Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ
(Обзор литературы) 9
1.1 Эпигенетическая изменчивость прокариот . 9
1 2. Эпигенетические механизмы клеточной дифференцировки эукариот...19
1.3. Наследование функциональных состояний генных сетей 28
1.3.1 Эпигенные системы . 29
1 3 2. Стохастические флуктуации содержания белков в клетке 32
1.3.3 Искусственные циклические системы 34
ГЛАВА 2 ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ .41
2. Объект исследования .41
2 2 Среда культивирования и условия роста 41
2 3 Выявление клеток, синтезирующих р-галактозид азу . 43
2 4 Определение активности Р-галактозидазы 43
2 5 Выделение и очистка плазмидной ДНК. 44
26 Трансформация клеток E.coli 45
2 10 Статистический анализ . 46
2 11 Штаммы Е coh иплазмиды . 46
2 13 Реактивы 46
ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ. 47
3.1. Наследование эпигенотипов клетками JC158(pCIK3) в периодической культуре в отсутствие индуцирующих факторов . . 49
3.2. Наследование эпигенотипов клетками JCI58(pCIK3/pLad) в периодической культуре в отсутствие индуцирующих факторов 60
3 3 Изменение эпигенетического состава популяции клеток JC158(pCIK3) под действием индуцирующих факторов 67
3 4 Динамика перехода клеток, содержащих ЦДС из метастабильного состояния в стабильные 76
3,5 Зависимость соотношения фенотипов клеток от фазы роста культуры
на момент устранения действия индукторов .. 85
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 89
ВЫВОДЫ 91
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ . 92
- Эпигенетическая изменчивость прокариот
- Среда культивирования и условия роста
- Наследование эпигенотипов клетками JC158(pCIK3) в периодической культуре в отсутствие индуцирующих факторов
Введение к работе
Актуальность проблемы. Паттерн экспрессии генов определяет фенотип клетки. Наследуемые изменения уровней экспрессии генов в клетках лежат в основе таких процессов как: выбор между литическим и лизогенным путями развития у умеренных бактериофагов (Johnson et al., 1981); фазовые вариации у прокариот (van der Woude, Baumler, 2004; van der Woude, 2005); клеточная дифференцировка эукариот (Latham, 1999; Kepes, 2005). Исследование механизмов возникновения дифференциальной активности генов в индивидуальных клетках клональной популяции - одно из наиболее актуальных направлений современной биологии. В большинстве случаев наследуемые в клеточных поколениях, но обратимые изменения генной активности являются результатом взаимосвязанных генетических (транспозиции, инверсии) и эпигенетических факторов (структура хроматина, модификации ДНК и ДНК-ассоциированных белков, переключение уровня синтеза транскрипционных факторов в циклических системах генов). Причем обратимые перестройки последовательности ДНК контролируются регуляторными белками (van der Woude, Baumler, 2004).
Как было показано в ряде работ (Gardner et al., 2000; Tchuraev et al., 2000) циклические дигенные системы с отрицательными обратными связями (ЦДС ) могут поддерживать два альтернативных уровня экспрессии генов и, соответственно, два фенотипа клетки. В этом случае ЦДС является динамическим эпигеном, в котором часть наследственной информации хранится, кодируется и передается потомству вне первичной структуры молекул ДНК генома (Чураев, 1975). Использование при конструировании хорошо охарактеризованных генетических элементов, простая структура и наличие обратных связей, стабилизирующих систему, делают искусственные ЦДС удобным объектом для изучения основных закономерностей возникновения фенотипической гетерогенности в популяции генетически однородных клеток.
Цель работы - исследовать возможность индукции наследуемой эпигенетической гетерогенности в клональной популяции клеток Escherichia coli, содержащих искусственные циклические системы генов.
Задачи исследования:
Исследовать стабильность наследования каждого из альтернативных фенотипов клеток, содержащих циклические дигенные системы с отрицательными обратными связями в процессе роста периодической культуры.
Исследовать фенотипический состав популяции клеток, содержащих ЦДС и циклическую моногенную систему с отрицательной обратной связью в процессе роста периодической культуры.
Проверить возможность расщепления клональной популяции клеток Е. coli, содержащих ЦДС , на две фенотипически различающихся субпопуляции в отсутствие специфических индуцирующих факторов.
Поставить эксперимент по одновременному воздействию двух индуцирующих факторов на клетки, содержащие ЦДС , для проверки гипотезы о существовании метастабильного состояния.
Исследовать влияние метаболизма клетки в момент воздействия индукторов на соотношение альтернативных субпопуляций клеток в дальнейшем.
Научная новизна исследования. Обнаружена возможность переключения функциональных состояний ЦДС изменением скорости роста культуры. Впервые установлено, что клетка, содержащая динамический эпиген, может при делении образовать дочерние клетки, детерминированные к альтернативному фенотипу. Экспериментально показано новое свойство динамического эпигена: возможность перехода в метастабильное состояние под воздействием внешних факторов. Впервые получена экспериментальная модель одного из молекулярных механизмов детерминации клеток к самодифференцировке.
