяться требуемой величиной - 52 -достоверности Р и определяться табличными значениями ^ .Считают по следующей формуле:

Уп(У-Р')² ' L-ь рг где,р-экспериментальная вероятность присутствия хромосомы, р -теоретическая вероятность.При совпадении этих вероятностей У равен нулю.Однако на практике с такой ситуацией встречаются крайне редко,поэтому величина У укажет на несоответствие теоретической вероятности с экспериментально получен-ным распределением.В этом случае величину У сравнивают с табличными значениями при заданной достоверности Р.Если по- лученная величина меньше табличного значения л ,это укажет, что распределение носит чисто случайный характер и подтвердит нулевую гипотезу для данной хромосомы.И наоборот,при пре-вышении полученного значенияа по отношению к его табличному значению нулевая гипотеза будет отвергнута, т.е. данное распределение носит характер закономерности.Для хромосомы,у которой распределение носит характер закономерности,будет верна гипотеза обратная нулевой: "в хромосоме есть участок ДНК, кодирующий синтез маркерного гена".

Другой коэффициент ір может быть выражен как f^г ,где f ²-пирсоновский коэффициент контингенции.Он вычисляется по следующей формуле (6): _р2 L-i. Г* In где,р - распределение клонов в клетках корреляционной таблицы, Р_х и Р - суммы частот по строкам и столбцам таблицы. Критерий ^ может изменяться от 0 до I.Вычисление этого па-раметра связано с величиной У .Их взаимозависимость опреде-ляется формулой J = f п где II - число анализируемых гибридных клонов.

Метод ОР-статистики принципиально отличен от вышеописанных методов (26) и заключается в следующем.Если клон проявляет активность маркерного фермента,то подсчитывается число различных хромосом,независимо от количества их копий в клоне. Каждому исследуемому клону присваивается значение 100.Это число делится на количество различных хромосом.Каждой хромосоме этого клона присваивается частное от деления 100 на количество присутствующих хромосом.С другой стороны,если активность фермента в клоне отсутствует,считают количество отсутствующих хромосом и делят значение 100 на это число.Частное от деления присваивают отсутствующим хромосомам.Такие значения для каждой хромосомы суммируются по всем клонам, и сумма делится на количество клонов.Маркерный фермент будет локализован в хромосоме,имеющей наибольшую величину по критерию ОР-статистики.

У каждого из этих критериев есть свои достоинства и недостатки. Так, напрмер, эффективность использования метода ОР-статистики зависит от количества хромосом в анализируемых клонах.При очень большом числе хромосом величины ОР-статистики становятся довольно близкими и максимальные величины не очень четко выражены.На величину-а влияет количество анализируемых клонов,тогда как величина f изменяется от 0 до I и не реагирует на количество анализируемых клонов.Поэтому для определения локализации хромосом небходимо вычисление всех трех критериев.И только в том случае можно сказать,что ген кодирующий данный фермент,локализован в данной хромосоме, если все эти три критерия для этой хромосомы будут иметь максимальные значения (26).

ЧАСТЬ 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. КАРИОТИПЫ родатЕльских КЛЕТОК.

Впервые детальное описание кариотипа крупного рогатого скота было выполнено Лином (76).На фотографии I (Фото I) приведена метафазная пластинка хромосом крупного рогатого скота с G-исчерченностью хромосом.На фотографии 2 (Фото 2) приведена кариограмма хромосом крупного рогатого скота.На ка-риограмме приведено схематическое определение G-сегментов и паралельно приведена фотография этой хромосомы.Эти фотографии получены с препаратов культуры лимфоцитов сделанных в нашей лаборатории.В дальнейшем в настоящей работе порядковые номера хромосом будут упоминаться согласно приведенной схеме (Фото 2).

З.І.І.Характеристика кариотипа крупного рогатого скота.

Хромосома I.Самая большая по размерам пара телоцентричес-ких хромосом.Отличительной особенностью хромосомы І в расположении G-сегментов является присутствие слабо окрашенной зоны,локализованной на ее середине.Эта зона делит хромосому на два участка.Проксимальный участок,расположенный ближе к центромере,имеет 4 темных хорошо окрашенных полос.Дис-тальный конец,расположенный дальше от центромеры,также имеет 4 темноокрашенных участка.

Хромосома 2.Как и хромосома I, делится светлым участком посредине.Проксимальный и дистальный участки разделенные светлым участком имеют по 3 полосы окрашенных в темный цвет.

