Содержание к диссертации
Введение
I. Введение З
І. 1. Проблема отбора и нейтральности на молекулярном уровне 3
1.2. Проблема эволюции дупликаций 15
1. 3. р-эстеразный кластер генов 18
1. 4. Эволюция псевдогенов 23
1. 5. Гомеобокс-содержащие гены tin и bap 51
1. 6. Объем диссертационной работы 54
II. Материалы и методы 55
2, 1. Исследованные линии и виды подгруппы D. meianogaster 55
2.1. Аллозимный электрофорез 55
2. 3. Амплификация, клонирование и секвеннрование генов 55
2. 4. Анализ последовательностей ДНК 56
III. Результаты 57
3.1. Полиморфизм и дивергенция последовательностей ДНК 59
3. 2. Рекомбинация и генная конверсия 63
3. 3. Структура гаплотипок и дифференциация популяций 66
3.4. Распределение изменчивости и дивергенции 74
3. 5. Межлокусные взаимодействия 81
3. 6. Тесты на нейтральность 91
3. 7. Энтропия и нуклеотидный состав 95
IV. Обсуждение 100
4. 1. Филогеография D. meianogaster 101
4. 2. Сравнительная характеристика функционально связанных генов ... 104
4. 3. Соотношение нейтральных факторов и отбора при формировании паттерна нуклеотидной изменчивости 109
4. 4. Псевдогены, потогены и интергены ...111
V. Выводы 115
VI. Литература 120
VII. Приложение 191
- Проблема отбора и нейтральности на молекулярном уровне
- Амплификация, клонирование и секвеннрование генов
- Структура гаплотипок и дифференциация популяций
- Сравнительная характеристика функционально связанных генов
Введение к работе
1.1. Проблема отбора и нейтральности на молекулярном уровне
Генетическая изменчивость, механизмы ее поддержания и важность для эволюции, была и остается одной из основных и все еще не разрешенных проблем эволюционной биологии (Алтухов, 1989; Lewontin, 1974; Ayala, 1976; Kimura, 1983; Nei, 1987). С одной стороны, убедительно показано, что нейтральные факторы играют значительную роль в динамике генетической изменчивости (Kimura, 1983). С другой стороны, выявлено, что потеря изменчивости, обусловленная, например, значительным снижением численности, может иметь негативные последствия для вида (Алтухов, 1989; Mitton, 1998). Неясность данного вопроса во многом связана с методическими сложностями анализа генетической изменчивости. До недавнего времени исследователям были доступны методы лишь частично или косвенно характеризующих генетическую изменчивость (аллозимы, рестрикционный анализ и др.). Результаты этих работ, тем не менее, позволили выявить огромный резерв генетической изменчивости на молекулярном уровне. Это открытие стимулировало дальнейшее проведение многочисленных теоретических и экспериментальных исследований и явилось причиной длительного и плодотворного противоборства идей нейтральности и селективности на молекулярном уровне (нейтралистско-селекционистская полемика). Рассмотрим кратко некоторые аспекты этой полемики.
Нейтральная теория признает, что морфологические, функциональные и поведенческие признаки организмов эволюционируют под влиянием естественного отбора, оперирующего через посредство адаптивных изменений в ДНК. Сторонники этой теории утверждают, что, существенная часть эволюционных изменений в ДНК (и, следовательно, в белках, кодируемых ДНК), тем не менее, происходит за счет случайного процесса ошибок выборочности в чреде генераций (Kimura, 1968,1983; King and Jukes, 1969; Kimura and Ohta, 1971),
Нейтральная теория принимает, что большая доля всех вновь возникающих мутаций является вредоносной. Эти вредные генетические варианты элиминируются, ила сегрегируют при очень низких частотах, за счет действия негативного отбора. Сторонники нейтральной теории утверждают, что по многим, возможно, большинству, генным локусам имеется большое число мутантов, которые являются эффективно эквивалентными в отношении к адаптации. Каждый из этих нейтральных мутантов положительно отбирается относительно вредоносных, но носители альтернативных функциональных генотипов не различаются по приспособленности; их частоты в популяциях следовательно не находятся под влиянием естественного отбора. Так как природные популяции состоят из конечного числа особей, частоты нейтральных мутаций будут изменяться от генерации к генерации, вследствие выборочного дрейфа. Следовательно, предсказывается, что различия последовательностей ДНК или белков между видами обусловлены в основном случайными процессами, а не естественным отбором. Внутривидовой генетический полиморфизм представляет, в соответствии с нейтральной теорией, переходное состояние в популяциях, идущее от фиксации одного аллеля по направлению к фиксации другого, адаптивно эквивалентного аллеля.
Теория эволюции посредством естественного отбора, со своей стороны, признает, что генетические частоты находятся под влиянием стохастического процесса ошибок выборочности. Полемика между двумя теориями заключается в следующем: являются ли генетические различия между видами и генетический полиморфизм в пределах популяций результатом исключительно (или главным образом) стохастических процессов, как утверждается нейтральной теорией, или должны быть постулированы неслучайные процессы, как утверждается теорией естественного отбора (Алтухов, 1989; Lewontin, 1974; Ayala, 1976, 1997,1999).
Нейтральная теория эволюции делает определенные предсказания в отношении паттернов генетического полиморфизма в популяциях и различий между видами. Следовательно, имеется возможность для критического тестирования наличия (или отсутствия) конгруэнтности между предсказаниями, выведенными из теории и результатами релевантных наблюдений и экспериментов. Нейтральная теория действительно была подвергнута многостороннему эмпирическому тестированию.
