Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Литературный обзор
1.1 Активные формы кислорода и их значение для жизнедеятельности человека 18
1.2 Структурно-функциональная организация антиоксидантной системы человека 24
1.3 Общая характеристика ферментов антиоксидантной системы, их генетический полиморфизм и связь с предрасположенностью к мультифакториальным заболеваниям 30
Глава II. Материалы и методы исследования
II. 1 Характеристика обследованных групп 49
II.2 Характеристика методов исследования 49
Результаты собственных исследований
Глава III. Популяционная распространенность аллелей и генотипов ферментов антиоксидантной системы и их связь с развитием мультифакториальных заболеваний
III. 1 Популяционная характеристика частот аллелей и генотипов ферментов антиоксидантной системы у русского населения Центрально-Черноземного региона России 58
III.2 Анализ ассоциации аллелей и генотипов полиморфизма генов ферментов антиоксидантной системы с развитием мультифакториальных заболеваний 67
Глава IV. Поло-возрастные особенности и роль взаимодействий генотип-среда в ассоциациях полиморфизма генов ферментов антиоксидантной системы с развитием мультифакториальных заболеваний
IV. 1 Проявление полового диморфизма в ассоциациях генов ферментов антиоксидантной системы с предрасположенностью к мультифакториальным заболеваниям 97
IV.2 Роль генов ферментов антиоксидантной системы в возрастной манифестации мультифакториальных заболеваний 101
IV.3 Оценка фенотипических эффектов генетических моделей взаимодействия между аллелями генов АОС, ассоциированных с предрасположенностью к МФЗ, с учетом полового диморфизма и возраста начала болезней 108
IV.4 Сопряженность фенотипических эффектов полиморфных вариантов
генов АОС с влиянием средовых факторов про- и антиокислительного действия в реализации наследственной предрасположенности к мультифакториальным заболеваниям 112
Глава V. Роль межгенных взаимодействий между генами ферментов антиоксидантной системы и другими генами-регуляторами гомеостаза в реализации наследственной предрасположенности к мультифакториальным заболеваниям
V.1 Анализ взаимодействия между генами ферментов антиоксидантной системы и их значение в формировании предрасположенности к патогенетически различным мультифакториальным заболеваниям 123
V.2 Взаимосвязь генов ферментов антиоксидантной системы с известными кандидатными генами мультифакториальных заболеваний 149
Глава VI. Моделирование межгенных взаимодействий ферментов антиоксидантной защиты и других генов-регуляторов гомеостаза при мультифакториальных заболеваниях
VI. 1. Поиск межгенных взаимодействий, формирующих предрасположенность к патогенетически различным мультифакториальным заболеваниям методом Set-Association 180
VI.2 Моделирование межгенных взаимодействий при патогенетически различных мультифакториальных заболеваниях с использованием метода MDR 191
VI.3 Анализ величин неравновесия по сцеплению и гаметических корреляций между полиморфными вариантами генов ферментов антиоксидантной системы при мультифакториальных заболеваниях 213
Обсуждение результатов
1. Роль генов ферментов антиоксидантной системы в формировании предрасположенности к бронхиальной астме 220
2. Роль генов ферментов антиоксидантной системы в формировании предрасположенности к гипертонической болезни 239
3. Роль генов ферментов антиоксидантной системы в формировании предрасположенности к язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки 248
4. Гены ферментов антиоксидантной системы как полигенная основа развития мультифакториальных заболеваний 255
Заключение 276
Выводы 295
Практические рекомендации 297
Список литературы
- Общая характеристика ферментов антиоксидантной системы, их генетический полиморфизм и связь с предрасположенностью к мультифакториальным заболеваниям
- Анализ ассоциации аллелей и генотипов полиморфизма генов ферментов антиоксидантной системы с развитием мультифакториальных заболеваний
- Роль генов ферментов антиоксидантной системы в возрастной манифестации мультифакториальных заболеваний
- Взаимосвязь генов ферментов антиоксидантной системы с известными кандидатными генами мультифакториальных заболеваний
Введение к работе
Актуальность проблемы
Одной из наиболее древних, эволюционно сложившихся и сложноустроенных биологических систем у человека является система редокс-гомеостаза, главным компонентом которой является сеть ферментов антиоксидантной защиты, контролирующих течение, направленность и интенсивность процессов свободнорадикального окисления (СРО) в органах и тканях и обеспечивающих приспособление организма к изменяющимся условиям внешней среды [Скулачев В.П. 1988; Величковский, 2001; Зозуля Ю.А. и др. 2000; Halliwell В.М.С. и Gutteridge J., 2007]. Система антиоксидантной защиты представляет собой разветвленную, многокомпонентную сеть физиологически активных веществ, объединяющих ферментные и неферментные соединения, которые включаются в работу последовательно, взаимно дополняя друг друга, тем самым, обеспечивая контроль окислительных реакций и инактивацию всего многообразия токсичных продуктов СРО. Основными биологическими субстратами ферментов антиоксидантной системы (АОС) являются активные формы кислорода (АФК), которые при физиологических концентрациях регулируют важнейшие биологические процессы в клетках: митогенную активность, регуляцию генной экспрессии [Степаненко И.Л., 2004], индукцию и реализацию апоптоза [Скулачев В.П., 2001], модуляцию иммунного ответа [Drapier J.C.1991], антибактериальную защиту [Forman H.J.1986], клеточную адгезию и воспалительные реакции [Кулинский В.И. 1999], а также сигнальную трансдукцию [Burdon R.H., 1992]. Однако, при избыточных концентрациях, АФК могут приводить к окислительной модификации и инактивации различных ферментов и структурных белков, повреждению клеточных мембран посредством активации перекисного окисления липидов и гликозилирования белков, вызывают структурные повреждения молекулы ДНК, способствуя возникновению генных мутаций [Ере В. 1991; Eisenberg W.C. 1992; Kehrer J.P. 1993; Halliwell В.М.С, Gutteridge J., 2007]. Именно посредством скоординированного взаимодействия ферментов антиоксидантной защиты, а также буферной емкости неферментативной компоненты редокс-гомеостаза осуществляется поддержание окислительных процессов на уровне, необходимом для нормального течения многочисленных физиологических процессов на клеточном уровне [Соколовский В.В., 1988; Эмануэль Н.М., 1984]. Если процессы образования и обезвреживания АФК выходят из-под контроля, то нарушается баланс между интенсивностью прооксидантных и антиоксидантных реакций с накоплением продуктов СРО, формированием окислительного стресса (ОС) и формируются стойкие патологические состояния. На сегодняшний день уже известно более 100 нозологических форм болезней, в этиопатогенезе которых ведущая роль принадлежит активации СРО и накоплению в тканях токсичных свободных радикалов [Зборовская И.А., 1995; Hamanishi Т., et al, 2004; Zhou XF et al, 2005; Halliwell B.M.C., Gutteridge J., 2007; Chaves FJ et al, 2007; Moffatt MF.2008]. Подавляющее большинство этих болезней относится к категории мультифакториальных заболеваний (МФЗ), возникающих при совместном участии генетических и средовых факторов. Многочисленными зарубежными и отечественными исследованиями, проводившимися за последние 30 лет, было
убедительно показано, что нарушения в функционировании антиоксидантной системы могут лежать в основе практически всех известных сегодня мультифакториальных заболеваний.