Хромосома 3.Светлая зона делит хромосому на проксимальном к центромере участке на 2 части.Проксимальный имеет I полосу,дистальный - 4. _{Ь ^}

Фото І.Метафазная пластинка крупного рогатого скота.

Хромосома 4.Имеет 7 темных, хорошо прокрашиваемых участка, которые относительно равномерно распределены вдоль всей хромосомы.

Хромосома 5.Обычно эта хромосома имеет 5 полос,3 из которых представлены более плотно окрашенными участками.

Хромосома 6.Проксимальный участок имеет 3 четко окрашенных полосы.Дистальный участок окрашен слабо.

Хромосома 7.Содержит 3 больших хорошо окрашенных участка. Проксимальный участок представлен одним широким сегментом. Дистальный участок состоит из 2 плотно окрашенных сегмента, расположенных близко друг от друга.Средний участок состоит из 3,близко расположенных сегментов. я о в

Я 05 Я о ТІ о го „^ -Ч

С* ^ *о ⁰¹ * * «-I^і

Хромосома 8.Проксимальный и средний участки хорошо окрашены. Терминальный участок имеет две слабо окрашенные полосы сегментов.

Хромосома 9.Включает в себя 4 равномерно распределенных участка,два средних из которых имеют парные близко расположенные полосы сегментов.В отдельных случаях из-за сильной спирализации они не идентифицируются как раздельные и средний участок представлен двумя широкими полосами сегментов.

Хромосома 10.По всей длине имеет плотное окрашивание, средний участок окрашен слабо и делит хромосому на две зоны по удаленности от центромеры: на проксимальную и дистальную.

Хромосома II.Имеет 4 возрастающие по ширине темных сегмента.В отличие от хромосомы 9,дистальный участок окрашен слабо.

Хромосома 12.В средней части плеч находятся две четкие полосы сегментов.На проксимальном участке - одна темная полоса.Дистальный участок окрашен слабо.

Хромосома 13.Проксимальная зона имеет две темные полосы сегментов,терминальный участок окрашен слабо.

Хромосома 14.В отличие от остальных хромосом,в проксимальной зоне отсутствует темный сегмент.В средней зоне присутствуют две близко расположенные полосы сегментов.

Хромосома 15.В проксимальной части хромосомы преобладает один широкий сегмент,в дествительности это две полосы сегментов, часто сливающихся в одну.

Хромосома 16.Имеет два отчетливых темных сегмента в проксимальном и дистальном участках,которые являются наиболее характерными для этой пары хромосом.

Хромосома 17.В отличие от близкой по размерам 16 пары, - 58 -эту пару хромосом отличает темная полоса на проксимальном участке.

Хромосома 18.Единственная хромосома из этой группы,которая имеет один темный участок в средней части.

Хромосома 19.Проксимальная и средняя зоны имеют по одному окрашенному в темный цвет сегменту.Дистальный участок окрашен слабо.

Хромосома 20.Единственная пара хромосом в нормальном кариотипе,имеющая одну темную полосу.

Хромосома 21.Имеет два широких темных сегмента расположенных полярно,относительно друг друга.

Хромосома 22.Средний и дистальный районы имеют по одной полосе сегментов,которые при высокой степени спирализации могут сливаться в одну широкую зону.При более слабой степени спирализации ее можно ошибочно идентифицировать как 21. В этом случае отличие идет по размерам.

Хромосома 23.Включает три темные полосы сегментов.При нормальной степени спирализации дистальная пара сегментов сливается в одну;от 21 хромосомы отличается более плотной окраской.

Хромосома 24.Имеет хорошо различимые 3 темные полосы сегментов, равномерно распределенных по всему плечу хромосомы.

Хромосомы 25 и 27.В проксимальной зоне расположены две прижатые друг к другу полосы.Дистальные участки хромосом окрашены слабо.Между собой отличаются размерами.

Хромосома 26.Имеет два характерных темноокрашенных сегмента .Идентифицируется легко.

Хромосома 28.Типичная особенность - одна темная полоса. Проксимальный и дистальный участки окрашены слабо.

Хромосома 29.Наименьшая хромосома в кариотипе крупного рогатого скота.Имеет одну темную полосу сегментов.

Хромосомы X и У.Представлены субметацентрическими хромосомами большего и меньшего размеров соответственно.На карио-грамме (Фото 2) У-хромосома не приведена.

3.1.2. Характеристика кариотипа перевиваемой линии клеток СН0-К1^ПР~.