Одно семейство тестов исследует теоретическое ожидание постоянства скорости молекулярной эволюции генов и белков. Теория нейтральности принимает, что число нуклеотидных или аминокислотных замен (со средним значением Ы = kt, где к - это частота нейтральных мутаций и г - это время в годах), аккумулирующихся после дивергенции видов от общего предка, следует распределению Пуассона. Данное распределение характеризуется тем, что дисперсия, V, является равной среднему значению, М, и поэтому, ожидаемое значение отношения дисперсии к среднему значению теоретически должно быть равно единице, R = V/M= 1 (Kimura and Ohta, 1971; Kimura, 1983). В многочисленных исследованиях, однако, показано, что гены и белки эволюционируют более неравномерно, чем допускается нейтральной теорией. Наблюдаемые значения R часто существенно отклоняются от единицы (так называемые "сверхрассредоточенные" молекулярные часы, Gillespie, 1989, 1991), что подвергает сомнению правомерность модели молекулярных часов (Gillespie, 1991; Ayala, 1999). В связи с этим было предложено несколько гипотез, которые модифицировали предсказания нейтральной теории, допуская большую дисперсию эволюционных скоростей (Ayala, 1999). Показано, однако, что предсказания, полученные на основании любой из производных гипотез также не выдерживаются. Детальные исследования различных генов доказывают, что скорости молекулярной эволюции варьируют от одной группы организмов к другой и от одного временного периода к другому, в несогласующихся паттернах (Ayala, 1997, 1999; Rodriguezrelles etal.,2001).
Другое семейство тестов исследует распределение внутривидовой генетической изменчивости и оценивает степень, его соответствия нейтральным моделям. К настоящему времени накоплено огромное количество данных в рамках этого подхода, полученных в основном с использованием аллозимных маркеров. Аллозимные маркеры имеют однозначную генетическую интерпретацию, обладают высокой надежностью и оказываются пригодными для выяснения общих тенденций в уровне генетической изменчивости (см. обзоры на эту тему Nevo etal., 1984; Ward et al., 1992). Аллозимы оказались особенно плодотворными маркерами при исследованиях популяционной структуры (Корочкнн и др., 1977; Кирпичников, 1987; Алтухов, 1989; Алтухов и др., 1989), регуляции и экспрессии генов (Корочкнн, 1995; Корочкин и др., 1977; Korochkin et al., 1990), а также при эволюционных исследованиях в метаболическом контексте (Watt, 1994; Watt and Dean, 2000). Однако эти маркеры оказались менее эффективными для решения проблемы отбора и нейтральности на молекулярном уровне (Lewontin, 1991; Kreitman and Akashi, 1995; Barbadilla et al., 1996; David, 1998; Hey, 1999; Veuille, 2000). Возможно, это обусловлено тем, что аллозимы маркируют лишь небольшую долю генома (вероятно, менее 2%), так как, некоднрующие последовательности составляют более 98% генома (Adams ct al., 2000; Rubin et al., 2000; Lander et al., 2001; Waterston et al., 2002) и выявляют лишь несинонимичные мутации, приводящие к изменению суммарного заряда белка. В ряде случаев результаты аллозимных исследований могут быть одинаково убедительно интерпретированы как с позиции отбора, так и с позиции нейтральности. Приведем ряд примеров данного тезиса.
1, Аллозимная изменчивость у морских беспозвоночных: адаптивная стратегия или особенности макроэволюции?
С использованием большого набора аллозимных маркеров (до 100 и более локусов) мы исследовали внутривидовой аллозимный полиморфизм у губки Suberites domuncula (Балакирев и Манченко, 1985а), актинии Anthopleura orientalis (Манченко и Балакирев, 1984), немертины Linens torquatus (Балакирев и Манченко, 1984; Balakirev and Manchenko, 1984b), брахиоподы Coptothyris grayi (Балакирев и Манченко, 19856), сипункулиды Phascolosomajaponicum (Балакирев и Манченко, 1983; Balakirev and Manchenko, 1984а), моллюсков Swiftopecten swifti,
Mizuhopectenyessoensis, Chlamys farreri nipponensis (Balakirev et al., 1995), Mytilus trossulus, M. edulis, M. galloprovincialis (Зайкин и Балакирев, 1989; МакДональд и др., 1990), Crenomytilus grayanus и Modiolus difficilis (Балакирев, 1985, 19876; Балакирев, неопубликованные данные), иглокожего Scaphechinus mirabilis (Манченко и Балакирев, 1982), ракообразного Paralithodes camischaticus (Балакирев и Федосеев, 1994, 1999, 2000а, 20006, 2001), и асцидии Halocynthia aurantium (Балакирев и Манченко, 19856). Кроме этого, у разнообразных видов морских организмов исследована аллозимная изменчивость аланопин дегидрогеназы (Манченко и Балакирев, 1985; Manchenko and Balakirev, 1986), неорганической пирофосфатазы (Балакирев, 1984; Balakirev, 1985), глутатион редуктазы (Balakirev and Zaykin, 1990а), формальдегид дегидрогеназы (Балакирев и Зайкин, 1988; Balakirev and Zaykin, 1990b), гистонов (Манченко и др., 1984) и других белков (Манченко и Балакирев, 1979; Manchenko and Balakirev, 1980а). Для сравнительных целей исследована также изменчивость аллозимов у высшего гриба Boletus edulis (Manchenko and Balakirev, 1980b),
В подавляющем большинстве случаев выявлен очень высокий уровень аллозимной изменчивости; существенно более высокий чем, например, у позвоночных организмов (Nevo et al., 1984; Ward et al., 1992), Однако у крупного ракообразного — камчатского краба Paralithodes camtschatlcus обнаружен очень низкий уровень изменчивости, существенно ниже, чем в среднем у позвоночных организмов (Балакирев и Федосеев, 1994,1999,2000а, 20006, 2001).