Хорошо известно, что антиоксидантная система включает в себя большое
количество звеньев, но генетически детерминированными являются
антиоксидантные ферменты, характеризующиеся выраженными
межиндивидуальными и популяционными различиями в ферментативной активности, благодаря наличию в структуре их генов функционально неравноценных полиморфных аллелей [Halliwell В., M.C.Gutteridge J., 2007]. Именно наличие ДНК-полиморфизмов в структуре генов ферментов АОС делает каждого человека уникальным в отношении активности свободнорадикальных процессов, что и определяет его индивидуальную устойчивость или чувствительность к повреждающему действию прооксидантов внешней среды и, фактически, детерминирует возможность развития патологических процессов. Благодаря многолетним исследованиям, проводившимся сотрудниками кафедры биологии, медицинской генетики и экологии Курского государственного медицинского университета, была впервые сформулирована эколого-токсикогенетическая концепция мультифакториальных заболеваний, согласно которой генетическую основу формирования распространенных МФЗ у человека составляют специфические взаимодействия между генами ферментов биотрансформации ксенобиотиков, которые совместно со средовыми факторами токсической природы способны инициировать развитие самых разнообразных по проявлениям болезней [Полоников А.В., Иванов В.П., Соло лилова М.А., 2008]. В связи с тем, что система биотрансформации ксенобиотиков структурно и функционально интегрирована с системой антиоксидантной защиты, гены ферментов АОС могут также вносить существенный вклад в генетическую компоненту подверженности распространенным МФЗ в современных популяциях человека. Однако, не смотря на растущее в последние годы количество работ, посвященных изучению роли генов АОС в развитии мультифакториальных заболеваний [Guzik T.J. et al, 2000; Ito D. et al, 2000; Nakamura S, et al, 2002; David GL, et al, 2003; Hsu PI et al, 2005; Ambrosone CB et al, 2005; Chaves FJ et al, 2007, Moffatt MF.2008], остаются невыясненными вопросы молекулярно-генетических механизмов, лежащих в основе реализации полигенной предрасположенности к данному классу болезней, детерминированной изменчивостью интегрированного комплекса антиоксидантных и прооксидантных ферментов. В связи с потенциальной вовлеченностью генов ферментов АОС в этиопатогенез распространенных и социально значимых мультифакториальных заболеваний представлялось крайне важным осуществление комплексного молекулярно-генетическое изучения вклада полиморфных вариантов данных генов в формирование предрасположенности к указанному классу болезней человека.
Цель исследования
Осуществить комплексный молекулярно-генетический анализ
вовлеченности полиморфизма генов ферментов антиоксидантной системы в развитии распространенных мультифакториальных заболеваний у человека на примере язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, бронхиальной астмы и гипертонической болезни.
Задачи исследования
-
Изучить популяционную распространенность полиморфных вариантов генов ферментов антиоксидантной системы среди русских жителей Центрально-Черноземного региона Российской Федерации.
-
Провести анализ ассоциаций полиморфизма генов ферментов антиоксидантной системы с предрасположенностью к трем патогенетически самостоятельным мультифакториальным заболеваниям: язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, бронхиальной астме и гипертонической болезни.
-
Установить особенности ассоциаций полиморфных вариантов генов антиоксидантной системы с предрасположенностью к различным клинико-патогенетическим вариантам рассматриваемых мультифакториальных заболеваний с учетом полового диморфизма и возраста их манифеста.
-
Провести оценку фенотипических эффектов генетических моделей взаимодействия между аллелями генов антиоксидантной системы, которые будут ассоциированы с предрасположенностью к изучаемым МФЗ, с учетом полового диморфизма и возраста начала болезней.
-
Исследовать сопряженность фенотипических эффектов полиморфных вариантов генов антиоксидантной системы с влиянием средовых факторов прооксидантного и антиоксидантного действия в реализации наследственной предрасположенности к изучаемым мультифакториальным заболеваниям.
6. Проанализировать взаимодействия между генами ферментов
антиоксидантной системы, а также взаимодействия генов АОС с другими генами-
регуляторами гомеостаза и дать оценку роли указанных взаимодействий в
этиопатогенезе изучаемых мультифакториальных заболеваний.
-
Исследовать и смоделировать с помощью биоинформатических подходов взаимодействия генов ферментов антиоксидантной системы с известными кандидатными генами рассматриваемых заболеваний и оценить роль генной сети редокс-гомеостаза в формировании генетической компоненты подверженности отдельным клинико-патогенетическим вариантам изучаемых мультифакториальных заболеваний.
-
Провести анализ величин неравновесия по сцеплению и гаметических корреляций между полиморфными вариантами генов ферментов антиоксидантной системы в норме и при каждом из изучаемых мультифакториальных заболеваний.