Распределение G-сегментов на хромосомах китайского хомячка ( Cricetulus griseus ) впервые было сделано Като (131). Позже,Раджабли и Крюкова (12) сравнили два нормальных кариотипа китайского и даурского хомячков на предмет распределения G-сегментов на хромосомах и сделали некоторые уточнения. Однако надо отметить,что кариотипы диплоидных нормальных клеток отличаются от кариотипа перевиваемых линий(12,33). ^v Первую попытку сопоставить кариотип нормальной линии с клеток СНО с диплоидным кариотипом самки китайского хомячка сделал Дейвин (33).В своей работе он показал,что часть хромосом в перевиваемой линии СНО аналогична гаплоидной части нормального кариотипа самки китайского хомячка,другая гаплоидная часть диплоидного набора в результате перестроек сильно изменилась.Это явление о сильном изменении части кариотипа китайского хомячка (линии СНО) отмечалось и ранее авторами этой линии (64),однако в связи с отсутствием в то время метода получения G-сегментов они не могли определить источники возникших перестроек.Это было сделано Дейвином (33), а позже нашло подтверждение в работе Вортона (128).В частности было выдвинуто предположение о том,что в клетках перевиваемых линий СНО функционирует только лишь гаплоидная - 60 -часть генома (33,128).Не так давно,Сицилиано и его коллеги картируя гены китайского хомячка (119) нашли дополнительные подтверждения этой гипотезы.

Имеющаяся в нашей лаборатории линия клеток СН0-К1^ПР~ содержала в своем кариотипе 21 хромосому (модальное число). На странице 61 представлена кариограмма (Фото 3) линии клеток CHO-KI¹^⁰"".Порядковые номера хромосомам даны согласно схеме (131),литерой Z на кариограмме обозначены хромосомы имеющие перестройки.Хромосома Z-I имеет делецию в верхнем плече; хромосома Z-2 имеет интернальную делецию в коротком плече;хромосома Z-I2 образовалась путем появления в двух плечах Х-хромосомы делеций;хромосомы Z-3 и Z-7 были образованы путем реципрокной транслокации; хромосома Z-4 образована из нормальной 4 хромосомы путем транслокации длинного плеча к терминальной части короткого; Z-5 получена за счет делеций в области центромеры; Z-6 имеет транслоци-рованный участок Gf*" в терминальной части длинного плеча ; Z-8 и Z-9 образованы от нормальной хромосомы 7 путем транслокаций в короткое плечо; Z-I0 образована от 8 хромосомы за счет делеций короткого плеча; z-ІІ происходит от хромосомы 9 путем транслокации в нижнее плечо; Z-I5 образована за счет транслокации и делеций(33).

Вортон исследуя стабильность кариотипа линий СНО показал, что кариотип довольно стабилен,но квазитетраплоидные клетки могут быть источником клонов с измененным кариотипом Сущность измененного кариотипа состоит в образовании новых "маркерных" хромосом(128). _{Ж І} JC(ZI2)

4(Z4) _а г(гг)

4(23) _п S(27)

7(Z3) _{К ~ HI K<} ii 10 _І

6(26}

2(Z10) 1Q(ZB)

Фото 2.Кариограмма кариотипа перевиваемой линии китайского хомячка СН0-К1^ПР".

3.2.ПОИСК НАИЛУЧШИХ ВАРИАНТОВ СЛИЯНИЯ КЛЕТОК.

При добавлении раствора полиэтиленгликоля (ПЭГ) к суспензии клеток происходит их агглютинация. Она ведет к максимальному сближению клеток, а при последующем разведении средой к их слиянию.Чем дольше будет продолжаться процесс агглютинации,тем более тесный контакт между клетками будет обеспечиваться.Поэтому при последующем разведении изотоническим нейтральным раствором будет повышаться вероятность слияния наиболее тесно контактирующих клеток.Практически это выглядит так: увеличение времени инкубации клеток в присутствии полиэтиленгликоля ведет к образованию большего числа поликарионов.С другой стороны к этому же процессу ведет повышение концентрации ПЭГ(32).Различная воспримчивость клеток к цитотоксическому действию ПЭГ накладывает ограничения на продолжительность инкубации по времени и повышение концентрации (100).

К аналогичным выводам привели эксперименты по слиянию клеток,проведенные в нашей лаборатории. Для учета слившихся клеток был применен индекс слияния (ИС). Он характеризуется отношением многоядерных клеток поликарионов к общему количеству клеток, выраженному в процентах (14).В таблице 2 приведены индексы слияния, представляющие собой средние данные, полученные в двух экспериментах.Из данных представленных в таблице 2, видно, что увеличение времени инкубации клеток в растворе ПЭГ приводит к увеличению индекса слияния.

