Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.1. основные принципы структурной организации лейкоцитарных рецепторов 9
1.1.1. Структура ИГ-домена 11
1.1.2. Прикрепление лейкоцитарных поверхностных молекул к клеточной мембране 13
1.1.3. Гликозилирование лейкоцитарных рецепторов 16
1.1.4. Сигнальные мотивы в цитоплазматических районах лейкоцитарных рецепторов 16
1.1.4.1. Активирующие IT AM мотивы 17
1.1.4.2. Ингибирующие ITIM мотивы 20
1.1.4.3. Дуализм среди IT AM- и ГПМ-содержащих рецепторов 21
1.2. Fc-рецепторы млекопитающих 22
1.2.1. Лейкоцитарные Fc-рецепторы человека и мыши 23
1.2.2. Лиганд-специфичность, аффинность связывания ИГ FcR 28
1.2.3. Структура рецепторных комплексов лейкоцитарных FcR человека, сигнальные субъединицы 31
1.2.4. Активация и инактивация клеток Fc-рецепторными комплексами человека 32
1.3. Эволюция семейства лейкоцитарных FcR 37
2. Материалы и методы 40
2.1. Материалы и реактивы 40
2.2. Биологический материал 40
2.3. кДНК и кДНК библиотеки 41
2.4. Нуклеотидные последовательности кДНК 41
2.5. Выделение и очистка нуклеиновых кислот 42
2.5.1. Выделение ДНК 42
2.5.2. Выделение суммарной РНК из эукариотических клеток 43
2.6. Методы, используемые для клонирования ДНК-фрагментов 44
2.6.1. Основные методы клонирования ДНК 44
2.6.2. Химическая трансформация Е. coli 44
2.6.3. Электротрансформация 45
2.7. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и олигонуклеотиды 45
2.8. Определение нуклеотидной последовательности 48
2.9. Скрининг кДНКовой библиотеки ДНК-зондами 49
2.10. Эксцизия in vivo плазмидной ДНК из фагового вектора 50
2.11. Саузерн блот-гибридизация ДНК 50
2.12. Компьютерный анализ последовательностей 51
2.13. Построение филогенетических деревьев 52
3. Результаты и обсуждение 53
3.1. Идентификация и структурный анализ FcR-подобных кДНК человека и мыши ; 53
3.1.1. Определение нуклеотидных последовательностей и структурный анализ FCRL1 кДНК человека и мыши 53
3.1.2. Саузерн блот-анализ геномной ДНК человека и мыши с использованием FCRLl-специфичных зондов 54
3.1.3. Определение нуклеотидных последовательностей и структурный анализ IFGP кДНК человека и мыши 54
3.1.4. Саузерн блот-анализ геномной ДНК человека и мыши с использованием IFGP-специфичных зондов 57
3.1.5. Получение полных кДНК IFGP1,2 и 3 и FCRL2 человека 58
3.2. Компьютерный анализ геномных последовательностей человека и мыши, предоставленных центром Сэнгера 59
3.2.1. Определение взаимного расположения FCRL и IFGP генов у человека и мыши 59
3.2.2. Определение экзон-интронной организации FCRL и IFGP генов человека и мыши 59
3.3. Сравнительный анализ первичной структуры IFGP и FCRL 64
3.3.1. Сравнительный анализ первичной структуры ИГ-доменов
IFGP и FCRL 64
3.3.2. Сравнительный анализ первичной структуры цитоплазматических районов IFGP 73
3.4. Идентификация FcR-подобных генов у Ictalums punctatus, Danio rerio и Xenopus laevis 75
3.4.1. Определение нуклеотидных последовательностей и структурный анализ FcR-подобных кДНК X. laevis (XFL) 76
3.4.2. Саузерн блот-анализ геномной ДНК X. laevis с ипользованием XFL- специфичных зондов 77
3.4.3. Поиск кДНК XFL с помощью скрининга кДНК библиотек Xenopus LG 78
3.4.4. Структурный анализ идентифицированных FcR-подобных кДНК Xenopus LG 80
3.5. Сравнительный анализ первичной структуры XFL 82
3.5.1. Сравнительный анализ первичной структуры ИГ-доменов XFL 82
3.5.2. Сравнительный анализ первичной структуры цитоплазматических районов XFL 87
Заключение 89
Выводы 93
Приложения 95
Список литературы 103
- Прикрепление лейкоцитарных поверхностных молекул к клеточной мембране
- Структура рецепторных комплексов лейкоцитарных FcR человека, сигнальные субъединицы
- Определение нуклеотидных последовательностей и структурный анализ FCRL1 кДНК человека и мыши
- Сравнительный анализ первичной структуры цитоплазматических районов IFGP
Введение к работе
Актуальность проблемы. В ходе эволюции многоклеточными организмами были выработаны различные стратегии защиты от патогенов. Бспозвоночным присущ врожденный иммунный ответ, характеризующийся относительно неспецифичными реакциями, основанными главным образом на фагоцитозе и выработке широкого спектра антибактериальных факторов. У позвоночных распознавание и элиминация чужеродных антигенов осуществляется чрезвычайно сложной системой иммунитета, включающей как неспецифичные, так и специфичные механизмы. Становление адаптивного иммунитета в процессе эволюции позвоночных является ярким примером того, как из ограниченного количества предковых генов путем дупликаций и согласованной структурно-функциональной дивергенции возникает чрезвычайно сложная генетическая система. В первую очередь это относится к генам надсемейства иммуноглобулинов (IgSF) - у млекопитающих обнаружено около тысячи генов этого надсемейства, на порядок больше, чем у беспозвоночных. Выяснение последовательности событий в процессе экспансии IgSF молекул важно для понимания фундаментальных принципов формирования и функционирования иммунной системы.