Полученные нами данные находятся в соответствии с результатами других авторов, исследующих аллозимный полиморфизм. При анализе распределения изменчивости в разных таксономических группах обнаруживаются определенные тенденции: наиболее низкие значения гетерозиготности характерны для крупных, обычно подвижных форм; мелкие малоподвижные организмы обычно обладают существенно более высоким уровнем изменчивости (Nevo et al., 1984; Ward et al., 1992). Первая группа в основном включает позвоночные организмы, вторая -беспозвоночные. Однако аналогичная закономерность выявляется и при рассмотрении отдельных групп организмов, например, ракообразных. В пределах этой группы обнаружена аналогичная закономерность: у крупных и подвижных к- форм (крабы и другие, десятиногие ракообразные) выявлены низкие значения гетерозиготности, тогда как у мелких и малоподвижных форм (усоногие, веслоногие, ветвистоусые и криль) значения гетерозиготностей существенно выше (Nelson and Hedgecock, 1980; Hedgecock et al., 1982).
Данные наблюдения могут быть объяснены различной стратегией генетической адаптации (Levins, 1968) крупных и мелких форм к внешней среде.
Крупные относительно подвижные организмы, воспринимают среду как "мелкозернистую", что должно привести к фиксации наиболее благоприятных аллелей по многим локусам и соответственному снижению общего генетического разнообразия. Мелкие малоподвижные организмы, воспринимают внешнюю среду как "грубозернистую", что благоприятствует отбору, повышающему общий размах изменчивости вида. Данное объяснение исходит из превалирующей роли естественного отбора в определении уровня изменчивости вида {Levins, 1968). Однако выявленное различие в уровне изменчивости у мелких и крупных организмов может быть объяснено и без привлечения гипотезы адаптивной стратегии. Так, в соответствии с нейтральной теорией молекулярной эволюции величина генетического разнообразия определяется частотой мутаций и эффективной численностью вида (Kimura, 1983). Основным источником мутаций являются ошибки при репликации ДНК в процессе деления половых клеток. Следовательно, в любой произвольный период времени организмы с коротким временем генерации будут проходить через большее число генераций и, следовательно, большее число раундов делений половых клеток (репликаций ДНК), чем организмы с длительным временем генерации. Отсюда ожидается, что у видов с коротким временем генерации скорость молекулярной эволюции должна быть выше, чем у видов с длительным временем генерации {гипотеза эффекта времени генерации (Laird et al., 1969)), Гипотеза эффекта времени генерации нашла подтверждение при сравнительных исследованиях скорости молекулярной эволюции у грызунов, приматов и человека (Gu and Li, 1992), а также растений (Gaut et al., 1992). Положительная корреляция между величиной внутривидового полиморфизма и скоростью молекулярной эволюции предсказывается нейтральной теорией (Kimura, 1983) и подтверждается экспериментальными данными (Skibmski et alM 1993). Время генерации у мелких организмов обычно значительно меньше, чем у крупных. Например, у мелких ракообразных время генерации составляет от 0,1 до 2 лет, в то время как у крупных может достигать 10-12 лет. Таким образом, гипотеза эффекта времени генерации удовлетворительно объясняет различие генетической изменчивости, выявленное для крупных и мелких форм организмов.
Исходя из нейтральной теории молекулярной эволюции, наблюдаемое различие гетерозиготности у мелких и крупных форм также достаточно хорошо объясняется различием эффективной численности их популяций. Эффективная численность обычно значительно меньше реальной численности, что может быть обусловлено, например, флуктуациями численности во времени и неравной численностью самок и самцов, участвующих в размножении (Wright, 1931,1938). Такие события менее вероятны для морской среды, что наряду с особенностями эволюционной истории морских беспозвоночных (больший геологический возраст по сравнению с позвоночными организмами) достаточно легко может объяснить различие в уровнях генетической изменчивости этих групп организмов. Таким образом, различия в уровне аллозимной изменчивости между позвоночными и беспозвоночными (как и в общем случае - между крупными и мелкими формами организмов), могут быть обусловлены как особенностями макроэволюционной истории {отсутствием значительных изменений численности во времени) и большим объемом популяций у мелких форм в сравнении с крупными (то есть, нейтральными факторами), так и стратегией генетической адаптации. Низкий уровень аллозимная изменчивости у камчатского краба может быть объяснен как селективными факторами (стратегия крупного зерна), так и нейтральными причинами (низкая эффективной численности вида).
2. Существенное отличие уровня аллозимной изменчивости у трех видов гребешков: различия во времени существования видов или особенности биологии?
При исследовании трех видов гребешков (Balakircv et al., 1995) мы обнаружили, что уровень аллозимной изменчивости у малоподвижного вида, формирующего друзы (Chlamys farreri nipponensis) существенно выше, чем у подвижных видов гребешков (Swiftopecten swifti и Mizuhopecten yessoensis). Интересно, что возраст исследованных видов существенно различается. Chlamys farreri nipponensis принадлежит к древнему роду Chlamys, известному с триаса; раковины Chlamys находят в отложениях, имеющих возраст не менее 200 миллионов лет. Роды Swiftopecten и Mizuhopecten отделились от рода Chlamys относительно недавно, около 20-30 миллионов лет назад в позднем олигоцене и раннем миоцене (Waller, 1991). Как следует из геологической летописи, роды Swiftopecten и Mizuhopecten значительно моложе рода Chlamys. Таким образом, выявляется прямая связь между геологическим возрастом вида и уровнем генетической изменчивости, как и предсказывается нейтральной теорией молекулярной эволюции. С другой стороны, эти же данные достаточно убедительно объясняются и с селекционной позиции (различные стратегии адаптации, см. выше). Исследованные виды имеют контрастные биологические характеристики: Chlamys farreri nipponemis является малоподвижным видом, формирующим друзы, тогда как Swiftopecten swifti и Mizuhopectenyessoemis способны передвигаться. Исходя из гипотезы стратегии адаптации к внешней среде подвижный вид должен быть менее изменчив, поскольку он воспринимает среду как мелкозернистую, в отличие от неподвижного вида, воспринимающего среду как грубозернистую, что и наблюдается в наших данных. Таким образом, полученные результаты достаточно убедительно объясняются как с селекционной позиции (различные стратегии адаптации подвижных и малоподвижных форм, см. выше), так и с нейтральной позиции (существенные различия во времени существования видов).