В экспериментах, где в качестве родительских клеток применялись лимфоциты коровы, был поставлен параллельный опыт, когда лимфоциты культивировали перед слиянием 46 часов в присутствии фитогемагглютинина (ФГА).Эта операция также ве- - 63 -дет к увеличению индекса слияния.

Опираясь на имеющиеся в литературе данные (130),нам удалось показать,что совместное культивирование лимфоцитов с клетками линии СН0-К1^ПР"" в 199 среде с сывороткой от 0,5 до I %% на протяжении 4-5 дней без смены среды в присутствии фитогемааглютинина (0,6 мл стандартного раствора ФГА типа М на 10 мл ростовой среды),также ведет к образованию гибридных клеток.

Отчасти это можно объяснить тем,что лектины представляют собой поливалентные соединения,которые сорбируясь на клеточных стенках,способствуют их взаимному контакту.Кроме того, гибридизации клеток способствует предварительная реактивация ядер высокодифференцированных клеток лимфоцитов,вызываемая ФГА. Опыт показывает, что, несмотря на универсальность явления гибридизации различные клетки по-разному вступают в слияние. К подобному выводу можно прийти,сопоставляя индексы слияния в различных вариантах гибридизации В-82 х корова и CHO-KI¹¹?⁰" х корова.

Клєїки В-82 менее охотно вступают в слияние с лимфоцитами коровы,чем клетки линии СНО. Эту особенность линии В-82 при гибридизации с лимфоцитами коровы отмечали ранее Петере и Вилли (100).

На фотографии (Фото 4) показано образование простого и сложного гетерокариона.Эти фотографии были сделаны через 5 часов после слияния. Видимо этот процесс представляет один из путей, которым происходит превращение полиокарионных клеток в синкарионные клетки.Это предположение было выдвинуто в работе (3) нашло подтверждение в (2).В последующем такое"гибридное ядро" вступает в деление с последующим об-

Таблица 2 Величина индекса слияния клеток в зависимости от типа слияния и времени инкубации в присутствии полиэтиленгликоля ! Величина продолжения инкубации с (ПЭГ (в минутах) | I ! 3 ! 5 ІСН0-КІ х К ! В82 х К ! CHO-KI х К ! В82 х К ! CHO-KI хТ

Тип слияния

Монослой+монослой

Монослой+суспензия хМонослой+суспензия лимфоцитов с ФГА

Суспензия+суспензия

Суспензия+суспензия лимфоцитов с ФГА

12,4+0,7 2,0+ 0,3 14,1+0,8

19,3+0,7 3,9+0,1 24,3+1,3

19,9+0,2 4,2+0,2 25,8+0,9

26,7+1,2 4,4+0,3 31,8+1,5

30,7+1,9 5,0+0,6 33,5+2,8

3,2+0,2 22,4+0,9

5,2+0,1 28,7+0,2

5,5+0,3 30,3+2,1

8,6+0,5 34,7+0,7

9,2+0,3 34,7+2,7

Примечание: К - клетки коровы.

Фото 4. А.Образование простого гетерокариона.Б.Образование сложного гетерокариона 5+2. разованием гибридных клеток.Учитывая данные о редком вступлении в последующее деление клеток с асинхронным митозом можно предположить,что клетки,у которых происходит слияние ядер и дают начало пролиферирующим гибридным линиям (109).

Таким образом, на основе проведенных исследований по слиянию клеток мы пришли к выводу,что наиболее удобным является метод слияния клеток монослой + суспензия,где лимфоциты были предварительно прокультивированы на протяжении 48 часов перед слиянием в присутствии ФГА.Именно поэтому в данной работе мы использовали для получения гибридных клонов метод слияния монослой + суспензия.

Методы картирования генов

В I960 году Понтекорво (102) высказал предположение,что ошибки,возникающие при мейозе,могут стать источником информации о рекомбинациях генов у человека,аналогично тому, как митотические рекомбинанты были использованы в генетическом анализе Aspergillus nid # При совместном культивировании различных мицеллиев Aspergillus образовывались спонтанные гетерокарионы.Такие многоядерные мицелии,содержащие гаплоидные ядра могут существовать без дальнейших изменений. Однако, иногда два типа гаплоидных ядер внутри гетерокариона сливались в одно,и диплоидный мицеллий продуцировал вегетативные диплоидные споры.Необходимо отметить крайне малую вероятность этого события.В отдельных случаях хромосомы таких диплоидных ядер элиминируются и иногда имеют перестройки образованные митотическим кроссинговером.Подобные генетические изменения в единичных ядрах могут регистрироваться при отделении от мицеллия вегетативных спор.Сегрегация целых хромосом позволила установить группы локусов в соответствующих хромосомах и изучая частоту кроссинговерных перестроек определить линейный порядок генов на хромосоме.Данные полученные этим путем послужили основой для построения генетической карты Aspergillus nidulans.