Научная новизна исследования
Впервые в рамках одного исследования был осуществлен комплексный молекулярно-генетический анализ полиморфизма генов ферментов антиоксидантной системы при трех патогенетически самостоятельных и распространенных мультифакториальных заболеваниях - язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, бронхиальной астмы и гипертонической болезни. Реализованный в настоящей работе комплексный подход, включающий стандартные методы генетической эпидемиологии, статистической генетики и компьютерного моделирования, позволил установить новые генетические маркеры предрасположенности к различным клинико-патогенетическим вариантам изучаемых МФЗ - 10 новых кандидатных генов (12 ДНК-маркеров) бронхиальной астмы, 8 новых кандидатных генов гипертонической болезни и 8 новых
кандидатных генов (9 ДНК-маркеров) язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки. Эффективность использованного в работе подхода позволила сформировать новое направление исследований в медицинской генетике, связанное с комплексной оценкой вовлеченности генов ферментов антиоксидантной системы в формировании предрасположенности к патогенетически различным мультифакториальным заболеваниям человека. Получены новые данные о вовлеченности полиморфных генов ферментов АОС в формирование предрасположенности к патогенетически различным мультифакториальным заболеваниям и описаны конкретные молекулярные механизмы, посредством которых данные гены сопряжены с патогенезом каждой из изученных болезней. Впервые была установлена модифицирующая роль генов ферментов АОС в детерминации возраста манифестации мультифакториальных заболеваний и выявлен выраженный половой диморфизм во взаимосвязях генов АОС с риском развития изучаемых МФЗ. Впервые было установлено, что в основе формирования генетической предрасположенности к патогенетически самостоятельным нозологическим формам мультифакториальных заболеваний лежат структурно-функциональные особенности организации генной сети ферментов редокс-гомеостаза, патологические эффекты которой зависят от влияния факторов внешней среды прооксидантного и антиоксидантного действия. С использованием методов SAA и MDR впервые смоделированы взаимодействия генов ферментов прооксидантого и антиоксидантного действия, а также изучена их взаимосвязь с другими генами-регуляторами гомеостаза при различных клинико-патогенетических вариантах мультифакториальных заболеваний с учетом полового диморфизма. Основываясь на результатах многоэтапного анализа межгенных взаимодействий и стохастического моделирования, были впервые реконструированы модели генной сети редокс-гомеостаза при различных клинико-патогенетических формах изученных МФЗ и показаны существенные различия в характере их организации у мужчин и женщин.
Научно-практическая значимость исследования
Результаты выполненной работы открывают новые перспективы для более глубокого изучения молекулярно-генетических механизмов, посредством которых полиморфные гены ферментов АОС вовлечены в этиологию и патогенез не только язвенной болезни, бронхиальной астмы и гипертонической болезни, но и многих других распространенных мультифакториальных заболеваний. Для доклинической диагностики МФЗ генетическое тестирование полиморфизма генов ферментов АОС позволит не только выявить ключевые межгенные взаимодействия, формирующие предрасположенность к заболеванию, оценить возможные патогенетические механизмы его развития, но и идентифицировать спектр возможных средовых факторов, способных спровоцировать возникновение или обострение той или иной патологии. Полученные в результате генетического тестирования данные по полиморфным вариантам генов АОС могут быть применимы для определения подходов к профилактике МФЗ в отягощенных семьях в рамках медико-генетического консультирования. Сведения о полиморфизме генов антиоксидантных ферментов дают ценную информацию об особенностях функционирования системы антиоксидантной защиты в целом, и открывают широкие возможности для практического применения элементов
индивидуализированной генотип-специфической терапии и профилактики широкого спектра мультифакториальных заболеваний, посредством контроля над потенциально регулируемыми средовыми факторами риска прооксидантного и антиоксидантного действия. Результаты, полученные в ходе настоящего исследования, формируют новые представления о роли генов ферментов АОС в формировании предрасположенности к мультифакториальным заболеваниям и создают теоретическую и концептуальную основу для расширения и практического внедрения знаний об этиологии и патогенезе самого распространенного класса болезней человека в образовательный процесс, не только в рамках медицинской генетики, но и медицины, в целом. В частности, результаты исследования могут быть использованы при чтении специальных курсов по медицинской и клинической генетике, биохимии, патофизиологии, внутренним болезням в вузах медицинского и медико-биологического профиля, а также на курсах повышения квалификации медицинских работников.
Положения, выносимые на защиту
-
Гены ферментов антиоксидантной системы вовлечены в формирование предрасположенности к патогенетически различным мультифакториальным заболеваниям, а генетическая основа их развития характеризуется значительной аллельной и локусной гетерогенностью, проявляющейся на фенотипическом уровне выраженным половым диморфизмом предрасположенности к болезням и варьирующим возрастом их манифеста.
-
Отклонения частот аллелей и генотипов ферментов АОС при мультифакториальных заболеваниях, не смотря на свою специфичность при каждом виде патологии, характеризуются преимущественным накоплением среди больных функционально активных аллелей генов ферментов прооксидантного действия, в сочетании с функционально неполноценными аллельными вариантами генов ферментов антиоксидантного действия, тем самым, формируя генетическую основу для нарушений эндогенного баланса между прооксидантами и антиоксидантами, которая, в свою очередь, может способствовать смещению редокс-гомеостаза в сторону усиления СРО, формирования окислительного стресса и оксидативного повреждения органов и тканей.
-
Патологические эффекты генотипов полиморфных генов ферментов АОС в отношении риска возникновения МФЗ проявляются в зависимости от прооксидантного и антиоксидантного влияния факторов внешней среды. При прооксидантном действии среды генотипы ферментов АОС, по-видимому, потенцируют их негативное влияние на органы и ткани посредством усиления СРО, увеличивая риск развития болезней, тогда как, в условиях антиоксидантного действия среды генотипы ферментов АОС могут не проявляться патологическими изменениями фенотипа или даже обладать защитными свойствами в отношении риска развития той или иной патологии.
-
Генетическую основу для формирования различных клинико-патогенетических вариантов мультифакториальных заболеваний составляют тесные и специфичные взаимодействия между генами ферментов антиоксидантной системы и генами-регуляторами гомеостаза, большую часть которых представляют известные гены-кандидаты изученных болезней, что может свидетельствовать о тесной сопряженности в функционировании системы редокс-
гомеостаза с другими физиологическими системами, вовлеченными в молекулярные звенья патогенеза рассмотренных мультифакториальных заболеваний.