Первоочередным подходом в реконструкции эволюционной истории иммунной системы является выявление филогенетических связей между различными семействами IgSF, а также отдельными молекулами, близкие гомологи которых не были обнаружены. Объектом настоящего исследования является семейство лейкоцитарных Fc-рецепторов (FcR). Эта группа структурно родственных поверхностных белков получила свое название из-за способности связывать константные области тяжелых цепей иммуноглобулинов (Ig). Экспрессия на разных типах лейкоцитов, в том числе и на тех, которые лишены собственных антиген-распознающих рецепторов, делает FcR-семейство важным элементом объединения клеточного и гуморального иммунитета. По своим сигнальным функциям FcR разделяются на ингибирующие и активирующие рецепторы. Первый класс несет в цитоплазматических районах тирозин-основанные ингибирующие сигнальные мотивы (ITIM), второй экспрессируется на поверхности молекул в комплексе с сигнальными субъединицами, несущими тирозин-основанные активирующие мотивы (ITAM). Активирующие рецепторы ответственны за запуск эффекторных функций лейкоцитов, таких как фагоцитоз и антителозависимая цитотоксичность, ингибирующие рецепторы способны подавлять эффекторные реакции и блокировать синтез антител. До настоящего времени FcR были описаны только у млекопитающих, их структурная взаимосвязь с другими семействами IgSF и эволюционное происхождение остаются неясными. К началу настоящей работы было неизвестно также, имеются ли у млекопитающих гены, в структурном отношении родственные генам FcR.
Цели и задачи исследования. Целью данного исследования являлось изучение эволюции генов FcR у наземных позвоночных. Были поставлены две основные задачи:
1. Идентификация и структурный анализ неизвестных FcR-подобных генов у представителей млекопитающих (человека Homo sapiens и мыши Mus musculus).
2. Идентификация и структурный анализ FcR-подобных генов у представителя земноводных, африканской шпорцевой лягушки (Xenopus laevis).
Научная новизна. У человека и мыши впервые идентифицированы две группы генов, гомологичных генам FcR и названных IFGP и FCRL. У африканской шпорцевой лягушки впервые идентифицировано семейство FcR-подобных генов, названных XFL. Установлены взаимное расположение и экзон-интронная организация FcR-подобных генов у человека и мыши. Установлено, что дупликации генов в семействе происходили видоспецифичным образом и сопровождались перетасовкой экзонов, в результате которой у разных видов возникали рецепторы с разной модульной организацией.
Научно-практическая ценность. Идентификация новых генов, принадлежащих к FcR-семейству, вносит вклад в генетику и иммунологию человека, мыши и Xenopus laevis, а также в развитие представлений об эволюции иммунной системы и механизмах филогенетической экспансии IgSF.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на:
1. 11-м Международном иммунологическом конгрессе, Стокгольм, Швеция, 2001;
2. 9-м Международном ISDCI конгрессе, Ст. Андрю, Шотландия, 2003;
3. 2-м Международном симпозиуме "Эволюция жизни на Земле", Томск, 2001;
4. Конференции молодых ученых-грантодержателей биологических институтов СО РАН, Новосибирск, 2001;
5. Семинаре в Департаменте микробиологии и иммунологии Медицинского центра Университета г. Рочестер, США, 2003;
6. Отчетных сессиях аспирантов Института цитологии и генетики СО РАН в 2001, 2002.