Подобный путь создания генетических карт неприемлем для генетики высших позвоночных.Это обусловлено низкой жизнеспособностью мутантов.Наиболее просто картировать гены,сцепленные с Х-хромосомой.Это было проиллюстрировано на примере нескольких локусов,известных как Х-сцепленных (84).

Установление локализации генов,находящихся в аутосомах, требует иного подхода.Первая генетическая карта плодовой мушки Drosophila была составлена Морганом (91).Создание этой карты базировалось на изучении частот мейотического кроссинговера.Использование статистического метода семейного анализа Никифоров (10) показал сцепленность трех казеиновых генов крупного рогатого скота и указал на относительное расстояние между ними.

Применение метода дозы генов позволило локализовать на хромосомной карте человека некоторые гены.Этот метод основан на том,что активность генов при трисомии достигает 150%, а при делециях - 50%.Вследствие ошибок,возникающих при мейозе, возникают различные варианты моносомиков и трисомиков, вызывающие различного рода генетические заболевания.Сюда можно отнести синдром Дауна (74),17-трисомию (40),синдром Тернера (46).

Фергюсон-Смит и его сотрудники описали метод картирования генов,который включает в себя тестирование гетерози-готности у пациентов с моносомией или делециями.Однако этот метод позволяет скорее исключить исследуемые гены из определенной хромосомы,чем гарантировать их наличие.Хотя такое исключение может дать и полезную информацию.Так например локализация локуса группы крови Eh. в коротком плече хромосомы I, лактатдегидрогеназы-В (ДЦГ-В) на коротком плече хромосомы 12 (112), а также локализация гена кислой фосфатазы эритроцитов в коротком плече хромосомы 2 (44) установлены именно этим путем.

К чисто визуальному картированию по праву можно отнести метод гибридизации in situ .Его суть сводится к прямой гибридизации на метафазных хромосомах копии меченной изотопами ДНК,полученной при обратной транскрипции определенного вида РНК Локализация ДНК на хромосомах устанавливается с помощью авторадиографии.Этим методом была показана возможность локализации единичных копий ДНК человеческого генома (60).

Открытие метода гибридизации соматических клеток (21) открыло новую эру в составлении генетических карт различных видов животного мира.Первым геном картированным с помощью этого метода был ген человеческой тимидинкиназы (тк ) (126). Последующее развитие методов дифференциальной окраски хромосом, дало возможность точно идентифицировать видовую принадлежность хромосом в гибридных клетках, а также различного рода транслокации и делеции хромосомного материала,что позволило более точно локализовать картируемые гены (52,68).

Элиминация хромосом в межвидовых гибридных клетках

Картирование генов человека методом гибридизации соматических клеток впервые было осуществлено благодаря спонтанному выпадению хромосом из кариотипа гибридной клетки мышь х человек (126). Вейс и Грин выращивали на селективной среде гибридные клетки мышь х человек.Клетки мыши были дефектны по тимидинкиназному гену (тк ), клетки человека WI-38 имели ген тк+. В селективной среде могли расти как гибридные так и человеческие клетки. Однако последние хотя и устойчивы к действию селективной среды, но растут медленно; гибридные же клетки, содержащие ген тк+, унаследованный от клеток человека, росли быстро, образуя дискретные колонии.

При анализе кариотипов гибридных колоний было установлено, что все клетки сохранили почти полный кариотип мыши и только отдельные хромосомы человека.Детальный анализ установил, что во всех гибридных кариотипах присутствует 17 хромосома человека, тогда как присутствие остальных варьировало. Это позволило предположить, что ген, кодирующий синтез ти-мидинкиназы человека, локализован в 17 хромосоме.Гибридные клетки, теряющие эту хромосому при спонтанной элиминации,теряли способность к дальнейшему росту.

Явление элиминации хромосом в межвидовых гибридных клетках вскоре получило подтверждение и у других исследователей (88,92,ИЗ).Было установлено, что сегрегация хромосом у межвидовых гибридных клеток является скорее правилом,чем исключением.