3. Микропространственная изменчивость у мидии Грея: отбор по местообитанию или пецилогония?
При исследовании внутривидовой аллозимной изменчивости у морского двустворчатого моллюска Crenomytilus grayanus (Балакирев, 1983, 1986а, 19866, 1987а, 19876, 1988а, 19886; Балакирев и Пудовкин, 1984; Пудовкин и Балакирев, 1985) обнаружена микропространственная и временная неоднородность его поселений. Если предположить, что во время личиночной стадии происходит полное перемешивания генофонда вида, то генетическая неоднородность наиболее вероятно возникает вследствие действия отбора по местообитанию. Следовательно, результаты данной работы могут рассматриваться как веское свидетельство действия естественного отбора в отношении изученного полиморфизма. Однако, известно, что распространение личинок может происходить не случайно, за счет, например, такой особенности биологии моллюсков как "пецилогония", при которой часть личинок остается вблизи родительских особей (Hoagland and Robertson, 1988; Krug, 1998; Gibson et al., 1999; Morgan et al., 1999; Schulze et al., 2000). Если часть личинок после нереста мидий не покидает родительские друзы, это может привести к накоплению генетических различий между соседними друзами за счет ограничения миграции (и сопутствующего дрейфа генов), а не действия отбора по местообитанию,
4. Аллозимные отличия поселений модиолуса Modiolus difftcilis, расположенных на грунтах различной плотности: отбор по местообитанию или "скрытые" виды?
При эколого-генетическом исследовании двустворчатого моллюска Modiolus difficilis (Прийма и Балакирев, 1984, 1986,1988) выявлена отчетливая связь между типом грунта (мягкий - ил и твердый - скалы) и частотами аллелей по локусу Lap. Эта связь не зависит от расстояния между исследованными поселениями моллюска. Так, поселения, находящиеся на расстоянии десятков километров, но расположенные на сходных грунтах, генетически оказываются ближе, чем поселения, разделенные десятками метров, но приуроченные к разным типам грунтов. В жизненном цикле модиолуса имеется стадия пелагической личинки, продолжающаяся 1-2 месяца. Этого времени достаточно, чтобы нивелировать любые генетические отличия, обусловленные стохастическими причинами. Следовательно, выявленная связь между генетическим сходством поселений и типом грунта, вероятно, обусловлена либо действием естественного отбора (внутривидовая дифференциация), либо присутствием "скрытых" видов (часто обнаруживаемых у морских организмов, Palumbi, 1994; Knowlton, 2000) модиолуса (межвидовая дифференциация), приуроченных к разным типам грунта.
Таким образом, не смотря на большую ценность аллозимных маркеров при решении ряда важных эволюционно-генетических вопросов (Корочкин и др., 1977; Кирпичников, 1987; Алтухов, 1989; Алтухов и др., 1989; Korochkin et al., 1990; Корочкин, 1995; Watt, 1994; Watt and Dean, 2000), они оказались малоинформативньши для выяснения проблемы отбора и нейтральности на молекулярном уровне.
Разработка методов секвенирования и амплификации ДНК (Sanger et al., 1977; Maxam and Gilbert, 1980; Mullis et al., 1986) в корне изменила ситуацию. Впервые появилась возможность анализировать изменчивость на уровне нуклеотидных последовательностей. Этот методический прорыв привел к появлению нового раздела генетики (молекулярной популяционной И эволюционной генетики), оперирующего нуклеотидными последовательностями на внутри- и межвидовом уровне. Начиная с пионерской работы Мартина Крсйтмана (Kreitman, 1983), впервые применившего метод секвенирования ДНК для исследования нуклеотидной изменчивости гена алкогольдегидрогеназы у DrosophUa melanogaster, эволюционная и популяционная генетика вышла на новые рубежи (см., например, Алтухов и Салменкова, 2002; Cavalli-Sforza, 1998). Впервые появилась возможность анализа внутри- и межвидовой изменчивости на уровне нуклеотидных последовательностей, исчерпывающем уровне организации генома. В настоящей работе представляются результаты, полученные с использованием семейства тестов, основанных на анализе паттернов нуклеотидного полиморфизма, наблюдаемых на популяционном уровне. Мы исследуем распределение изменчивости нуклеотидных последовательностей /3-остеразных генов Est-б и \\fEst-6 и гомеобокс-содержащих генов tin и bap в природных популяциях Drosophila tnelanogaster.
Проблема отбора и нейтральности на молекулярном уровне
Генетическая изменчивость, механизмы ее поддержания и важность для эволюции, была и остается одной из основных и все еще не разрешенных проблем эволюционной биологии (Алтухов, 1989; Lewontin, 1974; Ayala, 1976; Kimura, 1983; Nei, 1987). С одной стороны, убедительно показано, что нейтральные факторы играют значительную роль в динамике генетической изменчивости (Kimura, 1983). С другой стороны, выявлено, что потеря изменчивости, обусловленная, например, значительным снижением численности, может иметь негативные последствия для вида (Алтухов, 1989; Mitton, 1998). Неясность данного вопроса во многом связана с методическими сложностями анализа генетической изменчивости. До недавнего времени исследователям были доступны методы лишь частично или косвенно характеризующих генетическую изменчивость (аллозимы, рестрикционный анализ и др.). Результаты этих работ, тем не менее, позволили выявить огромный резерв генетической изменчивости на молекулярном уровне. Это открытие стимулировало дальнейшее проведение многочисленных теоретических и экспериментальных исследований и явилось причиной длительного и плодотворного противоборства идей нейтральности и селективности на молекулярном уровне (нейтралистско-селекционистская полемика). Рассмотрим кратко некоторые аспекты этой полемики.