Прикрепление лейкоцитарных поверхностных молекул к клеточной мембране
Описано несколько способов закрепления белков на клеточной поверхности. Белки I и II типа содержат по одному трансмембранному (ТМ) району, в то время как белки III и IV типа - по несколько. Белки V типа не имеют ТМ районов и для закрепления на мембране используют липидные якоря (рис. 3). Следует отметить, что в большинстве случаев экспериментально невозможно соотнести ТМ район трансмембранных рецепторов с конкретными аминокислотными остатками. Обычно границы ТМ района предсказываются на основе анализа гидрофобности аминокислотной последовательности рецептора.
Наиболее распостраненным способом интеграции в мембрану среди лейкоцитарных поверхностных белков (около 70%, Barclay et al., 1997) является І тип прикрепления с одной пронизывающей мембрану гидрофобной последовательностью. С-конец молекул I типа находится в цитоплазме, а N-конец - снаружи клетки. Исходно такие рецепторы содержат на своем N-конце сигнальную или лидерную последовательность, которая отрезается после прохождения молекулы через бислой ЭПР. Поверхностные молекулы I типа содержат ТМ последовательности размером примерно 25 аминокислотных остатков. За ТМ последовательностью обычно идет кластер положительно заряженных остатков, которые, как полагают, участвуют в связывании с фосфолипидами бислоя. Остатки Asn, Asp, Glu, Gin, His, Lys и Arg обычно не встречаются в ТМ районах. Исключением являются ТМ районы белков, входящих в состав мультимерных мембранных рецепторных комплексов. Классическим примером такого комплекса является Т-клеточный рецепторный комплекс, в котором TCR аир цепи, а также CD3 у, 5, є и С, субъединицы в своих ТМ районах содержат заряженные аминокислотные остатки. Обычно лиганд-связывающая субъединица мультимерного рецепторного комплекса содержит положительно заряженные аминокислотные остатки в ТМ районе, в то время как вспомогательные или сигнальные субъединицы - отрицательно заряженные.
Белки II типа имеют обратную ориентацию по сравнению с молекулами I типа: N-конец находится в цитоплазме и С-конец - вне клетки. Обычно они содержат небольшие цитоплазматические районы, а ТМ последовательности представляют собой неотрезанные сигнальные пептиды.
В третью категорию собраны молекулы, несколько раз пронизывающие бислой - от 2 до 12. Наиболее крупные группы образуют G белок-связанные рецепторы и молекулы ТМ4 надсемейства. Молекулы первой группы пронизывают мембрану 7 раз, второй - 4 раза. С- и N-концы молекул ТМ4 надсемейства находятся в цитоплазме, кроме того известно, что петля между третьим и четвертым ТМ районами находится вне клетки, так как является внеклеточной антигенной детерминантой. Белки IV типа отличаются от белков III типа наличием трансмембранного канала, заполненного водой.
Описано два класса белков V типа. Одни, включая поверхностные клеточные рецепторы, соединены с мембраной через гликозил-фосфадитилинозитольный (GPI) якорь. С-концевой аминокислотный остаток таких белков через фосфоэтаноламинный мостик прикрепляется к гликану ((манноза)3-глюкозамин), который, в свою очередь, связан с фосфадитилинозитолом (ФИ). Подобная структура является высококонсервативной. Межвидовые и клетка-специфичные различия могут заключаться в дополнительных боковых ветвях гликана, ацилировании. инозитольного кольца и в природе алифатических цепей ФИ. Присутствие GPI якоря можно выявить исходя из предсказанной белковой последовательности молекулы. GPI-заякоренные молекулы содержат на N-конце сигнальную последовательность для секреции, а также на С-конце сигнальную последовательность, которая отрезается и заменяется на GPI-якорь в ЭПР. Отрезаемый пептид является гидрофобным и состоит из 10-20 остатков, поэтому иногда неотличим от ТМ района. В месте гидролиза обычно распологается несколько остатков с малыми радикалами (Gly, Ala, Ser). Для GPI сигнальных последовательностей характерно отсутствие кластера положительно заряженных аминокислотных остатков на С-конце. В случае CD58 антигена существует два альтернативно сплайсируемых варианта - один с ТМ районом, а второй - с GPI якорем. После связывания с GPI заякоренные молекулы проходят пост-трансляционную модификацию в аппарате Гольджи и везикулярно транспортируются к клеточной поверхности. В случае полярных клеток большая часть GPI-заякоренных белков встречается на апикальной стороне клетки (Barclay et al., 1997; Eisenhaber et al., 1998; Ferguson and Williams, 1988; Nosjean et al., 1997).