Механизм этого явления до сих пор остается неизвестным. Однако данные литературных источников свидетельствуют о влиянии целого комплекса факторов.Выше было показано, как дав ление факторов селективной среды приводит к отбору гибридов, имеющих 17 хромосому человека (126).При скрещивании соматических клеток животных различных видов, была установлена зависимость направления сегрегации хромосом от их видовой принадлежности (14,16).

Кроме того была установлена зависимость сегрегации от типа клеток животных, участвующих в слиянии (127).Несколько позже в лаборатории Минн показали преимущественную сегрегацию хромосом в высокодифференцированных клетках при их слиянии с культуральными перевиваемыми линиями (86), хотя результаты полученные Кросс свидетельствуют о некоторых исключениях из этого правила (29). Эти факты в какой-то степени можно объяснить тем, что при скрещивании клеток с различным периодом деления, будут элиминироваться хромосомы клеток с более продолжительным циклом деления (64).

Машсуя и другие (83) показали отрицательную корреляцию между скоростью роста гибридных клеток и скоростью сегрегации. После гибридизации клетки начинают довольно быстро терять хромосомы одного из родительских геномов. По мере дальнейшего роста клеток скорость сегрегации уменьшается и ка-риотип стабилизируется.

Для стабилизации кариотипа требуется, чтобы гибридные клетки прошли определенное число генераций. Для каждого типа гибридизуемых клеток длительность этого периода может варьировать от двух недель до трех-четырех месяцев (67,86). В стабилизированном кариотипе гибридных клонов остаются дискретные группы хромосом. Имея достаточно большое число гибридных клонов с различными вариантами хромосомных групп, можно определить связь присутствия или отсутствия хромосомы с синтезом белкового продукта или его прекращением.Этот подход к определению локализации генов впервые был предложен Бодмеромйего сотрудниками (89,92). Вскоре он был применен Раддлом (ИЗ). Так на основе феномена элиминации хромосом у гибридных клеток была доказана локализация некоторых генов на определенных хромосомах.

Широта применения метода гибридизации соматических клеток дает ключ к построению генетических карт различных животных (13,15,38). Для этой цели необходимо с определенной гарантией предсказывать направление элиминации хромосом. Основываясь на литературных данных,представленных в таблице I, можно сделать вывод некоторых закономерностей (14).

Данные представленные в таблице I,позволяют сделать вывод, что в большинстве случаев при гибридизации перевиваемых линий грызунов (мышь, китайский хомячок, сирийский хомячок) с диплоидными клетками филогенетически отдаленных видов будут элиминироваться хромосомы диплоидных клеток.

Наиболее удобный вариант скрещивания как в отношении применения селективных сред, так и в вероятном направлении элиминации хромосом был предложен сотрудниками Стэнфордского университета (92). При гибридизации клеток мыши и человека в качестве источника диплоидных клеток человека они использовали лимфоциты, так как они являются высокодифференциро-ванными клетками и не размножаются in vitro при обычных условиях культивирования. Позже были получены аналогичные данные, касающиеся всех высокодифференцированных клеток, имеющих ядра (86).

Получение первичных культур клеток

Эмбрионы коров оперировали под ламинаром с соблюдением условий стерильности.Отпрепарированную ткань легкого эмбриона коровы помещали в раствор Хэнкса со следующим содержанием антибиотиков: пенициллин - 600 ед/мл,стрептомицин - 600 мкг/мл В этом растворе ткань отмывали от крови двойной сменой Хэнкса с антибиотиками.Отмытую ткань нарезали мелкими кусочками в свежей порции этого раствора и промывали 3-4 раза для удаления клеток крови и обрывков соединительной ткани. Измельченную ткань трипсинизировали в 0,25% растворе трипсина 30-40 минут при комнатной температуре.Суспензию клеток отбрасывали,а оставшиеся кусочки трипсинизировали 2-3 раза по I часу.Эмбриональная ткань в отличие от тканей взрослого животного легче подвергается трипсинизации.Достаточное количество клеток можно набрать и при однократной трипсинизации. В 20-25 мл среды 199 с 20% содержанием сыворотки эмбриона коров добавляли 1-2 мл суспензии трипсинизированных клеток .Содержание антибиотиков в такой ростовой среде составляло 300 ед/мл пенициллина и 300 мкг/мл стрептомицина.Культивирование осуществлялось в 100 мл флаконах Павицкого.

На следующий день ростовую среду заменяли на свежую с меньшей концентрацией антибиотиков (пенициллин - 200 ед/мл, стрептомицин - 200 мкг/мл).При смене среды удалялись неад-гезированные к стеклу клетки и кусочки ткани.