-
Гены ферментов антиоксидантной системы образуют сложную и иерархичную генную сеть редокс-гомеостаза, структурно-функциональная организация которой имеет принципиальные различия при разных видах патологии у мужчин и женщин. В структуре генной сети редокс-гомеостаза можно выделить главные гены, от взаимодействия которых в наибольшей степени зависит риск развития того или иного заболевания, а также гены-модификаторы, патологические эффекты которых не имеют самостоятельного значения для риска развития болезней и, благодаря эпистатическим взаимодействиям с главными генами, могут не иметь существенного проявления на фенотипическом уровне.
-
Между аллельными вариантами генов ферментов антиоксидантной системы обнаружены специфичные для каждого мультифакториального заболевания гаметические корреляции, свидетельствующие, с одной стороны, о разнообразии эволюционно сложившихся адаптивных вариантов гаплогрупп ферментов редокс-гомеостаза, с другой - о несовершенстве приспособительных свойств отдельных гаплогрупп, которые в условиях современной техногенной цивилизации, могут потенцировать оксидативные повреждения биоструктур и способствовать формированию стойких патологических состояний.
Апробация работы и публикации
Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на IV и V съездах Российского общества медицинских генетиков (Курск, 2000; Уфа, 2005), на 3-м съезде ВОГиС (Москва, 2004), на Международной научной конференции "Экология, окружающая среда и здоровье населения Центрального Черноземья" (Курск, 2005), на научной конференции международного общества по изучению вариабельности генома человека HGVS (Киото, Япония, 2005), на VI и VII съездах научного общества гастроэнтерологов России (Москва, 2006, 2007), на Российской конференции с международным участием "Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии" (Курск, 2006), на Всероссийской научной конференции с международным участием "Физиолого-гигиенические проблемы экологии человека" (Белгород, 2007), на VIII научной конференции «Генетика человека и патология» (Томск, 2007), на Международной (Российско-Японско-Американской) научно-практической конференции "Современные технологии и общая концепция профилактики и лечения сердечно-сосудистых заболеваний" (Хабаровск, 2007), на IV международном симпозиуме "Computational Methods in Toxicology and Pharmacology Integrating Internet Resources" (Москва 2007), на Российском национальном конгрессе кардиологов и конгрессе кардиологов стран СНГ (Москва, 2007, 2008), на научно-практической конференции "Современные проблемы клинической генетики" (Москва, 2008), на 11-м Семинаре "New trends in chemical toxicology" (Москва, 2008), на итоговых научных сессиях КГМУ и отделения медико-биологических наук Центрально-Черноземного научного центра РАМН (Курск, 2005-2009). По материалам диссертации опубликовано 45 печатных работы, в том числе 18 статей в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России для публикации результатов докторских диссертаций на
соискание ученой степени биологических наук. Диссертантом получен диплом на открытие и имеется 1 патент на изобретение.
Структура и объем диссертации
Общая характеристика ферментов антиоксидантной системы, их генетический полиморфизм и связь с предрасположенностью к мультифакториальным заболеваниям
Человеческий организм представляет собой саморегулирующуюся целостную систему, которая поддерживает постоянство своей внутренней среды, успешно сопротивляясь и приспосабливаясь к разнообразным влияниям окружающей среды. Само существование в аэробных условиях постоянно сопряжено с постоянным риском неконтролируемого образования токсичныих форм молекулярного кислорода как внутри организма вследствие "издержек" окислительного метаболизма, так и в окружающей среде, в результате негативных антропогенных воздействий современной цивилизации [Скулачев В.П., 1988, Барабой В.А., Сутковой Д.А. 1997, Kohen R.2002]. Окислительно-восстановительные процессы в организме составляют важнейшую часть любого звена метаболизма и жизненно необходимы для обеспечения энергетических потребностей человека.
Исходя из особенностей метаболизма, все разнообразие процессов, протекающих с участием кислорода, можно подразделить на несколько основных типов [Л.Д. Лукьянова, 1982]: 1) реакции окислительного фосфорилирования, протекающие в дыхательной цепи митохондрий (митохондриальное окисление) как механизм образования и запасания энергии в клетке [Шилов В.Н., 2006]; 2) реакции оксигеназного типа, связанные с электронтранспортной системой эндоплазматического ретикулума (микросомальное окисление) как механизм защиты организма от чужеродных химический соединений (биотрансформация ксенобиотиков) [Ляхович В.В., 2005, Halliwell В., M.C.Gutteridge J. 2007]; 3) оксидазные реакции, связанные с генерацией активных форм кислорода, (АФК) как механизмы антибактериальной защиты, воспаления и регуляции микроциркуляции [Halliwell В., M.C.Gutteridge J. 2007]; 4) перекисное свободно-радикальное окисление липидов мембранных структур клетки как механизм деструкции и обновления структурных компонентов клетки [Владимиров Ю. А., 1972, Артюхов В.Г. 2000]. В результате метаболических реакций, связанных с окислительной деградацией органических соединений, образуется широкий спектр АФК [Кулинский В.И., 1999], которые, при физиологических концентрациях, контролируют важнейшие биологические процессы как в органах и тканях, выполняя биоэнергоинформационную и функциональную роль в обеспечении жизнедеятельности организма [Halliwell В., M.C.Gutteridge J. 2007]. Понятие АФК объединяет широкий спектр кислородных соединений радикальной и не радикальной природы: синглетный кислород (!02), супероксидный анионный радикал (02"), пергидроксильный радикал (Н02), перекись водорода (Н202), окись азота (N0), гипохлорная кислота (НОСІ), гипогалоиды (HOJ, НОВг) алкоксильный радикал (RO), пероксидный радикал (R02), гидроксильный радикал (ОН), (LOOH, НООН), и многие другие [Владимиров Ю.А. 2000, Кулинский В.И., 1999; Halliwell В., M.C.Gutteridge J. 2007]. Высокая реакционная способность АФК и малые времена жизни накладывают ограничения на их "сферу влияния". Так радиус действия гидроксильного радикала ограничен размером средней органической молекулы, тогда как супероксидный анион-радикал обладает радиусом действия сравнимым с размером клетки. Сфера влияния NO распространяется уже на определенные клеточные линии, в частности, такие как ГМК сосудов [Halliwell В., M.C.GutteridgeJ.2007].