Другие белки V типа ассоциированы с липидным бислоем через остаток миристиловой кислоты на N-конце. Наиболее часто встречаемыми являются внутриклеточные киназы Src семейства.
Отличительная черта клеточной поверхности - это присутствие углеводных структур как на белках, так и на липидах. Большинство лейкоцитарных поверхностных антигенов, в том числе и из IgSF, являются гликопротеинами (рис. 1). N-гликозилирование происходит по Asp остаткам в мотивах Asn-Xaahr или Asn-Xaa-Ser за исключением Asn-Prohr/Ser и Asn-Xaahr/Ser-Pro последовательностей, которые обычно не гликозилируются. О-гликозилирование происходит по Ser и Thr остаткам в последовательностях, богатых Ser, Thr и Pro. Уровень гликозилирования мембранных белков значительно варьирует, среди наиболее гликозилированных лейкоцитарных молекул находятся Thy-1, CD43 и CD45. Немногие мембранные белки совсем не несут углеводов, но зато такие белки (CD3s и CD81) практически всегда ассоциированы с гликопротеинами.
Одна и та же молекула может нести различные олигосахаридные структуры в зависимости от типа и стадии дифференцировки клетки, в которой она экспрессируется. Различия в гликозилировании рецепторов могут вести к функциональным отличиям как за счет маскирования белковой поверхности и скрытия сайтов связывания лиганда углеводными структурами, так и за счет взаимодействия гликопротеинов с другими молекулами через свои углеводные группы, например с лектинами, селектинами или сиалоадгезинами (Barclay et al., 1997).
Длина полипептидных цепей внутриклеточных частей ИГ-подобных рецепторов варьирует от 3 (у mlgM) до 543 аминокислотых остатков (у рецептора тромбоцитарного фактора роста). Эти части рецепторов не имеют ИГ-подобных структур. Сходство цитоплазматических участков различных рецепторов, даже при значительном сходстве внеклеточных доменов, часто является очень незначительным и сводится к сходству сигнальных элементов (мотивов, связывающих внутриклеточные сигнальные белки). Исключением являются белки, содержащие домен с киназной или фосфатазной активностью во внутриклеточной части. Специфические мотивы, ответственные за связывание киназ, фосфатаз, элементов цитоскелета, белков интернализации и т. д., как правило, включают от 4 до 15 аминокислот с некоторой степенью вырожденности.
Структура рецепторных комплексов лейкоцитарных FcR человека, сигнальные субъединицы
Подобный эффект наблюдается и у человека. FcyRIb2 изоформа человека, встречающаяся in vivo, но не имеющая D3 домена, не способна связывать мономерные антитела, а только иммунокомплексы. Таким образом, очевидно, что двудоменная D1D2 структура является структурой, обеспечивающей низкоаффинное связывание, в то время как D3 домен FcyRI обуславливает специфичность и аффинность связывания ИГ.
Изучение связывания ИГ с химерными Fc-рецепторами, а также мутазенез в отдельных районах ИГ-доменов показали, что антитела взаимодействуют с D2 FcyRII, FcyRIII и FceRI. Причем для FcyRIII найден один район из 7 аминокислотных остатков (позиции 124-131 от N-конца белка), необходимый для связывания ИГ, у FcyRII обнаружено три таких района (109-116, 129-135 и 154-161), а у FcsRI - четыре (93-104, 111-125, 129-137, 154-161). D1 домен всех вышеупомянутых FcR увеличивает аффинность связывания ИГ, а также отвечает за стабильность FcR-ИГ комплекса (Tamm and Schmidt, 1997; Winkel and Capel, 1996).
Из приведеных здесь 10 ассоциированных с мембраной изоформ FcR человека (рис. 7) только 4 содержат в цитоплазматических частях сигнальные активирующие и ингибирующие мотивы (Muta et al., 1994). Остальные 6 изоформ не способны передавать сигнал о связывании с ИГ в ядро клетки сами, но могут это делать объединяясь со вспомогательными сигнальными субъединицами. Впервые взаимодействие Fc-рецептора с подобными субъединицами было показано для высокоаффинного рецептора для IgE - FCERI. FCSRI рецепторный комплекс состоит из а субъединицы, собственно FcsRI, а также (5 и у сигнальных корецепторов. FcsRip принадлежит к ТМ4 надсемейству белков, которые пронизывают клеточную мембану 4 раза (Kurosaki et al., 1992). Как FcsRIp, так и FcsRIy (далее просто FcRy), белки 32 содержат в своей цитоплазматической области по одному ITAM мотиву (Vivier et al., 1991).
