Введение к работе
Актуальность проблемы. Многие гены характеризуются этноспецифическими особенностями распределения вариантов аллелей и генотипов по некоторым из полиморфных сайтов в их структуре [Chang et al., 1996; Yudin et al., 1998; Merryweather-Clarke et al., 2000]. Этноспецифическая вариабельность генов может являться следствием совокупного вклада ряда факторов: эффекта основателя, селекции, ассимиляции, случайного дрейфа генов и т.д. Считается, что изменение внешних условий среды оказывает влияние на изменчивость геномов половых клеток отдельных людей и, следовательно, на генофонд популяции человека в целом. Различают следующие векторные составляющие, которые могут определять характер и степень изменчивости в генофонде: 1. появление новых мутаций в геномах половых клеток индивидов, приводящее, потенциально, к увеличению гетерогенности генетического материала в генофонде; 2. индивидуальная восприимчивость к воздействию внешнего фактора на организм человека из-за существующей вариабельности структуры ДНК и, как следствие, возможности возникновения патологий в репродуктивном периоде жизни, сокращение потомства, ведущее к уменьшению степени гетерогенности в структуре генофондов. Оценка вклада отдельных генов в формирование индивидуальной чувствительности организма к неблагоприятному фактору среды - задача достаточно сложная, решение ее в существенной мере определяется соответствием внешнему фактору выбранного для анализа гена-кандидата. Не менее сложным может оказаться поиск информативных локусов в выбранном гене. В исследованиях по анализу ассоциаций между полиморфными сайтами и заболеваниями пока преимущественно используют нуклеотидные полиморфизмы, приводящие к несинонимичным заменам аминокислот в белке [Cardill et al., 1999; Gard et al., 1999], но такие полиморфизмы редки. В последнее время к ассоциативному анализу привлекают дополнительно полиморфизмы в составе цис-элементов в регуляторных областях генов [Artida et al., 1998; Horikawa et al., 2000]. Однако, сведения о таких полиморфизмах фрагментарны. Для решения задач практического значения учитывают и то, что частоты редких (мутантных) вариантов аллелей могут быть столь малы, что не позволят рассматривать их в качестве информативных и пригодных на уровне популяций маркеров. Молекулярно-эпидемиологические исследования относительно генетических последствий от облучения в популяции человека, немногочисленны [Шевченко и др., 1994; Коненков и др., 1995; Dubrova et al., 1998; Hayashi et al., 1997].
В настоящей работе для эколого-генетических исследований в качестве гена-кандидата был взят ген рецептора макрофаг-колониестимулирующего фактора {c-fins). Ген c-fins характеризуется разносторонним плейотропным влиянием на важнейшие физиологические и патологические функции в организме человека [Sapi et al., 1999]. Пара белков MCSF/FMS является ключевым звеном, определяющим дифференцировку, пролиферацию и выживаемость клеток моноцит/макрофагального ряда и, таким образом, вовлекается в формирование системы неспецифического иммунитета [Sherr, 1990]. Через участие в дифференцировке остеокластов MCSF/FMS белки влияют
j 1 РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ
| БИБЛИОТЕКА
СПетер^рг //
на остеогенез [Grey et al., 2000]. Функционирование второго, трофобласт-специфического промотора в гене c-fins определяет участие FMS во внутриутробном развитии эмбрионов [Pollard et al., 1997; Suzuki et al., 1999]. Важно и то, что миелоидный росток костного мозга - источника стволовых гематопоэтических клеток, и репродуктивные органы женщин, где экспрессируется ген, являются одними из наиболее уязвимых тканей при облучении.
В работе впервые была предпринята попытка оценить изменение в характере распределения вариантов аллелей и генотипов по двум полиморфным сайтам на примере выбранного нами гена-кандидата (c-fins) в популяциях человека, проживающих в условиях экологического загрязнения по сравнению с популяционным контролем. В связи с тем, что выбранные полиморфные сайты расположены в некодирующих областях гена, был осуществлен контекстный анализ последовательностей нукпеотидов в районах их локализации для выяснения возможного вклада полиморфизмов в функционирование гена c-fins. Дополнительно, был проведен анализ ассоциаций исследуемых полиморфизмов гена с рядом патологий и некоторыми фенотипическими признаками, в формировании которых теоретически мог бы участвовать c-fins, для оценки их генетической информативности.