Синглетный кислород О , как сопутствующий продукт, образуется в реакциях ферментативной инактивации других активных форм кислорода при участии каталазы, супероксиддисмутазы и пероксидаз. Изменение спина одного из электронов, находящихся на р -орбитали в молекуле кислорода, приводит к образованию возбужденного синглетного состояния, энергия которого намного больше, чем в основном триплетном состоянии. Это определяет высокую реакционную способность 02. Показана возможность участия !02 в инициации перекисного окисления липидов, в повреждении нуклеиновых кислот, а также цитотоксическое и мутагенное действие [Ере В. 1991, Eisenberg W.C. 1992; Kehrer J.P. 1993]. Ингибиторами 02 в тканях являются фенольные антиоксиданты, такие как токоферолы и убихиноны, а также каратиноиды, аскорбиновая и мочевая кислота [Красновский А. А., 1994].
Супероксидный анион-радикал (02 ) является промежуточным продуктом многих биологических реакций таких, как окисление тиолов, флавинов, хинонов, катехоламинов и окисления ксенобиотиков. Супероксидный радикал более реакционноспособное соединение, чем молекулярный кислород. Основным источником его образования в организме являются ферментные системы: НАДФН-оксидазы фагоцитирующих клеток, ксантиноксидаза клеток эндотелия, митохондриальная цитохром с-оксидаза и микросомальные монооксигеназы [Кулинский В.И. 1999; Владимиров Ю.А. 2000]. 02" принимает участие в образовании пероксида водорода, гидроксильного, пергидроксильного радикалов и синглетного кислорода, является индуктором ПОД. Ингибиторами супероксидного анион радикала являются семейство супероксиддисмутаз, аскорбиновая кислота, церулоплазмин, система глутатиона [Владимиров Ю.А. 2000, Мазо В.К.1998; Nakazono К. et al. 1991, Hough, М. A. Et all 2004].
Генерация Ог" фагоцитами играет важную роль не только в реализации их микробицидного и цитотоксического эффекта, но и в регуляции иммунных реакций [Babior В.М., 1973]. Так, супероксидный анион-радикал участвует в наработке хемотаксических пептидов [Petrone W.F. et al. 1980, Peres H.D. 1990], индуцирует синтез интерлейкин-1 -подобного фактора [Kasama Т. et al. 1989], усиливает митогенстимулированную пролиферацию лимфоцитов [Burdon R.H. 1992]. 02 ингибирует эндотелиальный фактор релаксации сосудов [Cryglewaki R.J. et al. 1986; Lefer A.M. et al. 1991], увеличивает адгезию к эндотелию сосудов гранулоцитов [Godin С. et al. 1993], в результате чего усиливается обнаружение, поглощение и элиминация микроорганизмов клетками ретикулоэндотелиальной системы [Bulkley G.B., 1993].
Анализ ассоциации аллелей и генотипов полиморфизма генов ферментов антиоксидантной системы с развитием мультифакториальных заболеваний
Частота вариантных гомозигот СС гена GSR у больных ЯБ была выше, чем у здоровых индивидов (OR=l,72; 95%С1 1,18-2,49). Напротив, частота гетерозигот по генотипу ТС гена GSR в группе больных ЯБ была ниже, чем в контроле, но данные различия не достигали уровня статистической значимости (р=0,06). Кроме того, частота генотипа 640АА гена CYBA была выше среди больных ЯБ, чем среди здоровых индивидов (011=0,58; 95%CI 0,38-0,88). Статистически значимых различий в частотах генотипов других полиморфных вариантов генов АОС между группой здоровых индивидов и общей группой больных язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки не установлено. В таблице 17 представлены частоты генотипов ферментов АОС в группах больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки и здоровых индивидов. Так, частота гомозигот СС гена GSR была выше у больных ЯБДПК, чем у здоровых индивидов (OR=l,66; 95%С11,12-2,47), тогда как частота гетерозигот
Вариантные гомозиготные генотипы представлены в нижних ячейкахсоответствующих ДНК-маркеров.2 уровни значимости р различий частот генотипов между группами ( р 0,05 df=l)
ТС, напротив, была ниже в группе больных, чем в контроле (OR=0,68; 95%С10,46-0,98). Несмотря на явные различия в частоте гетерозиготного генотипа +2650ТС гена GPX4 между группами больных ЯБДГЖ и здоровых индивидов, они не достигали уровня статистической значимости (р=0,10). Частота генотипа 640АА гена CYBA была выше в группе больных ЯБДПК, чем в контроле (OR=0,57; 95%С1 0,37-0,89). В таблице 18 представлены частоты генотипов ферментов АОС в группах больных ЯБЖ и здоровых индивидов. Таблица 18 Распределение частот генотипов полиморфных вариантов генов АОС у больных язвенной болезнью желудка и здоровых индивидов
Вариантные гомозиготные генотипы представлены в нижних ячейкахсоответствующих ДНК-маркеров.2 уровни значимости р различий частот генотипов между группами ( р 0,05 df=l)
Также как и при ЯБДПК, у больных ЯБЖ гомозиготный генотип СС гена GSR ассоциировался с повышенным риском заболевания (OR=l,67; 95%С1 1,08-2,59). Кроме того, было установлено, что частота генотипа 640АА гена CYBA у больных ЯБЖ была выше, чем в контрольной группе (OR. 0,59; 95%С10,36-0,96).