FcyRIa, FcyRIal/c и FcyRIIIa изоформы также экспрессируются в комплексе с FcRy. Кроме того, FcyRIIIa могут экспрессироваться на поверхности NK-клеток и макрофагов в комплексе с ,_субъединицами, содержащими три ITAM мотива (Anderson et al., 1990; Irving et al., 1993; Lanier et al., 1989). Эти субъединицы также входят в состав Т-клеточного рецепторного комплекса, откуда их полное название CR . TCR% субъединицы находятся в виде дисульфид-связанных гомо- и гетеродимеров совместно с FcRy. На тучных клетках, наряду с у и , FcyRIIIa может ассоциироватся с р субъединицами (рис. 10). Для нормальной экспрессии FcyRIIIa и FcsRI необходима коэкспрессия FcRy или TCR корецепторов (Kurosaki et al., 1991). Восемь остатков в ТМ районе FcsRI являются консервативными и встречаются в ТМ районе FcyRIII. Эти аминокислотные остатки могут участвовать в ассоциации с FcRy и TCR субъединицами.
Идентифицировано три типа димеров, взаимодействующих с Fc-рецепторами и Т-клеточным рецептором: у-у, у-, и ,-,. Встречается еще одна субъединица из этого семейства - TCRn, которая возникает в результате альтернативного сплайсинга TCR транскриптов. у-г),г- и п-п димеры найдены только в TCR комплексе (Barclay et al., 1997).
передачу сигнала в ядро клетки, Fc-рецепторы должны агрегировать на клеточной поверхности, связываясь с антителами и мультивалентными антигенами. Агрегация рецепторов, а не связывание с лигандом, является критичной для инициирования механизмов сигнальной трансдукции. Низкоаффинные рецепторы (FcyRII и FcyRIII) не способны связывать моновалентные антитела, но могут активироваться при взаимодействии с агрегированными иммуноглобулинами или антителами в комплексе с мультивалентным антигеном. Отличия в активации низкоаффинных и высокоаффинных (FcyRI и FcsRI) рецепторов заключаются в порядке событий: в первом случае антитела сначала агрегируют, а потом связываются с рецептором, во втором же случае - мономерные антитела связываются с рецептором и затем агрегируют при действии мультивалентного антигена (Daeron, 1997).
Fc-рецепторные комплексы могут содержать несколько активирующих ITAM мотивов. Исследования с использованием химерных Fc-рецепторов показали, что для активации клетки Fc-рецептором является достаточным наличие одного сигнального мотива в цитоплазматическом районе самого FcR или его корецептора. Кроме того, было выяснено, что ITAM мотивы в составе разных FcR, а также их вспомогательных субъединиц обладают различными сигнальными свойствами. Эти различия связаны с дифференциальной активацией внутриклеточных ПТК. Активация разных ПТК может приводить к разным паттернам внутриклеточного фосфорилирования и, как следствие, дифференциальному включению генов, участвующих в эффекторном клеточном ответе.
Биологический ответ, запускаемый FcR, зависит скорее от типа клетки, в которой он экспрессируется, а не от самого рецептора. Разные FcR, находясь на поверхности одной клетки, могут запускать один и тот же ответ. В то же время один и тот же рецептор, экспрессируясь в клетках разных типов, может запускать ответы, специфичные для этого типа клеток (Daeron, 1991, 1997; Lynch et al., 1990; Ravetch and Clynes, 1998; Ravetch and Kinet, 1991; Winkel and Capel, 1996):
FcyRI конститутивно экспрессируются на моноцитах и макрофагах, на нейтрофилах человека экспрессию FcyRI можно индуцировать INFy(pHC. 11). На моноцитах и макрофагах FcyRI опосредует АЗКЦ - лизис инфицированной/ /опухолевой/чужеродной клетки, окутанной антителами, а также вызывает высвобождение цитокинов. В нейтрофилах FcyRI вызывает респираторный взрыв путем активации NADPH оксидазы. In vitro FcyRI может активировать поглощение небольших иммунокомплексов и фагоцитоз эритроцитов, покрытых AT.