Научно-практическая значимость работы. Исследование эпигенетических механизмов возникновения фенотипической гетерогенности в изначально гомогенной популяции создает основу для разработки систем управления клеточными процессами. В биотехнологии управление структурой популяции, т.е.
поддержание необходимых фенотипических разновидностей клеток в необходимых пропорциях, позволит контролировать скорость процесса и варьировать на разных этапах соотношение синтезируемых продуктов. Поскольку многие мультифакторные признаки с изменчивой пенетрантностью (частотой проявления признака), возможно, имеют эпигенетическую основу, понимание причин разного уровня экспрессии генов в генетически однородных клетках необходимо для достоверной интерпретации результатов генетического анализа. Апробация работы. Результаты исследования были представлены на III съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2004), международной научной конференции «Молекулярная генетика, геномика и биотехнология» (Минск, 2005), 9 и 10 Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2005, 2006).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ.
Структура и объём диссертации. Работа изложена на 110 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, описания методов и материалов, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Список литературы включает 200 источников. Диссертация иллюстрирована 2 схемами, 14 графиками и 28 фотографиями.
Благодарности. Считаю своей приятной обязанностью выразить признательность моему научному руководителю д.б.н. проф Чураеву Р.Н., сотрудникам института биологии н.с. Ступак И.В., к.б.н. Галимзянову А.В., к.б.н. Галимзяновой Н.Ф., к.б.н. Миграновой И.Г., м.н.с. Тропыниной Т.С.
ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объект исследования. Исследования проводились на клетках Е. coli штамма JC158 (Hfr Р01, Ml, serA6, lacI22, relAl) (Murphy, Pembroke, 1995), трансформированных плазмидами рСІКЗ и/или pLACI. Плазмида рСІКЗ (предоставлена Дж. Коллинзом (J.J. Collins, Boston University, USA)) содержит ЦДС("} (рис. 1 А), плазмида pLACI - ЦМС(_) (рис. 1Б).
Методы исследования. Клетки культивировали в богатой среде LB или в минимальной среде М9 с казаминовыми кислотами и 40мМ источником
углерода (глюкоза, ацетат натрия) с добавлением необходимых для поддержания плазмид антибиотиков, при 30С или 42С (Миллер, 1976). Логарифмическую фазу роста поддерживали периодическими разведениями свежей средой, оптическая плотность культуры составляла 0.04-0.4 ед. при длине волны бООнм (D60o). Рост клеток в периодической культуре исследовали на протяжении 24 часов, начиная с Ббоо= 0,04-0,08. Для индукции экспрессии с Ріас-промотора использовали изопропил-Р-О-тиогалактозид (ИПТГ) в концентрации 1мМ. Бактериальные клетки синтезирующие Р-галактозидазу выявляли на чашках Петри со средой LB, содержащей 40 мкг/мл хромогенного субстрата X-Gal (Миллер, 1976). Активность Р-галактозидазы оценивали при помощи хромогенного субстрата о-нитрофенил-Р-О-галактозида (ОНФГ) и вычисляли в условных единицах по следующей формуле: 1000*D4oo/(t*v*D6oo), где D4oo - измеренные значения для реакционной смеси, D6oo отражает плотность клеточной суспензии перед определением, t - время реакции в мин и v - объем пробы культуры, взятой для определения, в мл (Миллер, 1976). Полученная величина пропорциональна увеличению количества о-нитрофенола в минуту на одну бактериальную клетку. Плазмидную ДНК выделяли методом щелочного лизиса (Харди, 1990). Трансформацию проводили по оригинальной методике, основанной на прописях, предложенных в работах Ханаана (1988) и Perbal (1988).
ИПТГ
\
ИПТГ
\
gfpmut3
—\А
Рт, ) lad
рСІКЗ
lad pLACI
lacZ
\Л
lacZ К Plac
хромосома
Рис. 1. Схемы искусственных генных сетей, используемых в работе.
А. Сеть, состоящая из циклической дигенной системы с отрицательными обратными связями, локализованной на плазмиде рСІКЗ и маркерного гена lacZ на хромосоме. Б. Циклическая моногенная система с отрицательной обратной связью, локализованная на плазмиде pLACI.
