Геномное исследование гетерохроматина политенных хромосом Drosophila melanogaster Белякин Степан Николаевич

Содержание к диссертации

Введение

1. Введение 3

1.1. Актуальность проблемы 3

1.2. Цель работы 4

1.3. Научная новизна 5

1.3. Практическая ценность 5

1.4. Апробация работы 6

1.5. Список публикаций по теме диссертации 6

2. Гетерохроматин в политенных хромосомах 8

2.1. Прицентромврныи гвтерохроматин политвнных хромосом слюнных желез, 8

2.1.1. Молекулярный состав ПГХ 9

2.2. Интеркалярный гвтерохроматин 20

2.3. Репликация и транскрипционная активность гетврохроматина 22

2.4. Заключение 24

3. Материалы и методы 27

3.1. Линии мух 27

3.2. Микроклонирование 27

3.3. Гибридизация in situ 28

3.4. Саузерн-блот гибридизация 29

3.5. Гибридизация и анализ микрочипов 30

3.6. Выявление районов недорепликации 30

3.7. Выявление транскрипционных территорий З ]

4. Результаты и обсуждение 32

4.1. Анализ районов прицентромерного гетврохроматина 32

4.2. Анализ районов интеркалярного гетврохроматина 43

4.3. Выводы 67

6. Список цитируемой литературы

• Актуальность проблемы
• Практическая ценность
• Репликация и транскрипционная активность гетврохроматина
• Линии мух

Введение к работе

1,1. Актуальность проблемы

В последнее время широко обсуждается вопрос о корреляции между временем репликации ДНК в S-фазе клеточного цикла и экспрессией генов: например, геномное исследование временного паттерна репликации в культуре клеток показало, что в культуре клеток Кс дрозофилы ранняя репликация в S фазе ассоциируется с активным состоянием генов (Schuebeler et al., 2002). Амплификация хорионовых генов в фолликулярных клетках дрозофилы и тканеспецифичная регуляция кластера р-глобиновых генов у млекопитающих также представляют интерес в рамках совместной регуляции репликации и экспрессии генов.

В норме, в политенных хромосомах слюнных желез D. melanogaster поздняя репликация во многих случаях приводит к недорепликации поздно реплицирующихся районов (Zhimulev, 1998). При этом помимо прицентромерных районов, состоящих преимущественно из разнообразных повторов, около 60 сайтов в эухрсматиновых плечах политенных хромосом, демонстрируют недорелликацию (Zhimulev et al., 2003а). Такие районы имеют ряд характеристик, свойственных прицентромерному гетерохроматину (ПГХ), поэтому получили название интеркалярного гетерохроматина (ИГХ). Один из районов ИГХ, 89DE был ранее охарактеризован с помощью Саузерн-блот гибридизации, и было показано, что зона недорепликации имеет протяженность 300-400 т.п.н., а ДНК может иметь представленность менее 5% по сравнению с рано реплицирующимся геном rosy (Moshkin et al., 2001). Если эухроматиновая часть генома дрозофилы содержит 120 м.п.н., а среднюю длину зоны недорепликации принять за 300 т.п.н., то около 15% ДНК, не считая прицентромерного гетерохроматина, значительно недореплицируется в слюнных железах D. melanogaster.

Районы ИГХ могут быть прекрасной моделью для изучения связи между репликацией и экспрессией генов. Однако генетически эти районы

«

фактически не охарактеризованы. Необходимо выяснить, какие гены находятся в этих районах, как они экспрессируются и т.д. Для решения этой задачи мы использовали уникальные свойства гена Su(UR) (Suppressor of Underreptication).

Мутация гена Su(UR) приводит к исчезновению разломов в политенных хромосомах и к частичной политенизации ПГХ. Саузерн-блот анализ показал восстановление представленности ДНК до 100% во всех исследованных районах недорепликации (Belyaeva et al., 1998). Таким образом, продукт гена Su(UR) может рассматриваться как транс-фактор, специфически контролирующий позднюю репликацию в геноме дрозофилы, по меньшей мере, в тканях с политенными хромосомами.

Дополнительные, трансгенные копии гена Su(UR), вызывают усиление недорепликации в районах, образующих разломы, а также появление ее в поздно реплицирующихся районах, лишенных недорепликации в норме.

Поскольку ген Su(UR) имеет такое уникальное проявление, он может быть использован как инструмент для изучения явления поздней репликации в политенных хромосомах и организации районов интеркалярного и прицентромерного гетерохроматина. Сравнение уровня политенизации в линиях с разными дозами гена Su(UR) поможет выявить в геноме дрозофилы зоны недорепликации и определить их генетическое содержание.

1.2, Цель работы

Целью данной работы является изучение молекулярных свойств и генетического состава прицентромерного и интеркалярного гетерохроматина в слюнных железах D. melanogaster.

В связи с этим были поставлены следующие задачи: Приготовить библиотеку микроклонов и охарактеризовать

молекулярный состав прицентромерных районов политенных

хромосом линии Su(UR)'.

Определить границы недореплицированных областей в районах интеркалярного гетерохроматина и построить геномную молекулярную карту недорепликации.

Проанализировать генетическое содержание недореплицированных районов.

1.3. Научная новизна

Впервые описаны последовательности из прицентромерных районов, политенизирующихся у мутантов Su(UR)'. В ходе этой работы были прокартированы цитологически несколько протяженных участков ДНК, которые не были прокартированы в рамках проекта по секвенированию генома Drosophila melanogaster. Впервые построена точная молекулярная карта политенизации, на которой нанесены 52 протяженных района недорепликации, на всех длинных плечах хромосом дрозофилы. Проведено обобщение нескольких наборов данных, полученных разными авторами, касающихся репликации и экспрессии генома дрозофилы, что позволило сделать вывод об обогащении районов недорепликации генами, специфически коактивируемыми в клетках зародышевого пути самцов дрозофилы. Предложен новый принцип организации генома D. melanogaster - кластеризация генов в поздно реплицирующихся областях, облегчающая их совместную регуляцию.

1.3. Практическая ценность

Определено генетическое содержание части прицентромерного гетерохроматина. Построена геномная карта политенизации ДНК в слюнной железе D. melanogaster, на основании которой определены границы и генетический состав 52 районов интеркалярного гетерохроматина, содержащих 1036 генов, что позволяет исследовать содержащиеся в них гены и особенности репликации ДНК.

1.4. Апробация работы

Основные результаты этой работы были представлены:

На Международных Студенческих Конференциях 2000 и 2001 годов

На V и VI международных конференциях по гетерохроматину 2001 и 2003

годов.

На XIII Всероссийском симпозиуме «Структура и функции клеточного ядра»,

Санкт-Петербург, 2000.

На Съезде ВОГиС, Москва, 2004 г

1.5. Список публикаций по теме диссертации

1. Белякин С.Н., Мошкин Ю.М., Рубцов Н.Б., Кокоза Е.Б., Спирер П., Жимулев И.Ф. Анализ последовательностей ДНК из районов прицентромерного гетерохроматина в линии Su(UR)ES у Drosophila meianogaster. (Тезисы на XIII Всероссийском симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (Санкт-Петербург, октябрь, 2000) Цитология 42, 264-265 (Тезисы))-

2. Koryakov D.E., Domanitskaya E.V., Kolesnikova T.D., Belyakin S.N., Belyaeva E.S., Semeshin V.F. and Zhimulev I.F. (2001). Genetic control of heterochromatin differential polytenization in Drosophila. Chromosome Research 9, S1,122-123 (Тезисы).

3. Belyakin S.N., Moshkin Yu. M., Rubtsov N.B., Semeshin V.F., Kokoza E.B., Alekseyenko A.A., Volkova E.I., Belyaeva E.S., Makunin IV., Spierer P., Zhimulev I.F. Cloning and charachterization of DNA of the Plato Atlantis region in polytene chromosomes of the Su(UR)ES mutant. Fifth International Conference on Drosophila heterochromatin, June 18-22, 2001, Cortona, Italy (Тезисы).

4. Koryakov D.E., Domanitskaya E.V., Kolesnikova T.D., Belyakin S.N., Belyaeva E.S., Semeshin V.F., Zhimulev I.F. Genetic control of heterochromatin differential polytenization in Drosophila. Fifth International Conference on Drosophila heterochromatin, June, 2001, Cortona, Italy (Тезисы).

5. Moshkin Yu. M., Belyakin S.N., Rubtsov N.B., Kokoza E.B , Alekseyenko A.A., Volkova E.I., Belyaeva E.S., Makunin I.V., Spierer P., Zhimulev I.F. (2002). Microdissection and sequence analysis of pericentric heterochromatin from the Drosophila melanogaster Suppressor of underreplication mutant. Chromosoma 111:114-125.

6. Koryakov D.E. Domanitskaya E.V., Belyakin S.N., Zhimulev !.F. (2003) Abnormal tissue-dependent polytenization of a block of third chromosome pericentric heterochromatin in Drosophila melanogaster. J Cell Sci 2003, 116, 1035-1044

7. Belyakin, S.N., Christophides, G.K., Alekseyenko, A.A., Nanayev, R.A., Boldyreva, L.V., Belyaeva, E.S., Makunin, I.V., Para, R., Kafatos F.C., Zhimulev, I.F. Microarray analysis of under-replication in salivary gland of Drosophila melanogaster June, 2003, Ravello, Italy (Тезисы).

8. Zhimulev I.F., Belyaeva E.S., Makunin I.V., Pirrotta I. V., Semeshin V.F., Alekseyenko A.A., Belyakin S.N., Volkova E.I., Koryakov D.E., Andreyeva E.N., Demakova O.V., Kotlikova I.V., Kolesnikova T.D., Boldyreva L.V., Nanayev R.A. (2003) Intercalary heterochromatin in Drosophila melanogaster polytene chromosomes and the problem of genetic silencing. Genetica, 117, 259-270.

9. Белякин C.H., Колесникова Т.Д., Макунин И.В., Волкова Е.И., Алексеенко А.А., Нанаев Р.А., Болдырева Л.В., Беляева Е.С., Жимулёв И.Ф. Интекалярный гетерохроматин в политенных хромосомах D. melanogaster и проблема генетического сайленсинга. Съезд ВОГиС, Москва, июнь, 2004 г. (Тезисы).

10.S.N. Belyakin, G.K. Christophides, A.A. Alekseyenko, E.V. Kriventseva, E.S. Belyaeva, R.A. Nanayev, IV. Makunin, Heidelberg Fly Array Consortium, F.C. Kafatos and I.F. Zhimulev (2005). Genomic analysis of DNA underreplication in Drosophila polytene chromosomes reveals a link between replication control and transcriptional territories. Proc Nat Acad Sci, принято к публикации

2. ГЕТЕРОХРОМАТИН В ПОЛИТЕННЫХ ХРОМОСОМАХ (Обзор литературы)

В политенных хромосомах дрозофилы выделяют два типа гетерохроматина - прицентромерный (далее ПГХ) и интеркалярный гетерохроматин (ИГХ), ПГХ располагается в основаниях плеч хромосом, а районы ИГХ рассеяны по геному и чередуются с длинными эухроматиновыми участками. Оба типа гетерохроматина проявляют позднюю репликацию в слюнных железах личинок дрозофилы. Из-за особого типа клеточного цикла (эндоцикл), характерного для тканей с политенными хромосомами, в котором одна S фаза следует за другой без расхождения гомологов, поздняя репликация во многих случаях приводит к недорепликации, которая является характерным признаком гетерохроматина. ПГХ политенных хромосом слюнных желез занимает 1 -2% общей длины хромосом по сравнению с 30% в митотических хромосомах, а в районах ИГХ недорепликация приводит к возникновению разломов хромосом, или слабых точек, с частотой, характерной для каждого района.