FcyRII молекулы черезвычайно распостранены на лейкоцитах, они находятся практически на каждой FcR-несущей клетке, за исключением Т и NK клеток. FcyRII являются единственными FcyR на базофилах, тромбоцитах, В клетках, клетках Лангерганса и эндотелиальных клетках. FcyRIIa на макрофагах и моноцитах
Определение нуклеотидных последовательностей и структурный анализ FCRL1 кДНК человека и мыши
Поиск последовательностей, родственных третьему домену FcyRI в EST базах данных (dbEST), позволил выявить 2 группы неполных перекрывающихся кДНК человека и мыши с наибольшей гомологией. Одну группу мы условно назвали FCRL (FcR-like), а другую - IFGP (IgSF FcR gp42). Так как информация в dbEST была неполной, было неясно, являются ли кДНК из группы IFGP альтернативными продуктами одного гена или существует целое семейство FcR-подобных молекул. Из АТСС (American Type Culture Collection) было получено 9 кДНК клонов: aa63g02, nw60fl01, tz31b04, uc35g02, vf84e06 (группа IFGP) и ms73c01, ух39Ь01 (FCRL). Для всех этих клонов были полностью определены нуклеотидные последовательности кДНК-вставок.
ух39Ь01 кДНК человека имеет длину 2077 п.о. и содержит открытую рамку считывания из 365 аминокислотных остатков. Анализ предсказанной аминокислотной последовательности показал, что ух39Ь01 кДНК кодирует белок, состоящий из трех ИГ-подобных доменов, С-концевой уникальной последовательности и N-концевого сигнального пептида длиной в 26 аминокислотных остатков. Идентифицированный белок получил название FCRL1. Наличие сигнального пептида и отсутствие гидрофобного района, способного выполнять функции ТМ, свидетельствуют о том, что hFCRLl является секретируемым белком. Это же подтвердил компьютерный анализ, выявивший отсутствие сигналов GPI-прикрепления. N-концевой ИГ-подобный домен hFCRLl состоит из 51 аминокислотного остатка, что значительно меньше размера остальных трех доменов этого белка (89-98 остатков).
ms73c01 кДНК клон длиной 1338 п.о. кодирует мышиный гомолог FCRL1, состоящий из 352 аминокислотных остатков. Структура mFCRLl полностью аналогична структуре hFCRLl: N-концевой лидерный пептид, три ИГ-домена, один из которых укорочен, и С-концевой уникальный домен (см. Приложение 1).
С-концевые домены FCRL1 имеют повышенное содержание Ser, Thr и Pro, что характерно для сильно гликозилированных белков, поэтому мы назвали этот домен муцин-подобным. Вполне возможно, что муцин-подобный домен FCRL1 способен неспецифически связываться через свои сахарные группы с лектинами, селектинами или сиалоадгезинами.
Саузерн блот-гибридизация показала, что у мыши и у человека существует по одной копии гена FCRL1 (рис. 12В, рис. 13С). Наличие дополнительных гибридизующихся полос на некоторых дорожках объясняется наличием EcoRI сайта в последовательности зонда, кодирующего FCRL1 человека, и BamHI сайта в FCRL1 кДНК мыши.
uc35g02 кДНК мыши (1528 п.о.) кодирует трансмембранный белок I типа (343 аминокислотных остатка), состоящий из лидерного пептида, двух внеклеточных ИГ-подобных доменов, трансмембранного (ТМ) и цитоплазматического районов.
vf84e06 кДНК мыши (1947 п.о.) кодирует белок (507 аминокислотных остатков), состоящий из лидерного пептида и 5 доменов. 4 домена принадлежат к IgSF, пятый - к надсемейству цистеин-богатых скавенджер рецепторов (SRCR). Последний домен имеет высокую степень гомологии с недавно описанным секретируемым белком Spa/AIM (Gebe et аі., 1997, 2000). Два идентифицированных белка мыши были названы IFGP1 (двухдоменный) и IFGP2 (пятидоменный). Анализ предсказанной аминокислотной последовательности mIFGP2 показал, что этот белок является секретируемым.
aa63g02 кДНК человека (1908 п.о.) кодирует трансмембранный рецептор I типа (394 аминокислотных остатка), названный hlFGPl. Структурно он похож на mIFGPl, но в отличие от этого рецептора, hlFGP содержит во внеклеточной области дополнительный ИГ-подобный домен на N-конце. Сравнение aa63g02 с другими EST кДНК показало, что имеющаяся у нас кДНК кодирует белок с 3 -усеченным цитоплазматическим участком.
nw60ft)l кДНК человека (2210 п.о.) имеет 5 -усеченную рамку считывания (1266 п. о.), кодирующую N-концевой фрагмент ИГ-домена, 3 полных ИГ-домена, ТМ район и цитоплазматический участок hIFGP2 рецептора. tz31b04 кДНК человека (765 п.о.) кодирует типичный трансмембранный рецептор I типа с одним внеклеточным ИГ-доменом - hIFGP4 (225 аминокислотных остатков). Лидерный пептид hIFGP4 уникален и отличается от лидерных пептидов других IFGP (см. Приложение 2).