Нейтральная теория признает, что морфологические, функциональные и поведенческие признаки организмов эволюционируют под влиянием естественного отбора, оперирующего через посредство адаптивных изменений в ДНК. Сторонники этой теории утверждают, что, существенная часть эволюционных изменений в ДНК (и, следовательно, в белках, кодируемых ДНК), тем не менее, происходит за счет случайного процесса ошибок выборочности в чреде генераций (Kimura, 1968,1983; King and Jukes, 1969; Kimura and Ohta, 1971),
Нейтральная теория принимает, что большая доля всех вновь возникающих мутаций является вредоносной. Эти вредные генетические варианты элиминируются, ила сегрегируют при очень низких частотах, за счет действия негативного отбора. Сторонники нейтральной теории утверждают, что по многим, возможно, большинству, генным локусам имеется большое число мутантов, которые являются эффективно эквивалентными в отношении к адаптации. Каждый из этих нейтральных мутантов положительно отбирается относительно вредоносных, но носители альтернативных функциональных генотипов не различаются по приспособленности; их частоты в популяциях следовательно не находятся под влиянием естественного отбора. Так как природные популяции состоят из конечного числа особей, частоты нейтральных мутаций будут изменяться от генерации к генерации, вследствие выборочного дрейфа. Следовательно, предсказывается, что различия последовательностей ДНК или белков между видами обусловлены в основном случайными процессами, а не естественным отбором. Внутривидовой генетический полиморфизм представляет, в соответствии с нейтральной теорией, переходное состояние в популяциях, идущее от фиксации одного аллеля по направлению к фиксации другого, адаптивно эквивалентного аллеля.
Теория эволюции посредством естественного отбора, со своей стороны, признает, что генетические частоты находятся под влиянием стохастического процесса ошибок выборочности. Полемика между двумя теориями заключается в следующем: являются ли генетические различия между видами и генетический полиморфизм в пределах популяций результатом исключительно (или главным образом) стохастических процессов, как утверждается нейтральной теорией, или должны быть постулированы неслучайные процессы, как утверждается теорией естественного отбора (Алтухов, 1989; Lewontin, 1974; Ayala, 1976, 1997,1999).
Нейтральная теория эволюции делает определенные предсказания в отношении паттернов генетического полиморфизма в популяциях и различий между видами. Следовательно, имеется возможность для критического тестирования наличия (или отсутствия) конгруэнтности между предсказаниями, выведенными из теории и результатами релевантных наблюдений и экспериментов. Нейтральная теория действительно была подвергнута многостороннему эмпирическому тестированию.
Одно семейство тестов исследует теоретическое ожидание постоянства скорости молекулярной эволюции генов и белков. Теория нейтральности принимает, что число нуклеотидных или аминокислотных замен (со средним значением Ы = kt, где к - это частота нейтральных мутаций и г - это время в годах), аккумулирующихся после дивергенции видов от общего предка, следует распределению Пуассона. Данное распределение характеризуется тем, что дисперсия, V, является равной среднему значению, М, и поэтому, ожидаемое значение отношения дисперсии к среднему значению теоретически должно быть равно единице, R = V/M= 1 (Kimura and Ohta, 1971; Kimura, 1983). В многочисленных исследованиях, однако, показано, что гены и белки эволюционируют более неравномерно, чем допускается нейтральной теорией. Наблюдаемые значения R часто существенно отклоняются от единицы (так называемые "сверхрассредоточенные" молекулярные часы, Gillespie, 1989, 1991), что подвергает сомнению правомерность модели молекулярных часов (Gillespie, 1991; Ayala, 1999). В связи с этим было предложено несколько гипотез, которые модифицировали предсказания нейтральной теории, допуская большую дисперсию эволюционных скоростей (Ayala, 1999). Показано, однако, что предсказания, полученные на основании любой из производных гипотез также не выдерживаются. Детальные исследования различных генов доказывают, что скорости молекулярной эволюции варьируют от одной группы организмов к другой и от одного временного периода к другому, в несогласующихся паттернах (Ayala, 1997, 1999; Rodriguezrelles etal.,2001).
Амплификация, клонирование и секвеннрование генов
Двадцать мух из каждой линии Д melanogaster гомогенизировали в 20 ul 0,1 М Трис-HCl буфера, рН 8,0. Электрофорез в 11% крахмальном геле проводили в течение 8-9 часов с использованием Трис-боратной буферной системы, рН 8,6 (Markert and Faulhaber 1965). Ферментативную активность EST-6 выявляли в соответствии со стандартными процедурами (Harris and Hopkinson, 1976).
Процедуры экстракции ДНК, рестрикционного картирования, клонирования, амплификации и секвенирования приводятся в соответствующих работах (Балакирев, 1995; Balakirev et al., 1999, 2002,2003, 2004a). Для каждой линии определялись последовательности обеих цепей ДНК с использованием 24 перекрывающихся внутренних праймеров, расположенных на расстоянии (в среднем) 350 нуклеотидов. Две независимые амплификации были проведены и секвенированы в обоих направлениях для каждого полиморфного сайта для того, чтобы предотвратить возможные ошибки, возникающие при амплификации или секвенировании. Полученные нуклеотидные последовательности размещены в генном банке под инвентарными номерами: AF526538 - AF526559; AF150809 -AF150815; AF147095 - 147102; AF217624 - AF217645; AY247664 - AY247713; AY247987 - AY248036, AY368077 - AY368109, AY369088 - AY369115, AY695919 - AY695924, В работе использованы также нуклеотидные последовательности эстеразных генов, исследованных другими авторами у следующих видов: D. pseudoobscum (Brady et al,, 1990), D. persimilis and D. miranda (King, 1998), D. melanogaster (Collet et al., 1990), D, yakuba (Oakeshott et al., 2001), D, simulans и D. mauritiana (Karotam et al., 1993).