2.1. Прицентромерный гетерохроматин политенных хромосом слюнных желез

Прицентромерные районы всех плеч политенных хромосом слюнных дрозофилы объединяются в хромоцентр, в котором можно выделить две структуры: а- и р-ГХ. а-ГХ представляет собой плотное компактное тело, а р-ГХ - это бесструктурное сетчатое образование, к которому присоединены плечи хромосом (Heitz, 1934, цит. по: (Zhimulev, 1998). Была предложена модель организации ПГХ, согласно которой р-ГХ представляет собой промежуточную зону между митотическим эу- и гетерохроматином, которая имеет сходную с эухроматином плотность генов и степень политенизации в ПХ, но обогащена некоторыми специфическими повторенными последовательностями {Dr. D.) и связывается со специфическими белками (Miklos and Cotsell, 1990). Однако некоторые участки даже в глубоком

гетерохроматине имеют высокую степень политенизации, сравнимую с представленностью эухроматиновых последовательностей (Berghella and Dimitri, 1996; Dimitri, 1997; Zhang and Spradling, 1995). Таким образом, ПГХ неоднороден по представленности разных его участков в политенном ядре.

2.1.1. Молекулярный состав ПГХ

В состав ПГХ, согласно определению, данному А.А. Прокофьевой-Бельговской (Прокофьева-Бельговская, 1986), входят высоко и средне повторенные последовательности. Под первыми следует понимать сателлитную ДНК, располагающуюся кластерами до нескольких миллионов пар нуклеотидов в прицентромерном гетерохроматине. Фракция средне повторенных последовательностей состоит из различных типов ДНК: неактивных мобильных элементов, повторенных функциональных последовательностей и других последовательностей, функции которых не известны. Кроме того, в ГХ были обнаружены гены. Их плотность примерно в 100 раз ниже, чем в эухроматине, что было показано с помощью анализа индуцированных мутаций (Hilliker et al., 1980). Однако согласно последним данным геномного проекта, в гетерохроматиновой части генома дрозофилы предсказано наличие около 450 генов (Hoskins et al., 2002).

2.1.1.1. Сателлиты

Значительную часть - около 20% генома и, соответственно, около 70% ПГХ Drosophila melanogaster занимают простые тандемно повторенные последовательности или сателлиты (Lohe and Brutlag, 1986). Изначально сателлитная ДНК была выделена как дополнительные (сателлитные) пики 1.672, 1.686, 1.688 и 1.705 г/мп при центрифугировании геномной ДНК в градиенте плотности CsCI. Эксперименты по ренатурации ДНК D. hydei и других видах показали, что 20% ДНК, выделенной из куколок и эмбрионов, составляют быстро ренатурирующие, а 80% - медленно ренатурирующие уникальные последовательности. В слюнной железе фракция медленно ренатурирующих последовательностей сохраняется,

однако резко снижено содержание быстро ренатурирующих (до 4-5%). Центрифугирование в градиенте плотности CsCI показало, что различие в ДНК куколок и слюнных желез выявляется только в содержании сателлитной ДНК, количество которой в слюнной железе в 4 - 5 раз ниже, чем в куколках. Эти данные свидетельствуют о сильной недорепликации сателлитной ДНК, которая расположена в ПГХ (Cordeiro et al., 1975; Dickson et al., 1971; Endow and Gall, 1975; Lohe et al., 1993).

В дальнейшем в составе сателлитных пиков было обнаружено несколько типов повторов, и для некоторых из них были определены последовательности нуклеотидов (Endow et al., 1975). Наиболее распространенными сателлитными последовательностями являются ААТАТ (1.672), занимающий 3% генома, AAGAG и AAGAGAG (1.705) - 6% и 1.5% генома соответственно, AAGAC (1.686) - 2.4%, AATAACATAG (1.686) -2% (Lohe et al., 1993). Главной составляющей сателлита 1.688 является повтор, состоящий из 359 п.н. Его доля в геноме 4% (Hsieh and Brutlag, 1979).

Основная часть сателлита 359 п.н. расположена в гетерохроматине Х-хромосомы; кроме этого, наблюдали мечение хромосом 2 и 3, но не 4 и У (Koryakov et al., 1999; Lohe et al., 1993). Предполагается, что аутосомная локализация этого сателлита может быть связана с присутствием последовательностей, гомологичных ему на 63-81%, которые были найдены также во многих сайтах в эухроматине. Например, в районах ЗС и 10Е1-2 они представлены трактами из 2-4 копий, и наиболее распространенными гомологами являются повторы из 254 и 353 п.н. (DtBartolomeis et al., 1992).

Кроме описанных последовательностей в геноме D. melanogaster присутствуют малокопийные, так называемые минорные сателлиты, составляющие лишь 0.1 - 0.5%. Те из них, которые удалось прокартировать, были локализованы в различных сайтах на У-хромосоме (Loheetal., 1993).

Обособленно стоит додекасателлит, G+C-богатая

последовательность из 11-12 нуклеотидов, которая была выделена в

результате клонирования гетерохроматина минихромосомы Dp(1;f)1187 (Abad et al., 2000; Abad et al., 1992). Гибридизация in situ на митотических хромосомах показала, что основной сайт локализации этого повтора находится в правом плече хромосомы 3, вблизи центромеры. В политенных хромосомах он имеет 1 сайт локализации в хромоцентре. Было показано, что эта последовательность очень консервативна как у видов рода Drosophila, так и у многих других организмов (Carmena et al., 1993). Предполагается участие додекасателлита в расхождении хромосом в митозе и формировании центромеры.

Как кажется, сателлитная ДНК не транскрибируется и не несет кодирующей функции. Однако в первичных сперматоцитах была обнаружена транскрипция повтора AAGAC, входящего в состав генов, кодирующих так называемые факторы фертильности М-5 и ks-1, расположенных в У-хромосоме самцов и образующих характерные петлеобразные структуры (Bonaccorsi et al., 1988). Эксперименты in situ показали наличие транскриптов, гибридизующихся с сателлитом AAGAC. Эти транскрипты на всем протяжении развития петель оставались плотно с ними ассоциированными и исчезали вместе с ними. Было показано, что повтор (AAGAC)_n, не входящий в состав названных участков У-хромосомы, не транскрибируются. Нозерн-блот эксперименты подтвердили наличие транскрипции этого сателлита в первичных сперматоцитах нормальных самцов (XV) и ее отсутствие у самцов Х0. При этом у нормальных самцов показано наличие транскриптов от сотен до тысяч пар нуклеотидов в длину. Предполагается, что они участвуют в формировании особых комплексов с белками, необходимых для нормального функционирования соответствующих факторов фертильности, В сперматоцитах самцов Х0 обнаружены гранулы, состоящие из белков, которые, как предполагается, могут принимать участие в формировании таких комплексов (Bonaccorsi et al.,1990).

По данным делеционного анализа минихромосомы Dp(1;f)1187, около 200 т.п.н. сателлита ААТАТ являются необходимыми для нормального

функционирования центромеры и передачи при клеточном делении (Murphy and Karpen, 1995).

2.1.1.2. Мобильные элементы

Показано, что гетерохроматиновые районы обогащены умеренно повторенной ДНК, в том числе мобильными элементами (Lone and Hrlliker, 1995). Почему мобильные элементы накапливаются в ПГХ? На этот счет существует несколько гипотез. Есть, например, данные, что гетерохроматин обогащен так называемыми "горячими точками" встраивания многих мобильных элементов. Другое предположение состоит в том, что вследствие низкой плотности генов в ПГХ понижена вероятность повреждения этих генов, что значительно ослабляет отбор таких встроек. Недавно возникло еще одно предположение относительно накопления мобильных элементов в ПГХ. На дрожжах было показано, что двуцепочечные разрывы ДНК этих организмов могут быть репарированы путем встройки мобильного элемента. Предполагается, что в гетерохроматиновых районах частота таких повреждений выше, а эффективность репарации ниже, чем в эухроматиновых, следовательно, возможно исправление таких дефектов при помощи подобного механизма (Dimitri, 1997).

Гибридизация in situ различных мобильных элементов на митотических хромосомах показала, что многие из них (copia, gypsy, mdg-1, blood, F, Doc, и /) располагаются кластерами в определенных районах ПГХ. G-элемент был обнаружен только в одном районе в гетерохроматине хромосомы 2, как и Вап-1, который картируется в районе гетерохроматиновом сегменте п39 прометафазных хромосом и имеет очень консервативную локализацию в различных линиях мух (Caizzi et а)., 1993). Р и hobo элементы не проявили специфичности к каким-либо районам ГХ, что может объясняться тем, что они проникли в популяции D. melanogaster лишь около 100 лет назад. (Pimpinelli et al., 1995).

Эксперименты по клонированию / и F элементов вместе с прилежащими последовательностями и анализ этих последовательностей показали, что в основном они являются неактивными копиями различных семейств мобильных элементов. Гибридизация in situ показала, что все они локализуются в хромоцентре, р-ГХ, и лишь в немногих сайтах проксимального эухроматина (Vaury et al., 1989),

Рестрикционный анализ минихромосомы Dp(1;f)1187 и ее производных показал наличие "островов" комплексной ДНК в гетерохроматине Х-хромосомы, которые представляют собой участки ДНК, обогащенные сайтами узнавания различных рестриктаз, в отличие от окружающих их блоков сателлитных последовательностей. Они получили названия островов в Тихом океане: Bora-Bora, Tahiti и др. Анализ последовательности небольшого участка одного из островов показал наличие в нем транспозона Doc (Le et al., 1995). По-видимому, эти "острова" обогащены и другими мобильными элементами (Le et al., 1995; Zhang and Spradling, 1995) и, возможно, появились вследствие многих встроек мобильных элементов (Lone and Hilliker, 1995).Анализ Р-элементных встроек в гетерохроматине также показал наличие комплексной ДНК в митотическом гетерохроматине, которая политенизируется в политенных хромосомах слюнных желез (Zhang and Spradling, 1995).

2.1.1.3. Гены

Долгое время гетерохроматиновые районы считались генетически неактивными, однако, во многих работах было показано, что в нем все же содержится небольшое число генов, но их плотность намного ниже, чем в эухроматине (Hilliker et al., 1980). Эти гены работают либо в течение всего онтогенеза, либо только на ранних этапах развития дрозофилы (Wakimoto and Hearn, 1990).

С помощью генетического анализа в гетерохроматине хромосомы 2 по меньшей мере 32 гена (Dimitri, 1991; Hilliker, 1976; Myster et al., 2004; Rollins

et al., 1999). Однако, лишь некоторые из них были изучены с помощью молекулярных методов.

Ген fight находится в дистальном гетерохроматине плеча 2L. Многие аллели этого гена летальны, а у жизнеспособных мутантов нарушена пигментация некоторых тканей {Мальпигиевых сосудов, омматидиев и др.). Эксперименты по "спасению" фенотипа и анализ транскриптов показали, что размер этого гена около 17 т.п.н. В состав этого локуса входят уникальные экзоны и нитроны, обогащенные умеренными повторами (Devlin et al., 1990). Продукт этого гена участвует в белковом транспорте (Warner et al., 1998).

Расположенный рядом с геном It ген concertina кодирует субъединицу G белка и необходим для гаструляции (Parks and Wieschaus, 1991). Этот ген картируется в гетерохроматиновом сегменте h35 (Hoskins et al., 2002).

Ген rotted является аналогом митоген-активируемой протеинкиназы позвоночных и располагается в глубоком гетерохроматине плеча 2R. продукт этого гена играет ключевую роль в передаче клеточных сигналов (Lone and Hilliker, 1995). Его аллель rF^em активирует пути развития, контролируемые такими рецепторными тирозинкиназами как SEVENLESS и эпидермальным фактором роста дрозофилы (Oellers and Hafen, 1996). Гибридизация по Нозерну показала наличие транскриптов, гомологичных гену h в таких тканях, как слюнные железы, нервная ткань и жировое тело.