Статистический анализ. Статистическую обработку проводили в программе Microsoft Exel. На графиках приведены средние данные из серии однотипных экспериментов (не менее трех повторностей). Принадлежность данных, полученных в экспериментах серии, к одной генеральной совокупности проверяли по критерию х
Эпигенетическая изменчивость прокариот
Классический пример наследования двух разных уровней экспрессии -эпиген Х-фага (Чураев, 1975; Johnson et al, 1981, Shea, Ackers, 1985), представляющий собой часть системы управления развитием этого фага и состоящий из генов его и с/, считывающихся с промоторов PR И P[lm, соответственно (Ptashne et al, 1980) При инфекции бактериофаг идет либо по пути лизиса, либо встраивается в геном хозяина В каждом из этих случаев набор экспрессирующихся генов различается. Таким образом, геном фага кодирует возможные состояния, а выбор конкретного состояния определяется наличием или отсутствием соответствующего белка-репрессора (Ратнер, Чураев, 1971). Частота прерывания лизогении составляет приблизительно 10"5 на клетку за генерацию, причем в основном это последствия активации RecA, а прерывание лизогении непосредственно в результате случайных процессов в зоне переключателя составляет 10"7 (Rozanov et al., 1998; Little et al, 1999). Частота мутационных процессов на этом участке 10"6 -10"7, т.е. эпигенетичская система даже более стабильна, чем геном (Little et al, 1999)
Наследование двух (или более) разных паттернов экспрессии генов наблюдается и при фазовых вариациях у бактерий. Это явление - результат наследуемого изменения уровня экспрессии одного или более генов При этом, в ряду клеточных делений большинство клеток сохраняет фенотип, соответствующий родительскому, а часть переключается, что и приводит к фенотипической разнородности клональной популяции
От случайных мутаций фазовые вариации отличаются более высокой частотой переключения- 10" - 10 Частота зависит от вида и штамма бактерии, гена и молекулярного механизма, контролирующего переключение (van der Woude, Baumler, 2004, van der Woude, 2006) Вариации описаны как для патогенных, так и для непатогенных бактерий и могут иметь разнообразные фенотипические проявления, затрагивающие клеточные структуры и метаболические пути (Головлев, 1998, van der Woude, Baumler, 2004).
Среда культивирования и условия роста
Клетки культивировали в богатой среде LB или в минимальной среде М9 с казаминовыми кислотами и 40мМ источником углерода (глюкоза, ацетат натрия), при 30С или 42С. Состав сред LB - на 1л триптон Bacto Юг, дрожжевой экстракт Bacto 5г, NaCl Юг, М9 - на 1л Na2HP04 6г, КН2Р04 Зг, NaCl 0,5г, NH4CI 1г, после автоклавирования 10мл 0,01М раствора СаС12 и витамин В1 до конечной концентрации I мкг/мл (Миллер, 1976). Среды содержали необходимые для поддержания плазмид антибиотики ампициллин (Ар) 100 мкг/мл, канамицин (Km) 80 мкг/мл. Для аэрации использовали качалку (160 об/мин). Логарифмическую фазу роста поддерживали периодическими разведениями свежей средой, оптическая плотность культуры составляла 0.04-0 4 ед. при длине волны бООнм (D o) Рост клеток в периодической культуре исследовали начиная с D oo = 0 04-0,08
Наследование эпигенотипов клетками JC158(pCIK3) в периодической культуре в отсутствие индуцирующих факторов
Экспрессия генов с /ас-промотора дикого типа регулируется не только репрессором лактозного оперона, но и белком-активатором катаболитных оперонов (БАК, Сгр). БАК активирует транскрипцию бактериальных генов, продукты которых участвуют в расщеплении (катаболизме) различных органических соединений (преимущественно Сахаров), используемых растущей бактериальной клеткой в качестве источника углерода. Содержание в клетках БАК зависит от доступности для клетки углерода в среде Свойства активатора транскрипции БАК приобретает в комплексе с циклическим аденозинмонофосфатом (цАМФ). При взаимодействии комплекса БАК-цАМФ с /ас-промотором происходит десятикратное увеличение равновесной константы ассоциации РНК-полимеразы с промотором (Патрушев, 2000). Внутриклеточная концентрация цАМФ возрастает у бактерий на бедных питательных средах и понижается в условиях избытка легко усвояемых источников углерода, например глюкозы (Pastan, Adhya, 1976). Замедление скорости роста культуры приводит к увеличению в клетке концентрации как цАМФ, так и самого белка БАК (Nasser etal., 2001).
При периодическом культивировании бактериальных клеток (культивирование в закрытой системе) скорость роста культуры после окончания экспоненциального роста постепенно уменьшается, снижаясь до нуля к стационарной фазе. Для продолжающейся культуры было показано увеличение содержания р-галактозидазы в клетке в 3-4 раза при уменьшении скорости роста (Kuo et al., 2003). Следовательно, при периодическом культивировании активность р-галактоз ид азы будет постепенно возрастать в процессе роста культуры.
![Влияние аллелей полиморфных генов системы HLA II класса, фолатного обмена, гемостаза и детоксикации на репродукцию человека [Электронный ресурс]](/i/i/4357/184412.png "Влияние аллелей полиморфных генов системы HLA II класса, фолатного обмена, гемостаза и детоксикации на репродукцию человека [Электронный ресурс] Бескоровайная Татьяна Сергеевна")