Для оценки количества генов, кодирующих идентифицированные IFGP белки у человека, была выделена геномная ДНК из нескольких образцов крови разных индивидуумов и проведен Саузерн блот-анализ. Зонд, соответствующий первому домену hlFGPl (241 п.о.), выявил единственный гибридизующийся фрагмент в трех индивидуальных образцах ДНК человека, гидролизованных EcoRI, Hindlll или PvuII эндонуклеазами рестрикции. Сходным образом зонд, кодирующий второй домен hIFGP2 (227 п.о.), выявил один фрагмент в пяти различных образцах геномной ДНК, гидролизованной EcoRI или PvuII (рис. 12С, D). Эти результаты говорят о наличии одного IFGP1 и одного IFGP2 гена у человека. Однако гибридизация в мягких условиях (55С) с использованием зонда, кодирующего третий домен hlFGPl (177 п.о.), обнаружила множественные гибридизующиеся полосы в пяти индивидуальных образцах ДНК, гидролизованных PvuII и Hindlll. Полученные данные свидельствуют о существовании большого семейства генов, имеющих гомологию, по крайней мере, с третьим ИГ-доменом hlFGPl (рис. 12А).
Для оценки количества генов, кодирующих IFGP мыши, был проведен Саузерн блот-анализ геномной ДНК из лейкоцитов крови, гидролизованной BamHI или PvuII эндонуклеазами рестрикции. В качестве зонда использовали фрагмент mIFGPl кДНК, кодирующий второй домен (151 и.о.). Саузерн блот-гибридизация в мягких условиях выявила наличие нескольких гибридизующихся полос, что указывает на наличие нескольких генов IFGP у мыши (рис. 13А). Гибридизация ДНК с mIFGP2
Сравнительный анализ первичной структуры цитоплазматических районов IFGP
Цитоплазматические участки всех идентифицированных IFGP рецепторов обладают значительным сходством и содержат консервативные тирозиновые остатки (Приложения 1-4, рис. 23). mIFGPl и MFGP2-4 рецепторы содержат ITAM-подобные мотивы вида Q/ExxYxxVx8YxxV/I. Стоит отметить, что эти мотивы кодируются двумя экзонами, что также характерно для ITAM. Так как для ряда ITAM-содержащих рецепторов была показана потеря функции сигнального мотива при замене гидрофобной аминокислоты в YxxV/L/I мотиве на Ala (Gauen et al., 1994), ITAM-подобные мотивы hlFGPl и hIFGP5 следует признать нефункциональными. Кроме ITAM-подобных, hIFGP2, hIFGP3 и hIFGP4 рецепторы содержат по одному классическому" V/L/IxYxxV/L/I ІТІМ мотиву, a hIFGP5 даже 2 таких мотива. Кроме того, все молекулы дополнительно содержат 1-4 потенциальных ІТІМ-мотива.
Неизвестно какую функциональную роль, ингибирующую или активирующую, играют тирозин-основанные мотивы IFGP белков, но само по себе наличие сигнальных функций у этих рецепторов не вызывает сомнений. Вполне вероятно, что цитоплазматические концы IFGP белков имеют разные сигнальные функции. В пользу такого предположения говорят как различие в расположении типичных и нетипичных тирозин-основанных мотивов, так и наличие в N-концевой части цитоплазматического домена hIFGP2 пролин-богатого мотива, соответствующего консенсусу xL/1/VPPxP (х - любая аминокислота) БНЗ-связывающего мотива I класса. Подобный консервативный пролин-богатый мотив выявлен в цитоплазматической части CD3s сигнальных субъединиц Т-клеточного рецепторного комплекса (Alabyev et al., 2000). CD3y и CD38 субъединицы, входящие в этот же комплекс, не имеют этого мотива а, как предполагается, имеют в связи с этим иные сигнальные функции.
Стоит отметить, что трансмембранный район hlFGPl содержит остаток отрицательно заряженной аминокислоты (Glu), что является характерной чертой активирующих рецепторов, взаимодействующих с сигнальными субъединицами. Например, FcyRIII и FcsRI, взаимодействующие с FcRy, TCR и FcRp субъединицами, содержат в своем ТМ остаток Asp.