Мутанты 1(2)41Аа погибают в третьем личиночном возрасте и демонстрируют сильные нарушения в имагинальных дисках (Hilliker, 1976). Поздняя летальность и недоразвитие имагинальных дисков позволили предположить, что этот ген задействован в регуляции клеточного цикла (Gatti and Baker, 1989). Эта мутация нарушает правильную конденсацию хромосом как в митозе, так и в мейозе (Cenci et al., 2003).

Ген l(2)41Ad был картирован в районе И44. Мутация летальна на стадии поздней куколки и вызывает уродства конечностей. Функция этого гена не определена (Dimitri, 1991).

С помощью гибридизации in situ был установлен порядок расположения таких элементов гетерохроматина хромосомы 2 как кластер повторов Bari-1, локус rl и кластер сателлита AAGAC. Оказалось, что ген rl, занимающий около 100 т.п.н., располагается между этими двумя кластерами. Гибридизация in situ уникального зонда из локуса г/, повторов Bari-1 и AAGAC с политенными хромосомами показала, что, несмотря на уникальность, сигнал от гена ri был значительно сильнее, чем в двух других случаях, хотя и отличался от типичной картины гибридизации эухроматиновых зондов. Это говорит о том, что он гораздо сильнее политенизирован, чем рядом расположенные повторенные последовательности. Этот результат был подтвержден гибридизацией по Саузерну, которая показала, что 5 из 9 гибридизующихся с зондом rl фрагментов имеют политенизацию на уровне 90 - 100% и 2 на уровне 70% (Berghella and Dimitri, 1996).

В гетерохроматине хромосомы 3 было обнаружено 13 жизненно важных генов (Marchant and Holm, 1988; Schulze et al., 2001).

Гены t(3)8QFh и f(3)80Fj являются членами группы trithorax, а ген t(3)80Fi оказывает влияние на развитие многих органов дрозофилы (Schulze et al., 2001). Ген PARP, располагающийся в районе h54-55, занимает 150 т.п.н. и за счет альтернативного сплайсинга производит несколько белковых изоформ. Мутации этого гена нарушают структуру хроматина (Tulin et al., 2002). При помощи скрининга библиотек кДНК дрозофилы зондом, выделенным из мыши, был клонирован ген, который кодирует белок а-CATENIN, участвующий в клеточной адгезии. Гибридизация in situ на политенных хромосомах показала, что этот ген располагается в районе 80В, то есть в р-гетерохроматине 31-плеча (Oda et al., 1993). Другой ген - гр-21, кодирующий один из рибосомальных белков, также находится в районе 80 политенных хромосом (Kay et al., 1988). Функции остальных генов в гетерохроматине этой хромосомы остаются неясны.

В гетерохроматине X хромосомы расположен локус bobbed, содержащий кластер рибосомальных генов. В нем располагаются гены 18S,

28S и 5SpPHK

Анализ мутаций, индуцированных рентгеновским излучением, показал наличие генов в полностью гетерохроматиновой У-хромосоме. Все они оказались факторами фертильности самцов и в мутантном состоянии вызывали нарушения сперматогенеза и стерильность самцов. Изначально было показано наличие двух таких генов в S-плече (ks-1 и ks-2) и пяти в L-плече (kl-1 - kl-5) (Brosseau, 1960). Однако, впоследствии наличие фактора kl-4 не было подтверждено. Цитологическим проявлением факторов kl-5, kl-3 и ks-1 являются характерные петлеобразные структуры, наблюдаемые в первичных сперматоцитах. Наличие этих структур зависит от присутствия определенных участков У-хромосомы - около 1300 т.п.н. в случае kl-5 и ks-1 и около 4300 т.п.н. в случае kl-3. Остальные гены У-хромосомы не проявляли таких свойств. Анализ перестроек показал, что факторы фертильности самцов сильно отличаются от эухромати новых генов и от генов, обнаруженных в других гетерохроматиновых районах своими размерами - они занимают многие миллионы пар нукпеотидов (Bonaccorsi et al., 1988). Исследования белков из семенников самцов, несущих различные делеции по У-хромосоме показали, что kl-2, kl-3 и kl-5 кодируют три различных высокомолекулярных белка, которые входят в состав аксонемы спермия (Goldstein et al., 1982).

В результате анализа последовательностей, полученных в рамках геномного проекта дрозофилы, но не вошедших в состав эухроматиновой части генома (в сумме 12 м.п.н.), были построены компьютерные модели еще для 267 белок-кодирующих генов; кроме этого, цитогенетический анализ показал, что 150 генов, предсказанных при аннотации эухроматиновой части генома, в действительности находятся в гетерохроматине (Hoskins et al., 2002).

Прицентромерный гетерохроматин способен инактивировать эухроматиновые гены, перенесенные в него хромосомными перестройками. Это явление известно как "эффект положения мозаичного типа" (ЭПМ).

Гетерохроматиновые гены также способны испытывать эффект положения при перенесении их в эухроматин. Так, перестройки, переносящие ген It и другие гены плеча 2L в эухроматиновое окружение, приводили к их инактивации. Добавление /-хромосомы усиливает этот эффект (Wakimoto andHearn, 1990).

Для гена г! были проведены эксперименты, направленные на выявление эффекта положения при перенесении его в эухроматиновое окружение. Однако этот ген находится в глубоком ГХ плеча 2R, поэтому при применении одиночных транслокаций эффекта положения для гена г! не наблюдали. Было предположено, что это происходит из-за того, что переносится слишком большой блок ГХ, который поддерживает нормальную экспрессию. При помощи двойных перестроек, удаляющих часть ГХ от гена г/, удалось получить линии с эффектом положения. Есть свидетельства, что остальные 5 генов из гетерохроматина плеча 2R ведут себя аналогично. Возможно, сателлитная ДНК создает необходимое окружение для нормального функционирования гетерохроматиновых генов (Eberl et al., 1993). В дальнейшем было показано, что эффект положения гена П сопровождается снижением содержания его мРНК в таких тканях, как глазные и крыловые имагинальные диски (Lone and Hilliker, 1995).

Кроме того, в гетерохроматине присутствуют такие последовательности как Responder (Rsp), который входит в систему Segregation Distorter, отвечающую за мейотический драйв (Ganetzky, 1977). Этот локус представляет собой А+Т-богатый повтор и проявление мутантного фенотипа зависит от числа копий этого повтора. Локус Rsp располагается в районе h39 митотических хромосом.

Сходная картина наблюдается и для элементов АВО, которые располагаются кластерами в хромосомах X, У и 2 (Gatti and Pimpinelli, 1992).

2.1.1.4. Белки

Прицентромерный гетерохроматин представляет собой особую структуру как в митотических, так и в политенных хромосомах. Это

предполагает специфический молекулярный состав, в том числе и белковый.

Из эмбрионов D. melanogaster выделен белок, который специфически связывается с сателлитом 359 п.н. Образование комплекса происходит при физиологической ионной силе раствора и температуре, но он остается стабильным и в присутствии высоких концентраций соли. Показано, что для образования комплекса ДНК должна быть суперспирализована. Сайт связывания прокартирован в сателлите 359 п.н. (Hsieh and Brutlag, 1979).

Еще один хромосомный негистоновый белок D1 (50 kD), выделенный из ядер эмбрионов, связывается с сателлитной последовательностью 359 п.н. Показано также, что он входит в состав нуклеосом, содержащих последовательность ААТАТ (Rodriguez Alfageme et al., 1980) и вообще связывается с А+Т-богатыми последовательностями in vitro. Это один из наиболее распространенных ядерных белков, обладающих этим свойством. Предполагается возможность его участия в компактизации А+Т-богатого хроматина и в образовании комплекса с микротрубочками во время митоза. Кроме того, он может препятствовать присоединению других А+Т-специфичных белков, таких как РНК-полимераза или регуляторные белки. (Levinger and Varshavsky, 1982а). Предполагается участие этого белка в компактизации сателлит-содержащего гетерохроматина (Levinger and Varshavsky, 1982b).

У мутантов по гену proliferation disrupter (prod) наблюдаются многочисленные нарушения расхождения хромосом и конденсации хроматина в делящихся клетках. Неправильная конденсация наблюдалась в основном около центромер. Продукт этого гена - белок из 301 а.к. присутствует повсеместно и концентрируется в прицентромерных районах хромосом 2 и 3 и в более 400 сайтов в эухроматине политенных хромосом Предполагается участие этого белка в формировании необходимой для нормального функционирования структуры центромер (Torok et al., 1997).

В последнее время активное развитие получила идея "гистонового кода". Хотя белкичгистоны присутствуют по всей длине хромосом, гистоны,

находящиеся в гетерохроматине, отличаются от "эухромати новых" гистонов рядом посттрансляционных модификаций N-концевых участков молекул гистонов, что имеет существенное значение для функционирования хроматина (Strahl and Atlis, 2000). Так, было показано, что транскрипционно активный хроматин обогащен ацетилированными гистонами, что создает "открытую" структуру хроматина, в то время как гетерохроматиновые пистоны в значительной степени гипоацетилированы. Впоследствии оказалось, что модификации N-концевых участков намного разнообразнее (метилирование, фосфорилирование, убиквитинирование, ацетилирование) и разные комбинации этих модификаций опознаются различными негистоновыми хроматиновыми белками, которые, как полагают, формируют активное или репрессированное состояние хроматина. Преобладание ацетипированных и фосфор ил ированных форм приводит, как правило, к формированию активного хроматина, а метилирование вызывает репрессию, хотя, по-видимому, эти модификации могут нести и противоположные функции, что в высокой степени зависит от расположения и комбинирования измененных аминокислот в молекулах гистонов (Jenuwein and Allis, 2001; Spotswood and Turner, 2002).

Особое семейство гетерохроматиновых белков представлено продуктами генов-супрессоров эффекта положения, мутации которых подавляют процесс инактивации эухромати новых генов, перенесенных в гетерохроматиновое окружение. Белки, кодируемые этими генами, непосредственно участвуют в формировании гетерохроматиновой структуры, в том числе и в модификациях гистонов. Например, ген Su(var)3-9 кодирует белок, содержащий SET домен и отвечающий за метилирование девятого лизина в молекуле гистона НЗ. Для этого он нуждается в работе белка гистон-деацетилазы. Метилированная форма гистона НЗ является мишенью для белка НР1, кодируемого геном Su(var)2-5, который приводит к компактизации нуклеосомной укладки и инактивации генов. В недавно опубликованном исследовании было проведено высокоточное картирование сайтов посадки белка НР1 и SU(VAR)3-9 в геноме дрозофилы

с помощью нового метода, включающего технологию микрочипов. При этом оказалось, что эти мишенями для SU(VAR)3-9 в нецентромерных областях служат гены, экспрессирующиеся в развитии самцов, в то время как в ПГХ он связан с генами, работающими в эмбриогенезе. Белок НР1 также связывается (Greil etal., 2003).

Белок, кодируемый геном Su(UR), по-видимому, также принимает участие в формировании гетерохроматина. Было показано, что мутация гена Su(UR) вызывает заметные морфологические изменения в ПГХ политенных хромосом, а именно, у мутантов Su(UR)' наблюдается значительное увеличение прицентромерных районов, которые к тому же приобретают воспроизводимую дисковую структуру, характерную для эухроматиновых районов хромосом. Эктопическая повсеместная экспрессия гена Su(UR) летальна на личиночной стадии, по-видимому, из-за недоразвития политенных тканей, преобладающих на этой стадии развития (Makunin et al., 2002). Такие изменения, по всей видимости, происходят за счет повышения уровня политенизации в районах ПГХ (Belyaeva et al., 1998). Антитела против белка SU(UR) активно связываются с хромоцентром (Makunin etal., 2002).