Если ткань брали нестерильно,тогда применяли другой способ обработки.Нестерильную ткань помещали в 70% раствор этанола на 1-2 минуты.Остатки спирта на ткани удаляли 5-кратной последовательной отмывкой в растворе Хэнкса с высоким содер -жанием антибиотиков пенициллин - 1000 ед/мл,стрептомицин -1000 мкг/мл.После отмывки денатурированную ткань обрезали стерильными ножницами и разрезали на мелкие кусочки.Дальнейшая последовательность операций такая же как описано в предыдущей методике.

В случае взятия ткани от взрослых животных после трип-синизации выдерживали посевную концентрацию 5 х 10 клеток на 100 мл матрас.При более низкой концентрации клеток резко снижается адгезивная способность фибробластов легкого коровы.

Полученные такими методами первичные культуры проходили 4-6 пассажей.

Вследствие низкой скорости реакции оседания эритроцитов (РОЭ) у коровы,выделение лимфоцитов требует специальных приемов .Кровь у телят собирали в стерильные флаконы с помощью донорских комплектов ВК-І0-0І однократного использования. В В качестве антикоагулянта использовали натриевую соль гепарина (конечная концентрация - 10 ед/мл; I мг=130 ед).

Первоначально лимфоциты выделяли частичным лизисом цельной крови в 0,1% растворе тритона Х-100.Раствор тритона готовили на растворе Хэнкса.Этот метод несмотря на его простоту, оказался малоперспективным,т.к.после двухкратного воздействия остается мало жизнеспособных лимфоцитов,ориентировочно 25-30%%.

Наиболее подходящим вариантом выделения лимфоцитов оказался метод очистки лимфоцитов в верографин-фиколловом градиенте (75,99).Для этого готовили 10% раствор верографина и -доводили его плотность 6% раствором фиколла (Picoll 400 ) d=I,076 г/мл.Стерилизовали такой раствор фильтрацией через фильтр GS фирмы Millipore с диаметром пор 0,22 мкм.

В стерильную пробирку под ламинаром вносили 3 мл этого раствора и сверху осторожно наслаивали 2 мл гепаринизирован-ной крови.Пробирку закрывали алюминевой фольгой и центрифугировали 30 минут при 1000 об/мин (радус ротора 22 см).После прохождения смеси клеток крови через градиент плотности в пробирке образовываются 4 зоны: от дна кверху - слой эритроцитов; прозрачный верографин-фиколловый раствор; тонкий слой суспензии лимфоцитов; плазма крови.Слой лимфоцитов осторожно удалялся стерильной пастеровской пипеткой и его суспендировали в 10 мл раствора Хэнкса с содержанием антибиотиков 500 ед/мл пенициллина и 500 мкг/мл стрептомицина.Суспензию лимфоцитов трехкратно отмывали в этом растворе.

Дальнейшая судьба лимфоцитов зависела от цели эксперимента. Для культивирования с целью получения метафазных пластинок, их помещали в 199 среду с 15% эмбриональной сывороткой и добавкой фитогемагглютинина.

Кариотипы родительских клеток

Самая большая по размерам пара телоцентричес-ких хромосом.Отличительной особенностью хромосомы І в расположении G-сегментов является присутствие слабо окрашенной зоны,локализованной на ее середине.Эта зона делит хромосому на два участка.Проксимальный участок,расположенный ближе к центромере,имеет 4 темных хорошо окрашенных полос.Дис-тальный конец,расположенный дальше от центромеры,также имеет 4 темноокрашенных участка.

Хромосома 2.Как и хромосома I, делится светлым участком посредине.Проксимальный и дистальный участки разделенные светлым участком имеют по 3 полосы окрашенных в темный цвет.

Хромосома 3.Светлая зона делит хромосому на проксимальном к центромере участке на 2 части.Проксимальный имеет I полосу,дистальный - 4.

Хромосома 4.Имеет 7 темных, хорошо прокрашиваемых участка, которые относительно равномерно распределены вдоль всей хромосомы.

Хромосома 5.Обычно эта хромосома имеет 5 полос,3 из которых представлены более плотно окрашенными участками.

Хромосома 6.Проксимальный участок имеет 3 четко окрашенных полосы.Дистальный участок окрашен слабо.

Хромосома 7.Содержит 3 больших хорошо окрашенных участка. Проксимальный участок представлен одним широким сегментом. Дистальный участок состоит из 2 плотно окрашенных сегмента, расположенных близко друг от друга.Средний участок состоит из 3,близко расположенных сегментов.

Хромосома 8.Проксимальный и средний участки хорошо окрашены. Терминальный участок имеет две слабо окрашенные полосы сегментов.