Ассемблинг нуклеотидных последовательностей осуществлялся с использованием программы ScqMan (Lasergene, DNASTAR, Inc., 1994-1997). Множественное выравнивание последовательностей выполнялось при помощи программы CLUSTAL W (Thompson et al., 1994) и уточнялось вручную с использованием программы PROSEQ, версия 2,4 (Filatov and Charlesworth, 1999). Неравновесие по сцеплению между полиморфными сайтами оценивалось с использованием точного теста Фишера. Компьютерные программы DnaSP, версия 3,4 (Rozas and Rozas, 1999) и PROSEQ использовались для большей части анализов внутривидовой изменчивости. Отклонения от нейтральных ожиданий оценивались с использованием тестов Хадсона и соавторов (Hudson ct al., 1987), Таджимы (Tajima, 1989), Келли (Kelly, 1997) и Волла (Wall, 1999), инкорпорирующих рекомбинацию. Моделирование коалесцентного процесса (Hudson, 1983, 1990), выполнялось при помощи программ DnaSP и PROSEQ для оценки вероятностей наблюдаемых значений статистик D (Tajima, 1989), Z„s (Kelly, 1997), В и Q (Wall, 1999), а также для оценки доверительных интервалов значений нуклеотидного разнообразия. Для обнаружения внутри- и межгенных конверсионных событий использовался метод Сойера (Sawyer, 1989, 1999). Популяционная рскомбинационная частота анализировалась при помощи пермутационного метода Мак-Вина и соавторов (McVean et al., 2002), основанного на коалесцентном подходе Хадсона (Hudson, 2001). Для филогенетических построений использовали программу MEGA2 (Kumar et al., 2001).
Семь исследованных видов Drosophila подгруппы melanogaster подразделяются на три комплекса: (1) melanogaster, представленный D. melanogaster, D. simulans, D. mauritiana и D, sechellia; (2) yakuba, представленный D. teissieri (D. yakuba и D. santomea являются двумя другими видами, входящими в этот комплекс); и (3) комплекс, представленный D. erecta и D. arena (Lemeunier et al., 1986; Cariou 1987; Lachaise et al., 1988,2000). Филогенетические взаимоотношения видов, построенные на основании нуклеотидных последовательностей Est-б и \\iEst Полная длина \\f Est-б варьирует от 1691 до 1711 нуклеотидов. Как и в случае Est-б варьирование обусловлено различиями в числе кодонов в экзоне I (462 - 466 кодонов) и длиной интрона (56-64 нуклеотидов). Длина экзона II у \цEst-б также идентична у всех видов подгруппы melanogaster. Единственное отличие обнаружено для второго экзона у D. miranda (подгруппа obscurd). Конечный стоп-кодоп у этого вида (вероятно, TAG) мутировал в смысловой код он, кодирующий глутамин (CAG). В результате появился "хвост" из семи дополнительных аминокислот (QRCLIFF). Таким образом, из приведенных сопоставлений видно, что экзон II более консервативен, чем экзон I; его длина одинакова даже у видов из различных подгрупп Drosophila. Длина у Est-б несколько больше, чем длина Est-б. Выявлено варьирование длины \fEst-б и ортологичного гена Est-5A на популяционном уровне. Значения длин как Est-б, так и yEst-б в комплексе melanogaster несколько меньше, чем в комплексахyakuba и erecta + orena (табл. П.
Структура гаплотипок и дифференциация популяций
Est-б и yEst-б, Дивергентные группы гаплотипов обнаружены как для Est-6 (включая 5 -фланкирующую область), так и для \у Est-б во всех исследованных выборках D. melanogaster (рис, П. 1). Гаплотипы обозначены в соответствии с Rsa\-/Rsa\+ промоторным полиморфизмом (позиция 653) и F/S аллозимным полиморфизмом (позиция 1959) (рис. П. 1). Частотное распределение гаплотипов в неафриканских выборках является весьма асимметричным: из 66 последовательностей 52 принадлежат к S гаплотипу и 48 принадлежат к Rsa\-гаплотипу. Гаплотипный тест (Hudson et al., 1994) выявляет статистически существенный избыток (Р 0,05) почти идентичных гаплотипов для выборок из Северной и Южной Америки (при исключении очевидно рекомбинантных последовательностей); для европейской выборки этот тест несущественен. Распределение изменчивости также асимметрично для разных групп гаплотипов. Так, в промоторной области уровень полиморфизма в шесть раз ниже для Rsal- (л = 0,00И) гаплотипов, чем для Rsal+ (ті = 0,0067); в кодирующей области изменчивость S гаплотипов (п = 0,0030) в два раза ниже, чем F гаплотипов (я = 0,0070) (популяция Венесуэлы не учитывалась, поскольку в ней отсутствуют гаплотипы). В обоих случаях различия существенны при коалесцентном моделировании (табл. П. 7). Неравномерное распределение численности и степени отличия гаплотипов отчетливо выявляется на рис. П. 3 и П. 4, где представлены одношаговые сети гаплотипов, построенные отдельно для промотори ой (рис. П. 3) и кодирующей (рис. П. 4) области Est-6.
Тест Таджимы (Tajima, 1989) выявил существенное отклонение от нейтральности для Rsal- (Г = -1,742; Р 0,001) и S ( = -1,408; Р 0,05) гаплотипов (табл. П. 7). Негативные значения D статистики Таджимы означают эксцесс полиморфизма, сегрегирующего при низкой частоте. В совокупности эти наблюдения позволяют предположить, что Rsal- и S гаплотипы независимо эволюционировали под влиянием направленного отбора, поскольку они гораздо менее изменчивы, но значительно чаще встречаются, чем Rsal+ и F гаплотипы. Направленный отбор, однако, не приводит к фиксации Rsal- и S гаплотипов в неафриканских популяциях, так как балансирующий отбор поддерживает обе группы дивергентных гаплотипов (Rsal-/Rsal+ и F/S) в промоторе и кодирующей области (см, ниже).