2.2. Интеркалярный гвтврохроматин

С помощью цитологических методов показано, что наряду с ПГХ, в хромосомах D. melanogaster имеются другие участки, репликация которых проходит в конце S-фазы. Эти районы хромосом были названы интеркалярным гетерохроматином. Интеркалярный гетерохроматин (ИГХ) располагается в эухроматиновых плечах политенных хромосом, и, как и прицентромерный, поздно реплицируется в S-фазе клеточного цикла и сильно недореплицирован (Zhimulev and Belyaeva, 2003). На микроскопическом уровне он выглядит как разломы в крупных компактных дисках политенных хромосом, причем, каждый район ИГХ обладает характерной частотой разломов (Zhimulev et al., 1981; Zhimulev et al., 1983). Эти районы часто формируют так называемые эктопические контакты

между собой и с хромо центром. Эти контакты представляют собой тяжи,
соединяющие районы и содержат ДНК. Их появление коррелирует с
недорепликациеи в гетерохроматиновых районах, но механизм их
образования до конца не понят {Zhimulev, 1998). Подобно
прицентромерному гетерохроматину, образующему хромоцентр в
политенном ядре, районы интекалярного гетерохроматина часто
контактируют с ядерной оболочкой (Kaufmann and Gay, 1958). Сходные
результаты были получены на дрожжах, у которых поздно
реплицирующиеся районы хромосом часто располагаются вблизи ядерной
мембраны (Heun et al., 2001). В линиях дикого типа насчитывается около 60
районов, формирующих разломы (Zhimulev, 1998). При этом из-за действия
механизма дозовой компенсации разломы исчезают из X хромосомы
самцов дрозофилы (Alekseyenko et al., 2002). Мутация гена Su(UR)
приводит к полному восстановлению политенизации во всех районах
интеркалярного гетерохроматина, как на X хромосоме, так и на аутосомах
(Belyaeva et al., 1998). Дополнительные копии гена Su(UR)* приводят к
усилению недорепликации не только в уже существующих районах ИГХ, но
и в поздно реплицирующихся эухроматиновых районах, которые в линиях
дикого типа политенизируются полностью. Для района 11А X хромосомы
показано, что дополнительные дозы гена Su(UR)⁺ вызывают
недорепликацию у самцов, хотя и не такую сильную, как у самок дикого типа
(Alekseyenko et al., 2002). Сильная оверэкспрессия белка SU(UR) в слюнной
железе на стадии позднего личиночного возраста вызывает специфические
видоизменения в районах гетерохроматина. Вместо хромосомных разломов
возникают пуфоподобные структуры, которые достигают весьма
значительных размеров. Этот процесс является

температурочувствительным и протекает наиболее интенсивно при 29С. Он также обратим, поскольку новые структуры исчезают при снижении температуры до 18С (Zhimulev et al., 2003с).

По-видимому, характерным признаком интеркалярного

гетерохроматина является именно поздняя репликация в S-фазе клеточного

цикла, которая выявляется в около 250 сайтах в геноме дрозофилы (Zhimulev et al., 2003b). Первым был охарактеризован район ИГХ, располагающийся в районе 89DE политенных хромосом. Зона недорепликации была определена с помощью Саузерн-блот анализа и составила около 300 т.п.н. Этот участок содержит кластер гомеиозисных генов Bithorax-Complex, отвечающих за специализацию сегментов тела дрозофилы (Moshkin et al., 2001). В районе 39DE находится кластер гистоновых генов, которые также недореплицированы в слюнной железе. Однако повторенность гистоновых генов значительно затрудняет анализ этого района (Belyaeva et al., 1998). Генетический состав остальных районов ИГХ не изучен.

Интеркалярный гетерохроматин связывается со специфическими белками, участвующими в генетическом сайленсинге. Так, многие районы ИГХ связаны с белка ми-реп рессорам и группы Potycomb. Эти белки участвуют в регуляции гомеиозисных генов, таких как ВХ-С и ANTP-C (Ross and Zarkower, 2003). Эти белки были обнаружены в 60% районов ИГХ (Zhimulev et al., 2003b). Также, 96% районов связываются с белком НР1, описанным как фактор, специфический для прицентромерного гетерохроматина, в условиях его оверэкспрессии (Л. Болдырева, личное сообщение).

2.3. Репликация и транскрипционная активность гетерохроматина

Корреляция времени репликации и транскрипционной активности описывается в литературе на протяжении многих лет. Поздно реплицирующиеся районы являются, как правило, транскрипционно неактивными, а рано реплицирующиеся демонстрируют высокое содержание экспрессирующихся генов (Zhimulev, 1998). В недавнем геномном исследовании Schubeler с соавторами показали, что в геноме культуральных клеток дрозофилы Кс рано реплицирующиеся гены в основном транскрипционно активны в этих клетках, в то время как процент

активных генов в поздно реплицирующихся районах заметно снижен. При этом была построена геномная карта репликации 8 клетках Кс, позволяющая обнаружить поздно реплицирующиеся районы (Schuebeler et al., 2002).

У дрожжей показано, что теломерная ДНК обладает способностью делать рано активирующиеся участки инициации репликации (ориджины) поздно реплицирующимися. В этом процессе играют важную роль белки, отвечающие за установление теломерного сайленсинга, то есть за подавление активности генов, располагающихся вблизи теломер (Ferguson and Fangman, 1992; Hechtet al., 1996; Stevenson and Gottschling, 1999).

Кластеры хорионовых генов в геноме дрозофилы, подвергаются выборочной амплификации в фолликулярных клетках яйцевых камер. Амплификация хорионовых генов является необходимой для их нормальной экспрессии: нарушение амплификации ведет к недоразвитию хорионовой оболочки и стерильности самок (Cayirlioglu et al., 2003). Эктопическая экспресия гена Su(UR)⁺ в яичниках самок дрозофилы приводит к похожим нарушениям. Как оказалось, в этом случае происходит подавление амплификации хорионовых кластеров (Volkova et al., 2003).

В геноме человека на примере отдельных генов была показана общая корреляция между активностью генов и временем репликации. Так, «гены домашнего хозяйства», необходимые для общих клеточных процессов, реплицируются в ранней S-фазе клеточного цикла, в то время как гены, работающие в дифференцированных тканях, могут реплицироваться поздно в большинстве тканей.(Holmquist, 1987; Selig et al., 1992). Подробно описана регуляция репликации и транскрипции на примере кластера р-гл оби новых генов млекопитающих. В неэритроидных клетках этот кластер упакован в гипоацетилированный, устойчивый к ДНКазе! и поздно реплицирующийся хроматин, содержащий около 300 т.п.н. Однако, в эритробластах этот участок генома приобретает противоположные свойства, характерные для активного состояния генов. Репликация на этом участке регулируется LCR (Locus Control Region), расположенным на

расстоянии около 50 т.п.н. от глобинового кластера, являющимся цис-регулятором времени репликации (Gilbert, 2002; Simon et al., 2001). Репликация кластера р-глобиновых генов происходит с одного ори джина репликации во всех тканях, но его временная активация тканеспецифична (Cimboraetal., 2000).

Эти примеры означают, что функционирование широкого спектра высокоспециализированных генов могут быть связаны с действием механизма, активно регулирующего их экспрессию и раннюю репликацию в определенных типах клеток и инактивацию и позднюю репликацию в остальных тканях.

2.4. Заключение

Регуляция генов и репликация генома определяется свойствами хроматина. При этом многие исследователи наблюдали определенную корреляцию между временем репликации и транскрипционной активностью. Поздно реплицирующиеся гены, как правило, транскрипционно неактивны. При этом в поздно реплицирующихся районах генома часто присутствуют белки сайленсинга, которые также могут являться факторами, изменяющими хроматиновую укладку. Также есть указания на то, что поздно реплицирующиеся районы содержат в основном гены, работающие в узко специализированных типах клеток или тканях, например, [3-глобиновые гены млекопитающих, которые активны только в еритробластах. Что интересно, в этом типе клеток р-глобиновые гены не только начинают экспрессироваться, но и становятся рано реплицирующимися.

Политенные хромосомы являются уникальной моделью для изучения этих явлений, так как гетерохроматиновые районы легко визуализируются. Однако они остаются слабо изучены генетически. Для исследования этих вопросов мы разработали новый подход с использованием уникальных эффектов гена Su(UR).

Районы прицентромерного и интеркалярного гетерохроматина у D. melanogaster поздно реплицируются в большинстве исследованных тканей. Очевидно, они содержат значительное количество генов. Мутация гена Su(UR) приводит к дополнительной политенизации в гетерохроматиновых районах обоих типов. При этом районы ИГХ начинают реплицироваться раньше (Zhimutev et al., 2003а).

Ген Su(UR) является на сегодняшний день единственным, оказывающим влияние как на прицентромерный, так и на интеркалярный гетерохроматин в политенных хромосомах. При этом генетические манипуляции с этим геном позволяют получить широкий спектр специфических изменений в гетерохроматиновых районах.

Первой задачей предлагаемого исследования было изучение прицентромерных районов политенных хромосом, появляющихся под действием мутации Su(UR) с использованием метода микродиссекции и микроклонирования.

Технология микроматриц {микрочипов) на основе ДНК позволяет
одновременный анализ относительной представленности многих тысяч
последовательностей в тотальных образцах ДНК или РНК. Две доступные
нам платформы содержат фрагменты ДНК примерно 5000 индивидуальных
EST-клонов (Expressed Sequence Tag из коллекции DGC1;
) и всех открытых рамок считывания в
геноме D. meianogaster (около 20000 индивидуальных

последовательностей) (Hild et al., 2003). Гибридизация тотальных образцов ДНК, меченных двумя разными флюорохромами, позволяет определить различия в представленности нанесенных на микрочип последовательностей в двух образцах.

Второй поставленной задачей стало исследование политенизации в политенных хромосомах в масштабах всего генома, определение районов недорепликации, их молекулярно-генетическая и цитологическая характеристика и поиск особенностей их молекулярно-генетической

организации, которые позволили бы пролить свет на причины и механизмы их поздней репликации и инактивации.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Линии мух

Для микродиссекции районов политенных хромосом 40A-41D, 80C-81F и 81F была использована линия w~/w~; Su(UR)7Su(UR)~. Район 20A-F был вырезан с препарата политенных хромосом линии in(1)w^m4h/ln(1)w^m4h; Su(UR)7Su(UR)~. В качестве контролей в экспериментах использовали линию дикого типа Oregon-R.

3.2. Микроклонирование

Для получения ДНК из прицентромерных районов политенных хромосом был использован метод микродиссекции, разработанный для человеческих хромосом и модифицированный для диссекции политенных хромосом. Микроманипуляции производили на инвертированном микроскопе Axivert 10 (40х, 10х) микроманипулятором MR mot (Zeiss). Вырезание фрагментов хромосом проводили силиконизированной стеклянной иглой, управляемой микроманипулятором. Цитологические препараты хромосом были изготовлены на покровных стеклах 60x24 мм в 45% уксусной или в 50% пропионовой кислоте. Вырезанные районы хромосом переносили в 1-2 нл каплю стерильного Tritone Х100, находящуюся в вытянутом кончике пипетки Пастера диаметром 60-80 мкм. Было собрано 10-30 фрагментов хромосом для каждого образца. После этого конец пипетки обламывали в 0.5 мл пробирку. Затем добавляли 3 мкл смеси, содержащей 0.25х буфер для секвеназы (Amersham), 0.2% Tritone Х100 (Sigma). Смесь нагревали до 90С (1 мин.) и охлаждали до 30С (1 мин.). Нагревание и охлаждение повторяли 5 раз, после чего добавляли 0.1 мкл протеиназы К (14 мг/мл; Boehringer Mannheim) и инкубировали 18 часов при 60С. Следующим шагом добавляли 2 мкл раствора, содержащего 1х буфер для секвеназы, 0.5 мМ dATP, dCTP, dGTP, dTTP (Boehringer Mannheim) и 5 пмоль праймера MW6 (5'-CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3') (Teienius et al., 1992). Протеиназу К инактивировали в течение 6 мин при 96^СС, после чего

проводили 8 циклов полимеразной цепной реакции с секвеназой (Sequenase Т7 DNA polymerase Version 2): 1 мин 95С, 2 мин 30С, 2 мин 37С. После каждой денатурации добавляли 0,2 мкл фермента. Следующим этапом добавляли 45 мкл смеси для ПЦР и проводилась наработка фрагментов ДНК, фланкированных последовательностью праимера MW6 в 33 циклах ПЦР с термофильной ДНК полимеразой (Stoffel fragment AmpliTaq Polymerase, Perkin Elmer): 1 мин 94C, 1 мин 56C, 2 мин 72C и 10 мин 72C после последнего цикла (Rubtsov et al., 1996). Наработанная ДНК вырезанных районов была гидролизована ферментом рестрикции Sfr2751 (Сибэнзим, Новосибирск), изошизомером Xhol в течение 3 часов при 50С и очищена с помощью колонок QUIAquick Spin Column (QUIAGEN, Germany). 300 нг ПЦР продукта и 300 нг вектора (pBluescript II KS+ или pGEM-TEasy, Promega) лигировали в 15 мкл в течение 12 часов при 16С. Лигазная смесь был трансформирован в компетентные клетки E.coliXLBIue\.