Цель и задачи исследования.
Целью настоящей работы являлось выяснение перспективности гена рецептора макрофаг-колониестимулирующего фактора (c-fins) в качестве генетического маркера воздействия неблагоприятных факторов среды на популяцию человека. Достижение цели настоящего исследования осуществляли решением задач:
1. Выбора локуса гена для изучения его структурной вариабельности, исходя из
данных строения c-fins и особенностей функционирования рецептора FMS в
различных клеточных ситуациях, с целью выявления наиболее перспективных
для популяционных исследований генетических маркеров и их
экспериментальная идентификация.
-
Изучения характера распределения вариантов аллелей и генотипов по динуклеотидному полиморфному сайту в З'-нетранслируемой области (3'UTR ТС—>СА) и делеционному полиморфизму в 11-м интроне (del425) гена c-fins среди некоторых европейских (русские, немцы) и монголоидных этнических групп, а именно: арктических монголоидов (чукчи — прибрежные и тундровые, канадские эскимосы) и центрально-азиатских популяций (казахи,, алтайцы, тувинцы).
-
Исследования особенностей распределения гаплотипов по полиморфным сайтам 3'UTR и del425 гена -. c-fins в этнических группах арктических монголоидов (канадские эскимосы, прибрежные и тундровые чукчи), центрально-азиатских популяций (тувинцы, алтайцы, казахи) и европейцев (русские, немцы).
-
Выяснения контекстным анализом особенностей структуры ДНК в местах расположения полиморфных сайтов, 3'UTR ТС—>СА и del42S, в отношении
наличия потенциальных регуляторних элементов для прогнозирования возможной функциональной значимости этих районов в регуляции экспрессии гена c-fins.
5. Определения возможных ассоциаций между полиморфизмами 3'UTR
ТС-+СА, del425 и некоторыми заболеваниями тех органов человека, в клетках
которых в норме или патологии экспрессируется ген c-fins, для косвенной
оценки информативности данных полиморфизмов.
6. Установления возможных изменений в характере распределения вариантов
аллелей и генотипов по полиморфизмам 3'UTR ТС—>СА и del425 в структуре
генофондов популяций человека из экологически неблагоприятных регионов
страны: Рубцовского района Алтайского края (немцы) и Урала (облученное
русское население, проживающее вдоль р. Теча), по сравнению с таковыми
контрольных популяций человека (из Немецкого района Алтайского края и г.
Новосибирска соответственно).
Научная новизна.. Открыты два новых полиморфных сайта гена рецептора макрофаі^колониестимулирующего фактора (один - в 21 интроне G34047A, другой в виде измененного динуклеотида - в 3'-нетрансяируемой области гена на расстоянии 34 н.п. от стоп-кодона трансляции, в позициях 34293 и 34294: ТС—»СА). Установлены особенности распределения вариантов аллелей, генотипов и гаплотипов по полиморфизмам 3'UTR и del425 гена c-fins в некоторых европейских и монголоидных этнических группах России и канадских эскимосов: показаны расовые и этноспецифические различия в характере распределения редких вариантов аллелей и гаплотипов по двум изучаемым полиморфизмам гена c-fins у части исследованных в работе популяций человека. Контекстным анализом структуры протяженных участков ДНК в районах нахождения полиморфизмов показана их потенциальная генетическая информативность: 3'UTR ТС—»СА динуклеотид примыкает к 5'-концу известного цис-злемента - САААСТТС -, вовлеченного в посттранскрипционные события созревания мРНК; присутствующие в делегированном фрагменте ДНК сигнальные мотивы (CArG, ets, Е- и N-боксы и т.д.) потенциально способны модулировать лиганд (М-СБР)-зависимую транскрипцию гена c-fins, кодирующего его рецептор (FMS). Обнаружены ассоциации 3'UTR ТС—>СА и del425 полиморфизмов с некоторыми-заболеваниями органов, в клетках которых показана экспрессия гена c-fins в норме или патологии, что является косвенным указанием на информативность исследуемых полиморфизмов в качестве генетических маркеров. Впервые, на примере гена c-fins, специально выбранного для изучения генетических последствий от воздействия неблагоприятных факторов среды (радиация), выявлены достоверно значимые изменения в распределении вариантов аллелей и генотипов по 3'UTR и del425 полиморфизмам этого гена в выборках людей из экологически неблагоприятных районов страны по сравнению с популяционным контролем (эксперименты проведены по типу "случай-контроль").