Хромосома 9.Включает в себя 4 равномерно распределенных участка,два средних из которых имеют парные близко расположенные полосы сегментов.В отдельных случаях из-за сильной спирализации они не идентифицируются как раздельные и средний участок представлен двумя широкими полосами сегментов.

Хромосома 10.По всей длине имеет плотное окрашивание, средний участок окрашен слабо и делит хромосому на две зоны по удаленности от центромеры: на проксимальную и дистальную.

Хромосома II.Имеет 4 возрастающие по ширине темных сегмента.В отличие от хромосомы 9,дистальный участок окрашен слабо.

Хромосома 12.В средней части плеч находятся две четкие полосы сегментов.На проксимальном участке - одна темная полоса.Дистальный участок окрашен слабо.

Хромосома 13.Проксимальная зона имеет две темные полосы сегментов,терминальный участок окрашен слабо.

Хромосома 14.В отличие от остальных хромосом,в проксимальной зоне отсутствует темный сегмент.В средней зоне присутствуют две близко расположенные полосы сегментов.

Хромосома 15.В проксимальной части хромосомы преобладает один широкий сегмент,в дествительности это две полосы сегментов, часто сливающихся в одну.

Хромосома 16.Имеет два отчетливых темных сегмента в проксимальном и дистальном участках,которые являются наиболее характерными для этой пары хромосом.

Хромосома 17.В отличие от близкой по размерам 16 пары, -эту пару хромосом отличает темная полоса на проксимальном участке. Хромосома 18.Единственная хромосома из этой группы,которая имеет один темный участок в средней части. Хромосома 19.Проксимальная и средняя зоны имеют по одному окрашенному в темный цвет сегменту.Дистальный участок окрашен слабо. Хромосома 20.Единственная пара хромосом в нормальном кариотипе,имеющая одну темную полосу. Хромосома 21.Имеет два широких темных сегмента расположенных полярно,относительно друг друга. Хромосома 22.Средний и дистальный районы имеют по одной полосе сегментов,которые при высокой степени спирализации могут сливаться в одну широкую зону.При более слабой степени спирализации ее можно ошибочно идентифицировать как 21. В этом случае отличие идет по размерам. Хромосома 23.Включает три темные полосы сегментов.При нормальной степени спирализации дистальная пара сегментов сливается в одну;от 21 хромосомы отличается более плотной окраской. Хромосома 24.Имеет хорошо различимые 3 темные полосы сегментов, равномерно распределенных по всему плечу хромосомы. Хромосомы 25 и 27.В проксимальной зоне расположены две прижатые друг к другу полосы.Дистальные участки хромосом окрашены слабо.Между собой отличаются размерами. Хромосома 26.Имеет два характерных темноокрашенных сегмента .Идентифицируется легко.

Похожие диссертации на Картирование генов на хромосомах крупного рогатого скота методом гибридизации соматических клеток

Клонирование и экспрессия химически синтезированного гена гормона брадикинина в клетках E. Coli. Капелинская Т.В.

Оценка трансфекции гена VEGF121 в мультипотентные стромальные клетки человека невирусными методамиСмирнихина, Светлана Анатольевна

Индукция эпигенетической гетерогенности в популяции клеток , содержащих искусственные циклические системы геновСтупак Евгения Эдуардовна

Экспрессия эпиаллелей генов Oct4 и Nanog, ответственных за поддержание плюрипотентности, и тканеспецифичных генов в межвидовых эмбриональных стволовых гибридных клеткахБаттулин Нариман Рашитович

Характеристика половых клеток петухов как мишеней для генно-инженерных манипуляцийБелоглазова, Елена Викторовна

Изучение экспрессии генов, участвующих в системном контроле деления клеток и дифференцировки у высших растений, на модели спонтанного опухолеобразования у инбредных линий редиса (Raphanus sativus var. Radicula Pers. )Додуева Ирина Евгеньевна

Эффекты гиперэкспрессии гена белка предшественника амилоида в нервных клетках дрозофилы и поиск антиамилоидогенных соединенийРодин Дмитрий Игоревич

Роль гена WOX5 в контроле пролиферации и дифференцировки клеток на модели органогенеза клубеньков бобовых растенийОсипова, Мария Александровна

Поиск и изучение генов, участвующих в транспортировке пуриновых производных из клеток Escherichia coliГронский Сергей Викторович

Сравнительный анализ экспрессии нативного и модифицированного генов cry3a Bacillus thuringiensis в прокариотических и эукариотических клетках Салехи Джузани Голам Реза