3.3. Гибридизация in situ

Мечение ДНК проводили в дополнительных 15 циклах ПЦР с 2 мкл наработанного продукта. 20 мкл реакции содержали 0.4 е.а. AmpliTaq polymerase (Perkin Elmer) с подходящим буфером, 200 мМ dATP, dGTP, dCTP, 160 мМ dTTP и 40 мМ biotin-16-dUTP (Boehringer, Mannheim), и 20 пмопь праимера MW6 (Telenius et al. 1992). Клонированные индивидуальные фрагменты ДНК были помечены в тех же условиях, но в 30 циклах ПЦР и со стандартными ТЗ и Т7 праймерами. Препараты политенных хромосом инкубировали в 2xSSC в течение одного часа при 65С, денатурировали в 2xSSC, 0.07N NaOH (1.5 мин) и обезвоживали последовательно в 70%, 80% и 96% этиловом спирте по 5 мин в каждом, после чего высушивали на воздухе. Меченный денатурированный зонд смешивали с 1.5х буфером (75% формамид, 15% декстран сульфат, 3xSSC) из расчета 30 мкл гибридизационной смеси на препарат. Гибридизацию проводили при 37С 12 часов. Несвязавшийся зонд смывали тремя сменами 0.2xSSC (42С, 3 раза по 15 мин), после чего препараты помещали

в раствор, содержащий 2% Blocking reagent (Boehringer Mannheim), 4xSSC, 0.1% Triton-X100 (37C, 30 мин) Окраску avidin-FITC проводили в том же растворе {концентрация avidin-FITC 0,025 мг/мл) при 37С 30 мин. После этого препараты промывали 3 раза по 5 мин в 4xSSC, 0.1% Triton-ХЮО при 42С. В случае индивидуальных микрокпонов проводили усиление сигнала с помощью биотинилированных антител к авидину и повторной окраски avidin-FITC- эта процедура проводилась до получения удовлетворительной интенсивности сигнала. После этого хромосомы подкрашивали propidium iodide (Sigma) (2 мкгУмл в 0.2xSSC) и ополаскивали в 0.2xSSC. После этого препараты высушивали, покрывали антифейдом и анализировали сигнал в ультрафиолетовом свете на микроскопе Olympus (Japan).

3.4. Саузерн-блот гибридизация

Геномные ДНК линии Орегон и линии, гомозиготной по мутации Su(UR)ES, гидролизованные ферментами рестрикции ЕсоН\ или Hind\\\, разделяли в 0.7% агарозном геле и переносили на нейлоновую мембрану (Hybond N, Amersham). Клоны, для которых не было найдено гомологии в базе данных, были помечены DIG-11-dUTP (Boehringer Mannheim) с помощью ПЦР. Саузерн-блот гибридизация и детекция с помощью системы CDP-Star производились согласно протоколу DIG DNA Labelling and Detection Kit (Boehringer-Mannheim). Клоны, не давшие сигнала на Саузерн-блоте, были исключены из дальнейшего анализа как содержащие чужеродную ДНК. Для обсчетов при построении профиля недорепликации в районе 19Е использовали геномную ДНК из 50 слюнных желез и 25 имагинальных дисков линий Su(UR)VSu(UR)~', 4xSu(UR)* и Oregon-R. Фрагменты ДНК, использованные в качестве зондов, амплифицировали с геномной ДНК и клонировали. Клонированные фрагменты метили [32P]-dATP в реакции с фрагментом Кленова. Плотность сигнала измеряли с помощью HP Scan Jet 4СЯ сканера и программы Band Leader 3.0. Относительная представленность последовательностей вычислялась как отношение сигналов в слюнных железах и имагинальных дисках после нормировки по

контрольному клону гена rosy, ДНК которого полностью политенизируется в политенных тканях.

3.5. Гибридизация и анализ микрочипов.

Мечение геномной ДНК проводилось по стандартному протоколу () с небольшими модификациями. 3-5 мкг ДНК обрабатывали ферментом рестрикции Нае\\\ в течение 4 часов. Меченые образцы очищали на колонках QIAGEN PCR purification columns. Гибридизации проводили при 42С 12-14 часов в гибридизационном буфере, содержащем 50% формамид, бх SSC, 0.5% SDS и 5х Денхард. Несвязавшийся зонд отмывали при комнатной температуре (2 раза по 15 мин O.txSSC, 0,1% SDS и 2 раза по 15 мин 0,1xSSC). Для сканирования микрочипов и анализа изображений использовали сканер и пакет программ GenePix Pro 3.0 scanner. Нормировку первичных данных проводили по протоколу Lowess с помощью пакета программ GeneSpring. Тест на воспроизводимость проводили как описано у (Yang et al, 2002). Точки, отличающиеся от среднего больше, чем на три стандартных отклонения, были удалены из дальнейшего анализа. После усреднения данных для последовательностей, представленных на микрочипе более одного раза, 11673 гена подвергались дальнейшему анализу. Кластеризацию и визуализацию данных проводили с помощью программ Cluster и TreeView ().

3.6. Выявление районов недорвпликации.

11673 гена, проявившие статистически воспроизводимые сигналы гибридизации, были расположены в порядке их расположения в геноме D. melanogaster согласно версии геномной аннотации 3.1 (). После этого данные были обработаны с помощью симметричного усредняющего "плавающего окна" размером в 10 генов и с шагом в 1 ген. Недореплицированные области были определены как последовательности генов, для которых усредненная представленность ДНК в линии 4xSu(UR)*,

определенная с помощью плавающего окна, отличалась более чем на два стандартных отклонения от среднего, определенного для целого хромосомного плеча (Р<0,05). Последовательно расположенные "окна", проявляющие недорепликацию, были объединены в 52 района, причем границы районов были определены как границы окон, образующих статистически достоверно недореплицированные области.

3.7. Выявление транскрипционных территорий.

Данные об экспрессии генов (Arbeitman et al., 2002) на 70 стадиях развития были разбиты на семь групп: эмбрионы 0-3 часа развития, эмбрионы 3 -10 часов развития, эмбрионы 10-24 часов развития, личинки, куколки, взрослые самцы и взрослые самки. Относительные данные об экспрессии каждого гена (по сравнению со стандартом, представляющим собой смесь образцов со всех 70 исследуемых стадий развития) были усреднены, при этом, положительные значения больше +1 по логарифмической шкале (усиление сигнала больше чем в два раза по сравнению со стандартом) рассматривались как активность гена, а отрицательные меньше -1 (ослабление сигнала больше, чем в два раза по сравнению со стандартом) -как репрессия гена Значения в промежутке (-1...+1), соответствующие регуляции гена меньше, чем в два раза по сравнению со стандартом, рассматривались как отсутствие регуляции. Полученные данные были отсортированы согласно их расположению в геноме и обработаны с помощью скользящего окна размером 9 генов с шагом в один ген. Это позволило выявить районы, обогащенные корегулируемыми генами.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. Анализ районов прицентромерного гетерохроматина

Мутация Супрессор недорепликэции (Su(UR)') обладает уникальным фенотипом: прицентромерные районы всех плеч хромосом, кроме хромосомы 4, приобретают воспроизводимую дисковую структуру и, как кажется, имеют более высокий уровень политенизации, чем в хромосомах линии дикого типа. Несомненно, они представляют собой только часть ПГХ дрозофилы, поскольку в общем доля гетерохроматина в политенных хромосомах мутантов Su(UR)' по сравнению с другими линиями увеличивается незначительно и остается намного меньше, чем в митотических хромосомах, где прицентромерные гетерохроматиновые районы занимают в среднем около 30% длины хромосом. Мутация Su(UR)' приводит к увеличению дисковой части хромосом, по-видимому, за счет дополнительной политенизации 0-гетерохроматина. Как кажется, а-гетерохроматин, формирующийся в основном за счет сателлитных последовательностей, не претерпевает столь значительных изменений (Belyaeva et al., 1998; Koryakov et al., 1996). Чтобы охарактеризовать эти специфические участки, мы решили получить ДНК из этих районов и изучить составляющие их последовательности.

Для того чтобы получить материал из прицентромерных районов, появляющихся у мутантов Su(UR)' и охарактеризовать их генетическое содержание, был выбран метод микроклонирования, опробованный ранее для изучения 19 района X хромосомы (Miklos et al., 1988). Этот метод позволяет получить короткие фрагменты ДНК из интересующих участков хромосом при помощи микродиссекции этих участков с цитологических препаратов и амплификации содержащейся в них ДНК. Фрагменты хромосом (10 - 30 копий) вырезали с сухих препаратов политенных хромосом линии, гомозиготной по мутации Su(UR) и собирали с помощью микроманипулятора. Рис. 1 демонстрирует препараты до и после вырезания фрагментов. На рисунке обозначены цитологические

Рис. 1. Микрофотографии политенных хромосом мутантов Su(UR)" до (А,В,Д и Ж) и после (Б,Г,Е и 3) вырезания прицентромерных участков. А, Б - диссекция района 20A-F из X хромосомы, несущей инверсию In(w^m4h). В, Г - диссекция гетерохроматина района 40А-41С хромосомы 2; Д, Е - района 81F хромосомы 3; Ж, 3 - района 80C-81F хромосомы 3.

координаты границ вырезанных районов, а сами районы обведены рамками. Большие размеры и структура политенных хромосом позволили провести диссекцию с большой точностью, что видно на рисунке. Таким образом, были собраны образцы из 20A-F района X хромосомы (Рис. 1А), 40A-41F хромосомы 2 (Рис. 1Б), 80C-81F, включающий Plato Atlantis (Рис. 10. а также район 81F хромосомы 3 отдельно (Рис. 1В). У мутантов Su(UR)~ район 81F приобретает совершенно иную морфологию, чем в хромосомах дикого типа и становится значительно больше, поэтому он был выделен в отдельный образец. Дистальная часть гетерохроматина X хромосомы была вырезана из политенных хромосом линии, несущей инверсию ln(1)v/^n4h, которая переносит часть гетерохроматина до ядрышкового организатора к району ЗС (Рис. 1А), что значительно облегчило микроманипуляции. Перемещенная часть соответствует району 20A-F политенных хромосом.

Для того чтобы получить большее количество продукта для дальнейшей работы, после обработок, подробно описанных в разделе Материалы и методы, ДНК амплифицировали в реакции ПЦР с частично вырожденными праймерами, содержащими адаптер с сайтом узнавания фермента рестрикции ХлоІ. В результате из каждого образца был получен набор фрагментов размером -100-1000 п.н.