Практическая ценность. Установление информативности полиморфизмов 3'UTR и del425 гена c-fins, выбранного для изучения генетических последствий
от воздействия радиации, может быть использовано в будущем для изучения изменений структуры генофондов популяций человека, проживающих в экологически неблагоприятных регионах страны. Модификация метода массового генотипирования полиморфизмов с протяженными делециями [Кузнецова и др., 2004] может быть широко использована при молекулярно-эпидемиологических исследованиях генетического разнообразия по другим генам со сходными по структуре полиморфизмами.
Положения, выносимые на защиту.
1. Выбор полиморфизмов^ 3'UTR и del425 гена c-fins, участвующего в
формировании многих фенотипических признаков в организме человека, в
качестве генетических маркеров оценки в генофондах популяций изменений от
воздействия неблагоприятных внешних факторов среды (радиации).
2. Обнаружение новых полиморфизмов в гене c-fins: одного в 21 интроне в
позиции 34047 G-+A и другого, в виде динуклеотида - в З'-нетранслируемой
области гена на расстоянии 34 н.п. от стоп-кодона трансляции, в позициях
34293 и 34294: ТС-+СА.
-
Установление расовых или этноспецифических различий в распределении вариантов аллелей и генотипов по двум (3'UTR, deI425) полиморфизмам гена с-fins в некоторых из исследованных этнических групп России.
-
Определение потенциальной функциональной значимости изучаемых в работе 3'UTR и del425 полиморфизмов гена c-fins на основании данных контекстного анализа структуры протяженных, участков ДНК .в местах их локализации: возможное участие 3'UTR ТС—»СА полиморфизма в составе сигнального мотива -(ТС/СА)САААСТТС- в посттранскрипционных событиях созревания mPHK.FMS и вовлечение делегируемого фрагмента ДНК в 11-м интроне, размером 425 н.п. (deI425) в M-CSF-зависимую транскрипцию гена c-fins.
-
Выявление ассоциаций 3'UTR и deI425 полиморфизмов гена c-fins с некоторыми заболеваниями тех органов, в клетках которых экспрессируется с-fins в норме или патологии, как косвенное указание на генетическую информативность изучаемых сайтов.
-
Обнаружение изменений в распределении вариантов аллелей и генотипов по 3'UTR и del425 полиморфизмам гена c-fins в выборках человека из экологически неблагоприятных регионов (Рубцовский район Алтайского края, облученное русское население Урала, проживающее вдоль реки Теча) по сравнению с контрольными популяциями (Немецкого района Алтайского края и г. Новосибирска соответственно) в экспериментах, проведенных в дизайне "случай-контроль".
Апробация работы/ Материалы исследования были доложены, представлены стендовыми докладами или тезисами докладов на: международном симпозиуме по молекулярной и клеточной биологии - Кенстоун, США, 1998; на Западно-Сибирском терапевтическом форуме - Тюмень, 2000; на 2-м съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров "Отдаленные последствия,
мутагенез, канцерогенез: закономерности, механизмы." - Санкт-Петербург, 2000; международной конференции "Биоразнообразие и динамика экосистем в Северной Евразии" - Новосибирск, 2001; на IV съезде по радиационным исследованиям - Москва, 2001; международной конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация", г. Пушино, 2003 г.
Публикации: По теме диссертации опубликовано 9 работ (из них две в рецензируемой печати).
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 138 страницах машинописного текста и состоит из разделов: Введение, Обзор литературы, Материалы и Методы, Результаты и их обсуждение, Заключение и Выводы. Данные проиллюстрированы 22 таблицами и 14 рисунками. Библиографический указатель включает 338 источников.