В таблице 19 представлены результаты сравнительного анализа частот генотипов ферментов АОС между группами больных бронхиальной астмой и здоровых индивидов. Как видно из представленных в таблице 19 данных, предрасположенность к БА ассоциировалась с 6 генотипами 5 генов ферментов АОС. В частности, частота гомозиготного генотипа по аллелю дикого типа -21АА гена CAT была почти в 2 раза выше среди больных БА, чем среди здоровых индивидов (0 0,42; 95%С1 0,23-0,76). Частоты вариантных гомозиготных генотипов -588ТТ и -23ТТ промоторной области гена GCLMбыли ниже у больных БА, чем у здоровых индивидов (OR=0,16; 95%С10,05-0,57). Генотип 187SS гена Таблица 19 Распределение частот генотипов полиморфных вариантов генов АОС в общей выборке больных бронхиальной астмой и здоровых индивидов Ген Полиморфизм Генотипы1 Частоты генотипов Р2
Вариантные гомозиготные генотипы представлены в нижних ячейкахсоответствующих ДНК-маркеров.2 уровни значимости р различий частот генотипов между группами ( р 0,05 df=l) NQOl ассоциировался с повышенным риском развития БА (OR=4,53; 95%CI 1,27-16,12). Напротив, 640AG гена CYBA ассоциировался с пониженным риском развития болезни (OR=0,68; 95%С1 0,46-0,99). Частота гомозиготного генотипа -463 GG гена МРО была выше у больных Б А, чем у здоровых индивидов (OR=0,66; 95%С1 0,44-0,99). Статистически значимых различий в частотах генотипов других полиморфных вариантов генов АОС между группой здоровых индивидов и общей группой больных бронхиальной астмой не установлено.
В таблице 20 представлены результаты сравнительного анализа частот генотипов ферментов АОС между группами больных аллергической формой бронхиальной астмы и здоровых индивидов. Как видно из таблицы 20, гетерозиготный генотип 198PL гена GPX1 ассоциировался с повышенным риском развития аБА (OR=l,54; 95%С1 1,01-2,33). Частота генотипа дикого типа 198РР гена GPX1 была ниже в группе больных аБА, чем в контрольной группе вариантные гомозиготные генотипы представлены в нижних ячейках соответствующих ДНК-маркеров. уровни значимости р различий частот генотипов между группами ( р 0,05 df=l) была ниже у больных тГБ в сравнении с контролем (OR=0,31; 95%С1 0,11-0,87). Генотип 242СС был несколько понижен у больных постоянной АГ в сравнении с контролем (р=0,08). Явная тенденция в ассоциации генотипа -463 GA гена МРО наблюдалась с риском развития транзиторной формы ГБ (р=0,07). Частоты гетерозиготных генотипов -588СТ и -23GT гена GCLM были ниже у больных постоянной ГБ, чем у здоровых индивидов (OR=0,19; 95%С1 0,03-1,00). У больных постоянной формой артериальной гипертензии также наблюдалась тенденция (р=0,07) в ассоциации генотипа 139RW гена NQ01 с предрасположенностью к данной форме болезни (OR=3,19; 95%С1 1,08-9,39). Незначительная тенденция в увеличении частоты гомозигот +265 ОТТ гена GPX4 установлена у больных постоянной формой АГ в сравнении с контрольной группой.
Роль генов ферментов антиоксидантной системы в возрастной манифестации мультифакториальных заболеваний
У женщин (таблица 52) были установлены статистически значимые ассоциации 80 парных сочетаний генотипов с предрасположенностью к аБА. Основные полиморфные гены, показавшие ассоциации с развитием аБА у женщин, были следующие: GPX1 P198L, GPX2 G173V, GPX3 G/A, GPX4 +26501 С, GSR Т/С, SOD3 А40Т, CAT-21А Т, CAT -2620Т, GCLM -5880Т, NQOl P187S, CYBA 2420Т, CYBA 640A G, МРО -463G A, TXNRD1 C/G, FM03 E158K, TNFA -308G/A, IL1B -511 C/T, IL3 S27P, IL3-15C/T, IL5 C-703T, IL5RB G1972A, IL13 -1111 С/Т и CC16 A38G. Как видно из таблицы 52 у женщин к комбинациям генотипов, которые существенно увеличивали риск развития аБА можно отнести практически все обнаруженные межгенные парные сочетания генотипов.
В таблице 53 суммированы ассоциации парных межгенных комбинаций генотипов генов с предрасположенностью к неаллергической бронхиальной астме у мужчин. Как видно из таблицы 53, всего было установлено 44 статистически значимых ассоциации парных сочетаний генотипов с предрасположенностью к нБА у мужчин. Основными полиморфными генами, показавшие ассоциации с развитием заболевания, были следующие: GSR Т/С, CAT-21А Т, GCLM-5880Т,
В таблице 57 суммированы ассоциации парных межгенных комбинаций генотипов генов с предрасположенностью к постоянной форме гипертонической болезни у мужчин. Как видно из таблицы 57, установлены статистически значимые ассоциации только 7 парных сочетаний генотипов с предрасположенностью к пГБ у мужчин. Наиболее патогенетически значимыми для развития пГБ у мужчин были взаимодействия полиморфных генов GPX3 G/A, GPX4 +2650Т С, SOD3 А40Т, CAT -21А Т, CYBA 640A G, CYBA -930A G, FM03 E158K, AGT T174M, MLR A4582C, ACE I/D, NOS3 E298D и NOS3-7&6T/C. Практически все обнаруженные ассоциации, увеличивающие риск развития пГБ у мужчин, характеризовались высокой статистической мощностью. В таблице 58 суммированы 74 статистически значимые ассоциации парных межгенных комбинаций генотипов генов с предрасположенностью к постоянной форме гипертонической болезни у женщин. Основные полиморфные гены, показавшие ассоциации с развитием заболевания, были следующие: GPX1 P198L, GPX2 G173V, GPX3 G/A, GPX4 +2650Т С, GSR Т/С, SOD2 A16V, SOD3 А40Т, CAT -21А Т, CAT -2620Т, GCLM -5880Т, NQOl P187S, NQOl R139W, CYBA 2420T, CYBA 640A G, MPO -463G A, PRDX1 С/А и FM03 E158K.
Таким образом, сравнительный анализ позволил выявить большое число ассоциаций парных сочетаний генотипов исследуемых генов с развитием патогенетически различных мультифакториальных заболеваний.