Чтобы проверить качество полученных продуктов и их принадлежность прицентромерным районам политенных хромосом дрозофилы, мы провели гибридизацию полученной ДНК с политенными хромосомами мутантной линии Su(UR)' (Рис. 2). На рисунке видно, что во всех четырех случаях сигнал гибридизации присутствует во всем хромоцентре. Это свидетельствует о том, что, как и ожидалось, полученные библиотеки обогащены повторенными последовательностями. Кроме этого, мы наблюдали сигналы гибридизации во многих сайтах в эухроматине (Рис, 2Б,Г,Е), что может говорить о наличии в полученном материале фрагментов мобильных элементов или других повсеместно распространенных повторов.

Также было обнаружено, что ДНК из районов 20A-F и 81F сильнее гибрид и зовались именно с этими районами политенных хромосом и

Рис. 2. Гибридизация in situ тотальных продуктов ПЦР с политенными хромосомами мутантов Su(UR)". А - продукт из района 20A-F; Б - из района 40А-41С; В - из района 81F; Г - из района 80C-81F. Во всех случаях сигнал присутствует во всем хромоцентре, однако, в случае продуктов из районов 20A-F и 81F сигнал сильнее в этих районах. Д, Е - гибридизация продукта из района 81F. Д - фазовоконтрастная фотография, Е - сигнал гибридизации. Стрелками отмечены границы распространения сигнала из гетерохроматина в дисковую часть хромосом. ЯО - ядрышковый организатор.

значительно слабее с остальной частью хромоцентра. Это может означать присутствие в них специфичных последовательностей.

Что интересно, во всех случаях мы наблюдали сигнал гибридизации не только во вновь образующихся районах, но и в прилежащих к ним участках хромосом, которые имеют дисковую структуру и полностью политенизируются в линиях дикого типа. Этот результат хорошо воспроизводится во всех четырех случаях. Пример такого распределения сигнала представлен на Рис. 2 Д,Е для библиотеки из района 81F. На Рис. 2Д изображена фотография ядра сделанная с помощью фазово-контрастного устройства. На ней обозначены границы сигналов: 20А в X хромосоме, 40А и 42А во второй хромосоме и 80А и 81F в хромосоме З, В хромосоме 4 сигнала не наблюдали. При этом важно отметить, что районы -20А-С, 41D-42A, 80А-С имеют дисковый рисунок и степень политенизации, близкую к уровню эухроматиновых последовательностей и в линиях дикого типа. Таким образом, эти районы, по-видимому, определяют зоны перехода между эу- и гетерохроматином в политенных хромосомах.

Эти факты свидетельствуют о близком молекулярно-генетическом составе прицентромерных районов, включая основания плеч хромосом. В связи с этим можно предположить следующую модель. По принципу чувствительности к гену Su(UR) прицентромерные гетерохроматиновые районы можно разделить на три части. Первая часть не подвергается воздействию этого гена и имеет эухроматиновую структуру в линиях дикого типа. Вторая не политенизируется в линиях дикого типа и не претерпевает значительных изменений под действием мутации Su(UR)', образована а-гетерохроматином и состоит, по-видимому, из сателлитных последовательностей. Наконец, третья часть претерпевает дополнительную политенизацию и приобретает дисковый рисунок у мутантов. Именно с этой частью гетерохроматина мы и имеем дело.

Для дальнейшего изучения материала прицентромерных районов, продукт ПЦР клонировали в плазмидный вектор (pBluescriptll в сайт Xho\ или pGEM-TEasy; см Материалы и методы) и получили набор

индивидуальных клонов из каждой библиотеки. Нами было получено более 100 клонов из каждого района. Секвенирование, поиск гомологии по базам данных проекта по секвенированию генома D. melanogaster () и Саузерн-блот анализ 304 фрагментов показал, что только 36 из них (12%) не имеют высокой гомологии в геноме дрозофилы и не дают сигнала при гибридизации с геномной ДНК линии Su(UR)', эти последовательности были исключены из дальнейшего анализа (Таб. 1). Поиск в базах данных с помощью BLAST показал, что 252 из 268 клонов, принадлежащих геному D. melanogaster (94%), содержат известные последовательности ДНК -фрагменты мобильных элементов, известных генов, а также повторов неизвестной природы (Таб. 2).

Микродиссекция и секвенирование полученного материала дали нам возможность проанализировать последовательности из новых районов. Попытка определить молекулярный состав районов 19F и 20 хромосомы X с помощью микродиссекции была предпринята на по литейных хромосомах линии дикого типа (Miklos et al., 1988). Приблизительно 60% из 115 проанализированных в этом исследовании клонов оказались содержащими повторенные последовательности, 4 из них гибридизовались с ДНК мобильных элементов hobo, 297 и /. Кроме этого наблюдали мечение по всей длине хромосомы 4. В наших опытах по 20 району 43 клона из 4S проанализированных (около 90%) определены как повторенные, остальные 6 имеют гомологию с генами или уникальны. Среди повторенных последовательностей из этого района нами были обнаружены 17 клонов, имеющих гомологию с 12 различными мобильными элементами {Fw, I, copia-like, copia, hoppel, 297, retrotransposon-like element, aurora, hobo, micropia, Stalker, retrotransposon typell-like element) (Таб. 2) Кроме этого мы выделили 5 клонов, гомологичных su(f) повтору (около 10% проанализированных клонов).

Si/(r)-noBTOp является особым классом последовательностей в ПГХ. Изначально он был обнаружен в двух копиях с обеих сторон гена suppressor of forked {su(f)), расположенного в X хромосоме. Характерной особенностью

*

этого повтора является его локализация на эу- гетерохроматиновой границе в митотических хромосомах (Tudor et al., 1996). Было предположено, что этот повтор может играть роль пограничного элемента, предотвращающего взаимные влияния эу- и гетерохроматина. В наших библиотеках он оказался наиболее представлен в материале из X хромосомы (около 10% отсеквенированных клонов); в остальных хромосомах его доля составила около 5% (Таб. 2).

35 из 39 отсеквенированных клонов из библиотеки района 40A-41F (90%) содержат различные повторы. Интересно, только 6 из них имеют гомологию с мобильными элементами (Fw, copia-like, ORF-1, gypsy, BEL). 2 клона (5% проанализированных клонов) оказались гомологичны su(f) повтору. Два клона содержат фрагменты генов и два оказались уникальными (Таб. 2).

В библиотеке из района 80C-81F 129 клонов из 137 (94%) являются повторами. 49 из них (34%) имеют гомологию с различными мобильными элементами. Два обнаруженных EST клона и соответствующие им наши клоны - atl101 и atl149 оказались повторенными на Саузерн-блоте. Кроме этого два клона проявили гомологию к генам и 6 содержат уникальную встройку.

42 из 45 секвенированных клонов из района 81F (93%) содержат вставку повторенных последовательностей. 18 из них гомологичны мобильным элементам. Также были найдены два уникальных клона, один из которых - F029, дает сильный сигнал при гибридизации с библиотекой кДНК.

Таким образом, для района 20, как, впрочем, и для остальных вырезанных нами районов, можно предположить две причины для появления фенотипа, описанного для мутации Su(UR)'. Во-первых, возможно, что в этих районах присутствуют последовательности ДНК, ответственные за взаимодействие с белком, кодируемым геном Su(UR) напрямую, что обусловливает их компактизацию и недорепликацию. В пользу этого предположения говорит способность взаимодействия продукта

гена Su(UR) со специфическими последовательностями ДНК (Tchurikov et al., 2004). Во-вторых, существует возможность, что продукт гена Su(UR) участвует в формировании хроматина и может, например, влиять на структуру репликонов, то есть оказывать воздействие на более высоком уровне, чем последовательность нуклеотидов в ДНК.

Во всех библиотеках присутствуют повторенные

последовательности, не относящиеся ни к одной охарактеризованной группе (гены, мобильные элементы и т. д.), поэтому можно предположить, что разнообразие мобильных элементов значительно больше, чем было обнаружено в нашем исследовании.

Клоны, для которых не было обнаружено гомологии в базах данных, были подвергнуты Саузерн-блот анализу и на основании их паттерна гибридизации были разделены на группы, названные "новыми уникальными" и "новыми повторенными" последовательностями (Таб. 2).

Уникальные последовательности, обнаруженные в этом исследовании были использованы для получения молекулярных маркеров в гетерохроматиновых районах. Некоторые последовательности были прокартированы in situ на политенных хромосомах линии Su(UR)' (Рис. ЗА-М) с помощью карт прицентромерных районов, составленных на основе электронно-микроскопических исследований (Semeshin et al., 2001) (Рис.ЗН-П). Полученные данные дали набор клонов, использованных для изучения недорепликации в ПГХ дрозофилы в другом исследовании (Ткач и др. неопубликованные данные).

Таким образом, микроклонирование дает возможность разрешить некоторые проблемы, связанные с изучением прицентромерных районов политенных хромосом у мутантов $u(UR)~. Было показано, что концентрация мобильных элементов в этих районах значительно выше, чем показали Miklos et al. (1988). Также обнаружены ранее неизвестные уникальные и повторенные последовательности.

Оказалось, что эухроматиновые районы, лежащие в основаниях плеч хромосом имеют близкий молекулярный состав с располагающимися рядом

Х055 Х005

Рис. 3. Картирование некоторых микроклонов на политенных хромосомах мутантов Su(UR)" и на карте прицентромерных районов (Semeshin et al., 2001). А - atllOl, Б - F102, В - atll83, Г - atll23, Д - atll49, Е - Х005, Ж - Х055, 3 - atll74, И - atl068, К - F029, Л - S035, М - atll72.

_ГмлЩШ)

і 111

I НИЩ I II I I IIIII

1 7 ЗІ 2 З

А |В

S035

с |d |е |f

at!149

atll72"-

atll83\

_"Я'Ч'П

а |в|с |d]e |f

at!123 at!074

II I III II II I III III I
5 31 61

Is |C D

at!068 F029

_{імиивііш:}

I II II I I I III II I lllllll I III I I I I

A |B |C

a |b |c |d |e |f

(3-гетерохроматиновыми районами, которые политенизируются в линии Su(UR) и по всей видимости представляют зоны перехода между прицентромерным гетерохроматином и эухроматиновыми плечами хромосом.

4.2. Анализ районов интвркалярного гетерохроматина

Кроме прицентромерного гетерохроматина, эффект гена Su(UR) распространяется на поздно реплицирующиеся (ПР) районы, рассеянные в эухроматиновой части генома, также называемые «интеркалярным гетерохроматином» (Befyaeva et al., 1998). Эти районы, часто недореплицированные в норме, полностью политенизируются у мутантов Su(UR)', в то время как в линии, несущей дополнительные трансгенные копии функционального аллеля (4xSuCUf?J⁺) недорепликация ДНК появляется даже в тех ПР районах, ДНК которых представлена на 100% в хромосомах мух дикого типа (Zhimulev et al., 2000). На микроскопическом уровне недореплицированные районы выглядят как разломы, чаще всего в крупных компактизировэнных дисках полите иных хромосом.

Мы использовали это наблюдение для геномного исследования недорепликации в политенных хромосомах слюнных желез с помощью технологии микроматриц (микрочипов). Использованные нами микрочипы представляют собой предметное стекло, на котором, по аналогии с Дот-блот анализом, напечатаны и ковалентно присоединены фрагменты ДНК дрозофилы. Технология печати позволяет разместить на одном стекле несколько тысяч различных последовательностей. За счет этого метод микроматриц позволяет анализировать огромное количество последовательностей в одном опыте при идентичных условиях эксперимента.