Вторая часть настоящей работы посвящена поиску FcR-подобных рецепторов у низших позвоночных. Поиск последовательностей, родственных IFGP и FCRL человека и мыши, в EST базах данных позволил нам выявить ряд гомологичных кДНК у пещерного сомика Ictalurus punctatus, рыбы Danio rerio и африканской шпорцевой лягушки Xenopus laevis. Принимая во внимание приведенные ниже обстоятельства, мы остановили свой выбор на изучении FcR-подобных рецепторов африканской шпорцевой лягушки. Во-первых, больше всего FcR-подобных EST кДНК было обнаружено у X. laevis. Далее, у X. laevis довольно хорошо изучена иммунная система: известна структура локусов МНС и иммуноглобулинов, получены многочисленные линии, продуцирующие моноклональные антитела против многих маркеров лейкоцитов и других клеток, существуют панели клеточных линий из разных тканей и разных стадий развития лягушки. Таким образом, имеется солидный фундамент для дальнейших исследований, касающихся изучения функций FcR-подобных генов у этого вида, если, конечно, они имеют отношение к иммунной системе. Кроме того, у X. laevis были идентифицированы EST кДНК, гомологичные TCR и FcRy позвоночных (Guselnikov et al., 2003), что представляет большой интерес в плане изучения коэволюции Fc-рецепторов и их сигнальных субъединиц. Для изучения структуры FcR-подобных молекул X. laevis у Research Genetics были приобретены несколько EST кДНК клонов: daal8h07, daa24c04, dab08a02, dab24g06, dai46h06 и dcl2e01. Для всех клонов была определена полная нуклеотидная последовательность кДНК вставок. daal8h07 кДНК (3341 п.о.) кодирует трансмембранный рецептор I типа из 727 аминокислотных остатков. Структура этого рецептора соответствует структуре РЕСАМ-1 человека и мыши: лидерный N-концевой пептид, шесть внеклеточных ИГ-доменов, ТМ домен и цитоплазматический участок.
dcl2e01 кДНК длиной 1459 и.о. содержит 5 -усеченную открытую рамку считывания из 397 аминокислотных остатков. Анализ последовательности кДНК вставки показал, что она кодирует усеченный домен D1 типа (DT), полный домен D2 типа, два домена D3 типа, ТМ и цитоплазматический участок (Cyt), содержащий тирозин-основанные мотивы. dai46h06 кДНК (2051 п.о.) также является 5 -усеченной и кодирует трансмембранный рецептор I типа из 601 аминокислотного остатка со следующей структурой: Dl -D2-D3-D3-D3M-Cyt. dab08a02 кДНК (1780 п.о.) содержит открытую рамку считывания из 431 аминокислотного остатка с 5 -усеченным концом. кДНК кодирует конец D3 домена, а также D4, D5 и ТМ домены и довольно длинный цитоплазматический участок из 107 аминокислотных остатков. Между D5 и ТМ доменами располагается ИГ-подобный домен (DI), не имеющий явных гомологов среди молекул IgSF, но наиболее близкий к ИГ-доменам древнего I типа.daa24c04 кДНК (1427 п.о.) кодирует типичный трансмембранный рецептор I типа (311 аминокислотный остаток), состоящий из короткого лидерного пептида, D1-D2-D3 доменов, ТМ и цитоплазматического района всего из 5-7 аминокислотных остатков. dab24g06 кДНК (2003 п.о.) кодирует секретируемый белок из 239 аминокислотных остатков с интересной структурой. Он состоит из лидерного пептида, единственного D3 домена и длинного участка, богатого Ser, Thr и Pro ( 40-50%). ТМ района и сигналов для GPI-прикрепления обнаружено не было, что говорит о том, что dab24g06 кодирует секретируемый белок.
В EST базах данных нами была идентифицирована группа частично перекрывающихся кДНК (cm46h02, dcl8dl2, dai40b05), имеющих значительное сходство с dcl2e01 в районах, кодирующих D3 домен (-80% по аминокислотным остаткам). cm46h02 и dcl8dl2 кДНК являются 5 -усеченными и кодируют D3 домен, сходный с D3 доменами, кодируемыми dcl2e01. Кроме того, эти кДНК кодируют ТМ домен и цитоплазматический район, отличные от таковых у dcl8dl2. dai40b05 кДНК на 5v-конце содержит невырезанный интрон, за которым следуют экзоны, кодирующие D3 и D4 домены. D4 домен dai40b05 полностью идентичен D4 домену dab08a02, таким образом эти кДНК стыкуются и dab08a02 относится к той же группе кДНК, объединяемых высокой гомологией районов, кодирующих D3 домены. Продукты, кодируемые этими кДНК, были названы XFL1 (Xenopus cR-fike), в то время как продукты daa24c04 и dab24g06 - XFL2 и XFL3, соответственно. Белок, кодируемый cm46h02 и dcl8dl2, был назван XFLl.la, dcl2e01 - XFL1.2a, dai46h06 -XFL1.4, dai40b05 и dab08a02 - XFL1.5 (см. Приложения 6 и 7).