Если благоприятные мутации располагаются в одном и том же сегменте ДНК, включающем промоторную и кодирующую область, тогда соответствующий гаплотип будет эволюционировать под действием отбора, направленного на две независимы мишени. Соответственно, данные гаплотипы будут испытывать двойной эффект селективного свипа (гаплотипы "двойного свипа"). Эффект селективного свипа (от английского "sweep" - выметание, чистка) заключается в том, что происходит снижение изменчивости в области, непосредственно окружающей мутацию, на которую воздействует направленный отбор. Как ожидается, гаплотипы "двойного свипа" имеют наибольшую численность, но наименьшую изменчивость (за исключением южноамериканской выборки) на протяжении всей длины исследованного сегмента ДНК (табл. П. 7). Выборка из Венесуэлы является уникальной в том смысле, что в ней отсутствуют F гаплотипы (рис. П. 1). Интересно, что эта выборка также не имеет S аллеля по локусу Sod (Hudson et al., 1994). Остальные гаплотипы, имеющие лишь одну мутацию, на которую воздействует направленный отбор (гаплотипы "одинарного" свипа), расположенную в промоторе или в кодирующей области, либо не имеющие таковых мутаций, встречаются реже, но имеют более высокую изменчивость, чем гаплотипы "двойного свипа" (табл. П. 7).
Мы показали, что различные формы естественного отбора действуют независимо на функционально важные сайты, расположенные в промоторной и кодирующей области Est-б. Тем не менее, эти селективные процессы взаимосвязаны. На рис. П. 5 приведена одношаговая сеть гаплотипов, построенная на базе промотора и экзона I Est-б. Видно, что концентрация F гаплотипов поддерживается отбором в промоторной области (компартмент Rsal-/F), тогда как концентрация Rsa\+ гаплотипов (компартмент Rsal+IS) поддерживается отбором в кодирующей области. Данное наблюдение противоречит выводу Одгерса и соавторов (Odgers etal., 1995), которые отвергают возможность формирования широтного клина аллозимов Est-б за счет эффекта "попутного транспорта" (hitchhiking effect), обусловленного отбором на промоторную область. Из полученных результатов видно, что широтные клины могут генерироваться за счет взаимодействия селективных процессов в промоторе и кодирующей области, а также частотой рекомбинации между ними. Это обусловлено тем, что S гаплотипы эволюционируют под влиянием как ДВОЙНОГО (компартмент Rsal-/S)t так и одинарного свипа (компартмент Rsa\+/S), тогда как F гаплотипы эволюционируют под влиянием только одинарного свипа (компартмент Rsal-fF). Следовательно, соотношение аллозимных вариантов F и S будет определяться отбором не только на кодирующую, но и на регуляторную область Est-6.
Деревья, включающие все исследованные популяции и построенные на базе полного (3-эстеразного кластера, а также промоторной последовательности Est-б и кодирующих областей Est-б и \\iEsl-6 представлены на рис, П. б - П. 9. Деление между гаплотипами не полностью соответствует аллозимной изменчивости Est 6. Верхний кластер (от линии ER-S-581F до линии Zim-S-44F), состоящий из 42 очень сходных последовательностей включает только S гаплотипы (за исключением трех F гаплотипов, Bar-F-77F, ER-F-611F и Zim-F-НЗ І), но остальные 36 последовательностей включают как F, так и S гаплотипы (рис. П. 1, П. б). Если мы ограничим анализ только кодирующими областями, то соответствие несколько лучше для Est-б (рис. П. 7), чем для \yEst-6 (рис. П. 8). Дерево, построенное на базе промоторной области, содержит два кластера, полностью ассоциированные с Rsal полиморфизмом (рис, П. 9), но не соответствующие F/S аллозимной изменчивости Est-б. Первый кластер (от линии ER-S-174F до линии Bar-F-77F) включает Rsa\- гаплотипы; тогда как второй кластер (от линии ER-S-255S до линии Zim-F-H27) включает R$al+ гаплотипы (рис. П. 1, П. 9). Следует отметить также отсутствие географической структуры: гаплотипы распределены безотносительно к их географическому происхождению.
Сравнительная характеристика функционально связанных генов
Коллет и ее соавторы (Collet et а!., 1990) предположили, что Est-P является функциональным геном, основываясь на ряде признаков, таких как транскрипционная активность, интактные сайты сплайсинга, отсутствие преждевременных стоп-кодонов, присутствие кодопов инициации и терминации. Однако, исследовав небольшую выборку (10 линий) D. melanogaster из Северной Америки (Калифорния), мы (Balakirev and Ayala, 1996) обнаружили преждевременные стоп-кодоны и выявили другие признаки, указывающие на то, что Est-P может являться псевдогеном, который мы обозначили как \yEst-6. Думанцик и ее соавторы (Dumancic et al., 1997) показали, что некоторые аллели Est-P продуцируют каталитически активную эстеразу, соответствующую ранее идентифицированному изоферменту EST-7 (Healy et al„ 1991), и в соответствии с этим переименовали ген в Est-7.