Стратегия нашего эксперимента описана на Рис. 4. В тотальную геномную ДНК, выделенную из слюнных желез личинок третьего возраста, мутантных по гену Su(UR) и несущих две дополнительные копии нормального аллеля Su(URf {4xSu(UR)⁺), включали нуклеотиды, меченные

4xSu(URr Su(UR)

Рис. 4. Принципиальная схема эксперимента по выявлению недореплицированных участков в политенных хромосомах. В геномную ДНК, выделенную из слюнных желез линии, несущей дополнительные трансгенные копии гена Su(UR) и мутантов Su(UR)" (электронно-микроскопические фотографии хромосом любезно предоставлены В.Ф. Семешиным; стрелками указан район 89D в обеих линиях), включали два разных флюорох-рома и совместно гибридизовали со стеклянным микрочипом. После сканирования пятна желтого цвета представляют последовательности, одинаково представленные в обеих линиях, пятна красного цвета показывают недореплицированные последовательности.

двумя разными флюорохромами (Су-5 и Су-3 соответственно) с помощью полимеразной реакции с фрагментом Кленова (см Материалы и методы). Полученные образцы одновременно гибрид изовал и со стеклянными микроматрицами, после чего проводили анализ ^інтенсивностей свечения флюорохромов для каждой последовательности на микрочипе. Основная часть последовательностей, представленных на микрочипе имела соотношение сигналов, близкое к 1, что означает, что они одинаково представлены в обеих линиях (пятна желтого цвета на рисунке) и находятся за пределами недореплицированных (HP) районов. Последовательности, располагающиеся в недореплицированных районах, имели разную представленность в двух образцах и соотношение [Су-3]/[Су-5] было больше 1 (пятна красного цвета).

В экспериментах использовались микрочипы, построенные на двух платформах: первая содержит около 5000 клонов EST из коллекции DGC1 {Drosophila Gene Collection 1), а вторая - все протяженные открытые рамки считывания в геноме Drosophila melanogaster (Hild et al., 2003). Первая платформа использовалась для оптимизации условий эксперимента. Прежде всего, мы решили проверить чувствительность метода. Для этого мы гибридизовали с микрочипами меченые геномные ДНК из взрослых самцов и самок дрозофилы. При этом мы ожидали увидеть разницу в представленности ДНК генов, расположенных на X хромосоме. Действительно, после нормировки результатов мы могли достоверно отличать большинство генов, лежащих на X хромосоме, для которых полученное соотношение сигналов было близко к ^ЛЛ, от аутосомных генов, для которых соотношение равнялось 1. В реальном эксперименте ожидались более значительная разница, поэтому мы сочли чувствительность метода приемлемой. Далее, мы включили этот контроль в следующий эксперимент: ДНК из слюнных желез личинок самцов линии 4xSu(UR)⁺ гибридизовали совместно с геномной ДНК слюнных желез самок мутантной линии. В этом случае мы ожидали обнаружить гены, лежащие в недореплицированных районах аутосом самца, одновременно контролируя

* - начало и конец районов приведены в п.н. для каждого плеча согласно геномной аннотации 3.1

Локализация HP районов в пяти больших хромосомных плечах

приведена в соответствии с геномной аннотацией. В случае отличий от микроскопического картирования разломов, цитологические координаты приведены в скобках. Отмечены (+) районы, содержащие сайты связывания PcG и НР1, а также поздно реплицирующиеся в Кс клетках (ПР) и содержащие транскрипционные территории (ТТ).

чувствительность метода и условия нормировки по генам из X хромосомы. На X хромосоме самцов недорепликация значительно снижена из-за действия механизмов дозовой компенсации (Alekseyenko et al., 2002), поэтому в этом случае мы не рассматривали недопредставленность на этой хромосоме. Действительно, из примерно 5000 последовательностей, присутствующих на микрочипе, около 50 генов оказались более чем в три раза недопредставлены в аутосомах самца. Локализация этих генов в геноме дрозофилы совпала с поздно реплицирующимися и недореплицирующимися районами, выявляемыми цитологическими методами.

После оптимизации мы продолжили эксперименты с микрочипами второго типа. Для окончательных опытов мы использовали геномную ДНК из слюнных желез самок мутантной линии SufURf и 4xSu(UR)*. В этом случае мы рассчитывали получить информацию о недореплицированных участках по всему геному. Всего были проведены три независимых гибридизации.

Подход, использованный для обнаружения интеркалярных гетерохроматиновых районов (Рис. 4, Таб. 3,4) оказался весьма эффективным и позволил не только обнаружить 52 протяженных статистически достоверных (Р<0,05) районов недорепликации, но и построить точный профиль политенизации в клетках слюнной железы дрозофилы. Аннотированный геномный проект D. melanogaster () предоставляет данные о точном расположении генов в хромосомах дрозофилы. Это позволило нам расположить наши данные в виде геномной карты, на которой представлена геномная позиция и относительный усредненный уровень политенизации каждого из 11637 проанализированных нами генов. Этот профиль является отражением временной программы репликации в этом типе дифференцированных клеток. Полученные нами данные хорошо соответствуют профилям недорепликации, построенным ранее для трех районов на основании количественного Саузерн-блот анализа (Рис. 5). На рисунке представлены

zr s

Q.

H ru Z О Q.

S>

Q. O) СП >-

1.0

0.9-1

0.8

0.7-1

0.6

0.5-1

0.4

0.3

0.2.

0.1-

_A

/

\ і \ і

\ і

\ і

s

\

# #

/

V

/ I I

I I I I

I I

I I I

T>

Б> Т.П.Н.

Рис. 5. Профиль политенизации в районе 19DE, полученный с помощью микрочипов (А, --) и количественного Саузерн-блот анализа (Б): - - - профиль в линии дикого типа, - - в линии, несущей дополнительные копии гена Su(UR)⁺. Границы зоны недорепликации одинаковы в обеих линиях. По оси абсцисс -дисстанция в т.п.н. По оси ординат - относительная представленность ДНК. Профили, полученные обоими методами очень близки между собой, что показывает высокую точность карты, полученной с использованием микроматриц.

профили недорепликации в районе 19DE, полученные двумя методами. На Рис. 5Д представлен профиль политенизации, полученный с помощью микрочипов, а на Рис. 5Б - с помощью Саузерн-блот анализа для линии дикого типа Oregon-R и линии 4xSu(UR)⁺. Видно, что как очертания, так и границы зон недорепликации совпадают в обеих линиях и хорошо согласуются с данными, полученными в помощью микрочипов, хотя степень представленности оказалась несколько завышенной в экспериментах с микроматрицами. Аналогичные выводы можно сделать и при сравнении профилей в районе 11А (личное сообщение А.А. Алексеенко) и 89Е (Moshkinetal., 2001).

Цитологическое обозначение районов было проведено с использованием картирования, предоставляемого геномным проектом. В абсолютном большинстве случаев это картирование совпало с цитологическим расположением районов ИГХ. В тех же случаях, когда совпадение было неполным, погрешность составила не более одной единицы цитологической карты, что происходит, скорее всего, оттого, что цитологическое картирование, проведенное в рамках геномного проекта D. melanogaster было рассчитано математически и немного отличается от прямого цитологического анализа.

Протяженность 52 районов недорепликации, обнаруженных в этом исследовании, варьирует от 114 до 618 т.п.н. (в среднем 323 т.п.н.) и в сумме они содержат 1036 генов (11 - 39 генов на район; 7,5% генов D. melanogaster) (Таб. 3).

Было обнаружено, что некоторые недореплицированные области содержат гены, возникшие в результате тандемных дупликаций. Например, район 83DE содержит кластер из 20 близкородственных генов, кодирующих трансмембранные белки (л о кус Osiris или Tpf) (Dorer et al., 2003). Аналогично, кластер гомейозисных генов (Bithorax Complex) и гистоновых генов находятся в зонах недорепликации в районах 89Е и 39DE.

Чтобы проверить, не имеют ли гены из других районов общую функцию, мы воспользовались базой данных Gene Ontology (GO)

(). Эта база данных содержит
всю доступную информацию о функциях генов. Каждая группа содержит
гены, участвующие в каком-либо биологическом процессе. Анализ GO-slim
() не показал

значительного обогащения или обеднения недореппицированных районов генами, имеющими общую функцию, что может говорить о более сложной организации этих районов, чем можно обнаружить с помощью этого анализа.

Ранее с помощью иммуноокрашивания было показано, что все найденные недореплицированные районы содержат, по меньшей мере, один из двух типов белков сайленсинга (Таб. 4, личное сообщение Л.В. Болдыревой). За исключением районов 35D и 35Е остальные районы (96% районов) связывают антитела на белок НР1. В то же время, 32 района (61%) связывают антитела к Polycomb (Рс) (Zhimulev et al., 2003b). Эти белки играют важную роль в инактивации генов: НР1 связан с ПГХ и поддерживает его инактивацию (Cheutin et al., 2003; van Steensel et al., 2001), а Рс участвует в подавлении экспрессии гомейозисных генов (Ross and Zarkower, 2003). Было предположено, что репрессирующие белковые комплексы способны образовывать конденсированное состояние хроматина, которое пассивно затрудняет и замедляет прохождение репликации (Zhimulev and Belyaeva, 2003).

Дальнейший анализ свойств недореппицированных и поздно реплицирующихся районов проводился с привлечением опубликованных данных других исследователей: Schubeler с соавторами изучали временную программу репликации генома в культуре клеток Кс, используя микрочипы на основе DGC1 (Schuebeler et al., 2002); Arbeitman с коллегами охарактеризовали экспрессию около 4000 генов на 75 стадиях развития дрозофилы начиная от стадии яйца до взрослой мухи (Arbeitman et al., 2002); Boutanaev с соавторами исследовали представленность транскриптов в библиотеках кДНК из разных тканей и стадий развития при помощи математического анализа баз данных EST. При этом была

0.4 0.2 о -0.2 -0.4 -0.6 Н -0.8 1

-1.2

^

&

1.6

1-і

1.2

0.8 HP

0.6

0.4

0.2

Т.П.Н.

56EF

ПР

НР-/ПР

_Л

* %.

1 *

0.4 _л 0.2 О -0.2 -0.4 -0.6 -0.8 -1

-1.2

«Р # (S? л⁰⁰ 9?^Q cS> # ч # <# tS?

1.6 1-1

1.2

0.8

0.6 0.-1 02 О

т.п.н.

Рис. 6. Профили некоторых районов недорепликации, демонстрирующие характерные случаи недорепликации в слюнной железе (--) и поздней репликации в культуре клеток Кс (- -) (Schubeler et al., 2002). А - район 58А: полное совпадение HP и ПР. Б - район 56EF поздно реплицируется в культуре клеток, но не проявляет недорепликации в слюнных железах (НР-/ПР). РР - рано реплицирующийся участок В - частичное перекрывание зон HP и ПР в районе 23А. фНР/ПР -зона, которая поздно реплицируется в клетках Кс, но полностью политенизируется в слюнной железе. По оси абсцисс - дисстанция в т.п.н. По оси ординат: слева (ПР) - карта репликации в культуре Кс клеток по логарифмической шкале, справа (HP) - степень политенизации ДНК в слюнных железах линии 4xSu(UR)⁺ по отношению к линии Su(UR)". Вертиральные пунктирные линии указывают границы HP и ПР районов.

обнаружена значительная геномная кластеризация генов,

экспрессирующихся в семенниках самцов дрозофилы (Boutanaev et at., 2002).

Как оказалось, недорепликация в политенных хромосомах хорошо коррелирует с временным паттерном репликации в культуре делящихся клеток Кс (Schuebeler et al., 2002): из 52 охарактеризованных нами районов 50 (96%) поздно реплицируются в Кс клетках, имеющих эмбриональное происхождение и не являющихся полностью специализированными (Рис. 6А). Однако, многие районы поздней репликации в Кс клетках не проявляют недорепликации в слюнных железах, а во многих случаях границы недорепликации и поздней репликации не совпадают (Рис. 6Б,В). Эти данные означают, что, в общем, существует значительное сходство в программах репликации двух типов клеток, но также могут иметь место определенные тканеспецифичные различия.