Set-Association Анализ межгенных взаимодействий представляет собой наиболее важный этап в изучении генетических основ мультифакториальных заболеваний. Сложность оценки взаимодействия между большим числом полиморфных генов заключается, во-первых, в потребности сбора больших выборок (сотни, тысячи индивидов), во-вторых, в низкой статистической мощности исследований, связанной с большим числом межгрупповых сравнений, порождающих появление ошибок 1 типа - статистических флюктуации [Longmate J.А., 2001; Hirschhorn J.N. et al., 2002; Carlson C.S. et al., 2004]. Одним из традиционных подходов, использующихся для оценки межгенных взаимодействий при МФЗ, является метод логистической регрессии [Moore J.H., Williams S.M., 2002]. Однако, логистическая регрессия [Hosmer D.W., Lemeshow S., 2000], как большинство методов параметрической статистики, имеет ограниченные возможности в одновременном анализе большого числа переменных, вследствие прогрессивного увеличения количества рассчитываемых параметров, снижающих уровень статистической значимости [Peduzzi P. et al, 1996; Concato J. et al, 1996]. Решение проблемы включения множества ДНК-маркеров в статистические модели было достигнуто в результате разработки целого спектра прикладных методов биоинформатики, таких как: метод комбинаторного разделения переменных (Combinatorial Partitioning method) [Nelson M.R. et al, 2001], метод отбора суммарных статистик (Set-Association method) [Wille A. et al, 2003] и метод снижения направленности множества переменных (Multifactor Dimensionality Reduction method) [Ritchie M.D. et al., 2003; Lou X.Y.et al., 2007]. Указанные статистические методы позволяют даже на небольших выборках больных и здоровых индивидов одновременно анализировать множество полиморфных генов, выбирать наиболее "патогенетически важные" для развития болезни комбинации ДНК-маркеров и рассчитывать эмпирический уровень значимости их взаимодействия процедурой Монте-Карло (компьютерная симуляция большого числа выборок) [Manly B.J.F., 1998]. В рамках настоящего,.исследования для моделирования взаимодействия генов были использованы два наиболее популярных в генетической эпидемиологии подхода - Set-Association [Hoh J. et al, 2000, 2001; Hoh J. and Ott J., 2003; Kim S. et al., 2003] и Multifactor Dimensionality Reduction [Moore J.H. et al., 2002; Ritchie M.D. et al., 2003; Hahn L.W. et al, 2003; Moore J.H., 2004; Moore J.H. et al., 2006; Lou X.Y.et al., 2007].
На первом этапе анализа проводился поиск межгенных взаимодействий при различных клинико-патогенетических вариантах МФЗ методом Set-Association. Учитывая обнаруженный нами половой диморфизм ассоциаций, все этапы моделирования межгенных взаимодействий проводились раздельно у мужчин и женщин.. Для анализа межгенных взаимодействий и селекции "патогенетически важных" генов предрасположенности к язвенной болезни использовался набор из 43 полиморфных генов, включающих 19 маркеров генов АОС и дополнительно 13 маркеров генов АОС, вовлеченных в метаболизм ксенобиотиков, а также 11 маркеров кандидатных генов ЯБДПК и ЯБЖ, исследованных нами ранее [Полоников А.В., 2006]. Результаты моделирования межгенных взаимодействий при ЯБДПК у мужчин и женщин представлены на рисунках 5 и 6, соответственно.
Взаимосвязь генов ферментов антиоксидантной системы с известными кандидатными генами мультифакториальных заболеваний
Полиморфизм +2650Т С гена GPX4 показал множество ассоциаций с ЯБЖ и ЯБДПК на различных этапах анализа данных. В частности было установлено, что гетерозиготный генотип +2650ТС гена GPX4 ассоциировался с пониженным риском развития ЯБДПК и ЯБЖ у женщин. Причем ассоциация полиморфизма +2650Т С гена GPX4 имела место с поздним манифестом ЯБЖ и не была связана с возрастом начала ЯБДПК. Полиморфизм +2650Т С гена GPX4 взаимодействовал с большим числом различных генов АОС. Так, у женщин генотипы данного гена составляли более 18% от всех парных сочетаний генотипов, ассоциированных с развитием ЯБДПК и более 21% - с развитием ЯБЖ (приложение 19). Моделирование с помощью MDR метода показало, что полиморфизм +2650Т С гена GPX4 вовлечен в формирование достаточно сложных межгенных взаимодействий в системе АОС, которые детерминируют предрасположенность к ЯБЖ не зависимо от пола, а также к ЯБДПК у женщин. GPX4 in vivo участвует в биосинтезе лейкотриенов (продуктов 5-липооксигеназы) [Villette S. et al, 2002], тем самым может быть вовлечен в контроль воспалительных процессов и язвообразование в гастродуоденальной зоне. Нуклеотидная тразиция +2650Т С (718Т С), расположенная выше SECIS-элемента в З -нетранслируемой области гена GPX4, играет важную роль в инкорпорировании селеноцистеина в полипептидную цепь фермента [Villette S. et al, 2002], которая определяет конечную ферментативную активность GPX4. Villette S. С соавт. (2002) обнаружили, что носительство вариантного аллеля +2650C ассоциируется с более высокой активностью GPX4. Таким образом, протективный эффект генотипа +2650ТС гена GPX4 в отношении риска развития ЯБЖ и ЯБДПК у женщин можно объяснить тем, что данный генотип способствует повышению активности фермента, тем самым, снижая интенсивность перекисного окисления липидов и предотвращая окислительное повреждение клеточных мембран и апоптоз клеток гастродуоденальной зоны. По-видимому, посредством выше описанных механизмов данный ген вовлечен в формирование предрасположенности к язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки.