Мы продолжили сравнительное исследование yEst-б и Est-б, увеличив число линий (до 78) и популяций D. nielanogaster (добавлены образцы из Африки, Европы и Южной Америки) (Balakirev et al., 1999, 2002, 2003; Balakirev and Ayala, 2003a, 2003b, 2003c), а также включив анализ энтропии с использованием спектральных методов (см. обзор и дополнительные ссылки в работе В. В, Лобзина и В. Р.Чечеткина (2000)). В результате исследования обнаружены существенно различающиеся характеристики нуклеотидиой изменчивости у yEst-6 и Est-б. Преждевременные стоп-кодопы в пределах кодирующей области \\iEst-6 выявлены, помимо североамериканской выборки, также и в европейской выборке (Барселона, Испания) D. melanogaster. Общий уровень нуклеотидиой изменчивости оказался в 2.1 раз выше у MfEst-б, чем у Est-б. Отношение синонимичных нуклеотидных замен к несинонимичным заменам составило 0.599 для Est-б и 1.2 для у Est-б. Популяционная частота рекомбинаций у \yEst-6 в 2,6 раз ниже, чем у Est-б (последнее различие наблюдается только в неафриканских выборках). Неравновесие по сцеплению более выражено в \yEst-6, чем в Est-б. Существенное неравновесие по сцеплению выявлено и между генами. Генная конверсия обнаружена в пределах как Est-б, так и (значительно чаще) \\fEst-6, но редко происходит между генами. Структура гаплотипов сложная и представлена дивергентными наборами сходных аллелей; дивергентные последовательности по двум генам, однако, не конгруэнтны.
Полученные данные указывают на то, что Mf Est-б может быть псевдогеном: 17 преждевременных стоп-кодонов на 78 исследованных последовательностей вряд ли совместимы с выводом о функциональности кодируемого белка; число аминокислотных замещений, обнаруженных у yEst-б, в три раза выше, чем у Est- и некоторые из них являются радикальными (рис. П. 26); анализ энтропии выявил значительно более низкую структурную регулярность и более высокую структурную дивергенцию для у Est-б, что соответствует ожиданию для псевдогена (Balakirev et al., 2003, 2005). Однако, как отмечено выше, ген экспрессируется (Collet et al., 1990) и некоторые аллели продуцируют каталитически активную эстеразу (Dumancic et al., 1997), выявляемую на стадиях поздней личинки и у взрослых особей обоих полов, тогда как транскрипты функционального гена Est-б обнаруживаются на всех стадиях жизненного цикла, но в основном у взрослых самцов (Collet et al., 1990; Dumancic et al., 1997), что соответствует значительной роли EST-6 в репродуктивной биологии (Richmond et al., 1980; Gromko et al., 1984). Более того, у \yE$t-6 скорость синонимичных замещений выше, чем скорость несинонимичных, а тесты на нейтральность являются статистически существенными. Таким образом, характеристики нуклеотидной изменчивости, рекомбинации и неравновесия по сцеплению указывают на то, что молекулярная эволюция \yEst-6 подвергается селективным ограничениям (Balakirev et al., 2003; Balakirev and Ayala, 2003a, 2003b) и, как обнаружено для многих псевдогенов у Drosophila и других организмов, \yEst-6 проявляет особенности как функциональных, так и нефункциональных генов. Мы предположили (Balakirev and Ayala, 2003а, 2003b), что межгенный эпистатический отбор может играть важную роль в эволюции Р-эстеразного генного кластера у Д melanogastery предохраняя \\tEst-6 от дегенеративной деструкции и отражая возможное функциональное взаимодействие между геном Est-б и предполагаемым псевдогеном \yEst-6 (например, регуляторное взаимодействие, Healy et al. 1tin и bap. Обнаружены существенные различия уровня и паттерна нуклеотиднои изменчивости у двух тесно сцепленных гомеобокс-содержащих генов tin и bap у D. melanogaster. Уровень изменчивости гена tin находится в пределах значений, наблюдаемых у других регуляторных генов Drosophila (Moriyama and Powell, 1996; Powell, 1997; Baines et al., 2002; Riley et al., 2003) и некоторых других организмов (Purugganan, 2000). Уровень молчащей изменчивости гена bapсущественно выше и приближается к значениям, наблюдаемым для наиболее полиморфных генов Drosophila, таких как Est-б и vfEst-б (см. разделЗ. 1). Паттерн нуклеотиднои изменчивости tin и bap не совместим с равновесной моделью селективной нейтральности. Мы полагаем, что колонизационная и демографическая история D. melanogaster, наряду с негативным (очищающим) ,. отбором могут быть основными факторами, формирующими наблюдаемые паттерны нуклеотиднои изменчивости. Данные для гена bap предполагают, что позитивный отбор также может привносить существенный вклад в наблюдаемые паттерны: диверсифицирующий отбор увеличивает уровень нуклеотиднои изменчивости, тогда как направленный отбор обусловливает существенный избыток почти идентичных последовательностей. Позитивный отбор в гене bap подтверждается результатами ряда тестов па нейтральность (Hudson et al., 1987; McDonald, 1996, 1998; Hudson etal., 1994; Depaulis and Veuille, 1998). Выше мы показали, что паттерн нуклеотиднои изменчивости кодирующей области Est-б формируется под влиянием направленного и балансирующего отбора (см. разделы 3. 3 и 3.4). Сходное мнение высказано при анализе изменчивости локуса Adh у Arabidopsis thaliana (Hanfstingl et al., 1994), гена Acp29AB у D. melanogaster (Aguade, 1999) и регуляторного гена TFL1 у Arabidopsis thaliana (Olsen et al., 2002). Тем не менее, результаты тестов на нейтральность должны интерпретироваться с осторожностью, учитывая небольшой размер выборки последовательностей из единичной популяции (Simonsen et al., 1995). Более того, ряд неселективных факторов, таких как, эффект бутылочного горлышка, эффект основателя, смешивание разнородных популяций и варьирующая частота рекомбинации в различных областях генома, также могут частично обусловливать паттерны полиморфизма tin и bap генов. Один из возможных подходов для различения между селективными и неселективными процессами при формировании нуклеотидных паттернов заключается в исследовании множественных природных популяций D. meianogaster.