Другим генетическим маркером, ассоциированным с риском развития язвенной болезни, был полиморфизм Т/С гена GSR. Общая подверженность язвенной болезни ассоциировалась с носительством вариантного аллеля С гена GSR. Указанная ассоциация сохранялась и при раздельном анализе ЯБДПК и ЯБЖ. При анализе генотипов было установлено, что предрасположенность, как к ЯБДПК, так и к ЯБЖ, была связана с носительством вариантного гомозиготного генотипа СС гена GSR, который увеличивал риска развития указанных клинико-патогенетических вариантов болезни. Раздельный анализ по полу показал, что гомозиготный вариантный генотип СС гена GSR ассоциировался с повышенным риском развития ЯБДПК и ЯБЖ у женщин. Полиморфизм Т/С гена GSR ассоциировался с ранним (до 30 лет) манифестом ЯБДПК, тогда как возраст манифеста ЯБЖ не зависел от генотипов данного полиморфизма. Рецессивная модель установлена в отношении фенотипических эффектов аллелей полиморфизма Т/С гена GSR при ЯБЖ и ЯБДПК у женщин. Гетерозиготный генотип ТС гена GSR у лиц с повышенным потреблением растительной пищи (антиоксидантное действие) обладал защитным эффектом в отношении риска развития ЯБДПК, тогда как у лиц с низким потребление растительной пищи протективная значимость генотипа не наблюдалась. Повышенный риск развития ЯБЖ наблюдался у курильщиков носителей вариантного гомозиготного генотипа СС гена GSR, тогда как у некурящих индивидов данный генотип был нейтрален в отношении риска развития указанной формы болезни. Интересной и
253 необъяснимой находкой был тот факт, что у некурящих индивидов генотип СС увеличивал риск развития ЯБДПК, тогда как у курильщиков данный генотип не был ассоциирован с риском данной формы болезни. Иная ассоциация наблюдалась в отношение генотипа СТ гена GSR, который обладал протективными свойствами в отношении риска развития ЯБДПК только у некурящих индивидов. Генотипы полиморфизма С/Т гена GSR составляли 8% от всех парных сочетаний генотипов, ассоциированных с развитием ЯБДПК у мужчин, 11% - с развитием ЯБДПК у женщин, 6% - с развитием ЯБЖ у мужчин и почти 10% - с развитием ЯБЖ у женщин (приложение 19). Моделирование с помощью MDR метода показало, что полиморфизм, G/A гена GSR формирует комплексные взаимодействия с различными генами системы АОС, детерминирующие предрасположенность как к ЯБДПК (у мужчин и женщин), так и к ЯБЖ (только у женщин). Глутатионредуктаза - фермент, осуществляющий восстановление глутатиона путем образования его дисульфидной формы, поддерживая его концентрацию на достаточно высоком уровне [Halliwell В.and Gutteridge J.M.C., 2007]. В меньшей степени GSR определяется в органах желудочно-кишечного тракта. Активность GSR зависит от концентрации витамина рибофлавина, который, видимо, выступает в качестве кофактора активного центра фермента [Staal G.E.J, et al., 1969]. Применительно к патогенезу ЯБЖ и ЯБДПК, следует отметить, что на основании выявленных взаимодействий генотип-среда и анализа генетических моделей фенотипических эффектов данного полиморфизма, можно предположить, что вариантный генотип СС, по-видимому, связан с пониженной активностью GSR. В этой связи, генотип СС гена GSR может способствовать истощению запасов восстановленного глутатиона и ослаблению антиоксидантных защитных резервов, что, в конечном счете, может приводить к увеличению чувствительности клеток к действию прооксидантов внешней среды, индуцирующих окислительный стресс в клетках гастродуоденальной зоны.
Другими генетическими маркерами, ассоциированными с предрасположенностью к ЯБДПК и ЯБЖ, были полиморфные варианты 640A G и 242С Т гена CYBA. Было установлено, что общая подверженность язвенной болезни ассоциировалась с носительством аллеля дикого типа 640А гена CYBA. Указанная ассоциация сохранялась и при раздельном анализе ЯБДПК и ЯБЖ. При анализе генотипов было выявлено, что предрасположенность, как к ЯБДПК, так и к ЯБЖ, связана с носительством гомозиготного генотипа дикого типа 640АА гена CYBA. Причем данный полиморфизм гена CYBA ассоциировался с ранним манифестом как ЯБДПК, так и ЯБЖ. Раздельный анализ ассоциации у представителей различного пола показал, что носительство генотипа 640АА гена CYBA связано с развитием у женщин ЯБДПК, а у мужчин, напротив, с ЯБЖ. Примечательно, что данный генотип характеризовался протективными свойствами в отношении риска развития ЯБДПК у некурящих индивидов, тогда как у курильщиков "протективность" генотипа не наблюдалась. В то же самое время, носители гомозиготного вариантного генотипа 640GG гена CYBA характеризовалось пониженным риском развития, как ЯБДПК, так и ЯБЖ, но исключительно для индивидов с повышенным потреблением растительной пищи. Генотипы полиморфизма 640A G гена CYBA составляли почти 8% от всех парных сочетаний генотипов, ассоциированных с развитием ЯБДПК у мужчин, почти 10% - с развитием ЯБДПК у женщин, 10% - с развитием ЯБЖ у мужчин и почти 6% с развитием ЯБЖ у женщин (приложение 19). Генотипы полиморфизма 242С Т гена CYBA составляли 11% от всех парных сочетаний генотипов, ассоциированных с развитием ЯБДПК у мужчин, 5% - с развитием ЯБЖ у мужчин и 6% с развитием ЯБЖ у женщин (приложение 19). У мужчин, как при ЯБДПК, так и при ЯБЖ, методом MDR были установлены ключевые межгенные взаимодействия полиморфизмов 640A G и 242С Т гена CYBA с другими генами ферментов АОС, формирующими предрасположенность к заболеванию. Хотя и в доступной литературе отсутствуют функциональные исследования по анализу экспрессионного профиля гена CYBA в зависимости от наличия аллельных вариантов полиморфизма 640A G, существуют предположения, что данная нуклеотидная замена играет важную роль в регуляции транскрипционной активности гена [Moreno M.U. et al,2003; Gardemann A. et al, 1999]. По-видимому, наличие вариантного аллеля 640G связано с недостаточной активностью или экспрессией гена НАДФН оксидазы, которая фенотипически может проявляться меньшей выработкой супероксидного аниона и, таким образом, демонстрировать "антиоксидантний эффект" мутации 640A G. Таким образом, носители "высоко активных" генотипов НАДФН оксидазы будут увеличивать риск развития язвенной болезни посредством увеличения генерации супероксидных анионов и усиления проявлений окислительного стресса, который, согласно современным представлениям является одним из ключевых механизмов язвообразования в гастродуоденальной зоне [ПодопригороваВ.Г.,2004].