Для удобства описания недорепликации и поздней репликации мы ввели следующие обозначения: НР-/ПР районы, которые поздно реплицируются в культуре клеток, но не проявляют недорепликации в слюнных железах; фНР/ПР - поздно реплицирующиеся участки, фланкирующие недореплицированные области в слюнных железах; РР -рано реплицирующиеся районы (см. также Рис. 6Б,В).

Исследование на Кс клетках (Schuebeler et al., 2002) показало связь между ранней репликацией и повышенным содержанием в рано реплицирующихся районах активных генов. Чтобы проверить наличие корреляции между недорепликацией и координированной экспрессией генов, мы сопоставили наши результаты с двумя наборами данных: геномным анализом экспрессии генов дрозофилы в развитии (Arbeitman et al., 2002) и исследованием представленности транскриптов (Boutanaev et al., 2002).

Недавно был осуществлен широкомасштабный проект по исследованию экспрессии генов дрозофилы в развитии с применением микрочипов. Это исследование охватывает около 4000 (примерно треть

всех генов дрозофилы) генов и 75 стадий развития дрозофилы (Arbeitman et al., 2002). Поскольку в этом исследовании использовалась платформа DGC1, которую мы применяли для оптимизации наших экспериментов, оказалась изучена экспрессия только 205 из 1036 недореплицированных генов. На Рис. 7 приведена стандартная диаграмма, демонстрирующая паттерны экспрессии генов, лежащих в HP районах в развитии дрозофилы (Arbeitman et al., 2002). Оттенки красного цвета отражают относительное повышение уровня экспрессии, а оттенки зеленого - ослабление. Каждый ряд представляет программу экспрессии одного гена на 75 стадиях развития. После кластеризации этих данных, оказалось, что значительную часть занимают гены, экспрессирующиеся в метаморфозе и у взрослых самцов. Эти гены также теряют свою специфическую картину активации у мутантов tudor, у которых не развиваются ткани зародышевого пути. Из этого был сделан вывод, что они, по всей видимости, включаются в семенниках самцов. Кроме этого было обнаружено большое количество других генов, проявляющих специфическую активацию у самцов. Это видно на Рис. 7 как преобладание красного цвета на стадиях, соответствующих взрослым самцам. На этой диаграмме видно явное преобладание генов, имеющих повышенный уровень экспрессии в метаморфозе и у взрослых самцов дрозофилы и пониженную активность у взрослых самок и на эмбриональной стадии.

Это наблюдение послужило отправной точкой для дальнейшего анализа наших данных. Еще один набор данных был взят из исследования представленности транскриптов в пяти библиотеках «ДНК, проведенного на основе баз данных проекта EST. Для каждого гена было рассчитано число транскриптов, присутствующих в базе данных и нормировано на общее число транскриптов. После этого стало возможно идентифицировать гены, специфически обогащенные в каждой библиотеке. Так, было обнаружено 1662 гена, экспрессирующихся преимущественно в семенниках дрозофилы. Было также показано, что эти гены имеют тенденцию кластеризоваться в геноме {Boutanaev et al., 2002). При наложении этих данных на профиль

эмбрион

куколка

самец самка имя район хромосома

23А 25А

31F-32A 32F-33A

S 35В й 35D

35Е 36В

>3

64D 67D

71С 75С

77DE

100А

100В

4D 7В

11D 12Ё 13В 19А 19Е

Рис. 7. Профили экспрессии генов, находящихся в недо-реплицированных районах, в развитии дрозофилы. Гены расположены в порядке их расположения в геноме. Наблюдается кластеризация корегулируемых генов. Самый яркий красный и зеленый цвет на цветовой шкале представляют трехкратное и более усиление или ослабление экспрессии генов по сравнению с контрольным образцом

недорепликации, оказалось, что крупнейшие кластеры этих генов - районы 53С (не показано) и район 59D, описанные в этом исследовании как крупнейшие кластеры, оказались полностью недореплицированы в слюнной железе (Рис.8). Кроме кластеров, которые обнаружили Boutanaev с соавторами, мы нашли еще несколько районов, проявляющих недорепликацию и в значительной степени обогащенных генами, специфично экспрессирующимися в семенниках (Рис 8).

Чтобы проверить эту закономерность, мы провели независимый анализ этих двух наборов данных. Для этого мы разбили гены на группы в соответствии с их принадлежностью HP, фНР/ПР (поздно реплицирующиеся районы, фланкирующие недореплицированные области), HP-ЛІР (районы, поздно реплицирующиеся в Кс клетках, но не проявляющие недорепликации) и РР (рано реплицирующиеся области) районам (см. Рис 6 и 9А).

Анализ представленности транскриптов в библиотеках кДНК показал кластеризацию в геноме генов, специфично экспрессирующихся в семенниках самцов дрозофилы (Boutanaev et al., 2002). Мы решили проанализировать, не коррелирует ли этот факт со временем репликации ДНК. Для этого мы проверили, как "специфически" экспрессирующиеся гены, обнаруженные в этом исследовании, распределяются в геноме в зависимости от времени репликации. На Рис. 9А представлены диаграммы, отражающие процент генов, специфически экспрессирующихся в семенниках, яичниках, эмбрионах, личинках/куколках и головах мух от общего числа генов в четырех выделенных нами типах районов (HP, фНР/ПР, НР-/ПР и РР). На диаграммах видно, что недореплицированные районы 2L, 3R и Xхромосом, а также все HP районы в сумме отличаются от остальных типов районов: они обогащены генами, специфическими для семенников и обеднены генами, специфическими для яичников. Это наблюдение было подтверждено с помощью таблицы сопряженности признаков, основанной на тесте х² (Р<0,001).

Рис. 8. Примеры профилей недорепликации некоторых районов, содержащих большое число генов, специфически экспрессирующихся у самцов, на основании данных об экспрессии генов в развитии дрозофилы и анализа представленности транскриптов в кДНК библиотеках (Arbeitman et al., 2002; Boutanaev et al., 2002). Гены, экспрессирующиеся в семенниках по данным анализа транскриптов, отмечены красным цветом (), гены, представленные в анализе экспрессии генов в развитии, обведены кружками; под каждым профилем представлены цветные диаграммы экспрессии этих генов, расположенных в порядке их положению в геноме (красный цвет - высокая экспрессия, зеленый - низкая). Э - эмбриональные стадии до вылупления; Л - личинки, 1 - 3 возраст; К - стадии предкуколки и куколки, о⁷¹- взрослые самцы;- взрослые самки. Цитологическая номенклатура районов приведена на каждой диаграмме. По оси абсцисс - дисстанция в т.п.н. По оси ординат - сепень представленности ДНК.

После этого на основании данных о работе генов в развитии дрозофилы (Boutanaev et al., 2002) для каждого хромосомного плеча в отдельности были построены усредненные паттерны экспрессии для выявления преобладающих специфических программ экспрессии в каждой группе (Рис. 9Б).

Проведенный нами анализ показал, что в недореплицирующихся районах слюнных желез действительно концентрируются гены с характерными паттернами экспрессии в развитии (Рис. 9Б). При этом паттерны различаются на разных хромосомных плечах. В частности, недореплицированные районы на 2L, 2R, 3R и X обогащены генами, экспрессирующимися в семенниках, но обеднены генами, транскрибирующимися в яичниках и эмбрионах. У самцов, мутантных по гену tudor, у которых не развиваются ткани зародышевого пути, эти гены перестают экспрессироваться (Arbeitman et al., 2002). Гены в недореплицированных районах X хромосомы имеют сходный профиль экспрессии, однако, большинство генов, активных в семенниках, начинают транскрибироваться на стадии куколки. Недореплицированные районы 3L хромосомы заметно отличаются и не проявляют такой специфичности: недореплицированные районы 3L плеча обеднены генами, экспрессирующимися в яичниках и эмбрионах; в то же время, в них не наблюдается очевидного обогащения генами, экспрессирующимися в семенниках. Статистический анализ всех недореплицированных районов и районов на 3R и X хромосомах (Мест) показал, что обогащение районов недорепликации генами, специфически экспрессирующимися у самцов и репрессированными в эмбрионах и самках, не является случайным (Р<0,001; см Рис. 9Б). В случае 2L и 2R хромосом эта закономерность подтверждается на более низком уровне значимости (Р<0,01).

Аналогичный анализ ПР районов в клетках Кс показал, что НР-/ПР районы хромосомы 2 содержат гены, имеющие сходный, но менее выраженный (Р<0,05) паттерн экспрессии, как и недореплицированные районы (Рис. 9Б). Гены, экспрессирующиеся в семенниках,

1 її.. U І її. JmI II III

_{И(5 р!'й}^] _e^t"!

Геном

I семенники

I ЯИЧНИКИ

I эмбрионы

_{iinjiijriijifi}

_ІНШІМ

_{ііііііі}

_{{нііііііі}

Рис. 9. Усредненные профили экспрессии генов в различных плечах хромосом дрозофилы в зависимости от времени репликации. Данные основаны на результатах анализа представленности транскриптов генов в разных библиотеках кДНК (A; Boutanaev et al., 2002) и геномного исследования экспрессии генов дрозофилы в развитии (Б; Arbeitman et al., 2002). А: разными цветами обозначены библиотеки кДНК, использованные в анализе, расшифровка на рисунке. HP - недореплицированные районы; фНР/ПР - поздно реплицирующиеся районы, фланкирующие HP районы; НР-/ПР - районы, поздно реплицирующиеся в культуре клеток, но полностью представленные в слюнной железе; РР - рано реплицирующиеся районы. СУММА - хромосомное плечо целиком (А). Б: усредненный уровень экспрессии всех генов, присутствующих в исследовании приведен на каждой диаграмме (черный цвет). Красный - повышенный уровень экспрессии, зеленый -пониженный уровень экспрессии. Э - эмбриональные стадии до вылупления; Л -личинки, 1 - 3 возраст; К - стадии предкуколки и куколки,с?¹- взрослые самцы;? -взрослые самки. На осях ординат: А - относительная экспрессия генов (от отрицательных значений к положительным - усиление экспрессии); Б - процент генов в каждой категории. На основании обоих наборов данных видно явное обогащение HP районов генами, специфически экспрессирующимися в развитии самца и обеднение генами, экспрессирующимися в эмбрионах и яичниках самок (остальные комментарии в тексте). Линии по диаграммами указывают стадии, для которых наблюдается сатистически достоверное (Р<0,001) отличие от усредненного для целого хромосомного плеча профиля экспрессии.

концентрируются в наиболее поздно реплицирующихся участках НР-/ПР районов, в то время как ближе к границам появляются гены, транскрибирующиеся в яичниках и эмбрионах. В то же время, фНР/ПР районы, независимо от из положения в геноме, содержат меньше генов, активных в семенниках и больше генов, экспрессирующихся в яичниках и эмбрионах по сравнению HP и НР-/ПР районами. Поскольку большинство (96%) недореплицированных районов перекрываются с ПР районами в клетках Кс, можно предположить, что фНР/ПР районы также поздно реплицируются и в слюнной железе, однако недостаточно для того, чтобы быть недореплицированными. Эти данные позволяют предположить, что, хотя в поздно реплицирующихся районах преобладающими являются гены, активные в развитии тканей зародышевого пути самцов, возможно, они не являются единственной группой, предпочтительно располагающейся в недореплицированных и поздно реплицирующихся районах генома.

Такое скопление генов, имеющих сходные программы экспрессии, может предполагать наличие так называемых транскрипционных территорий в поздно реплицирующихся районах, то есть групп генов, не обязательно гомологичных между собой, располагающихся кластером в геноме и имеющих общую регуляцию (Spellman and Rubin, 2002). Мы провели независимое исследование транскрипционных территорий в геноме дрозофилы на фоне временной программы репликации (Рис. 10). Для этого развитие дрозофилы было разбито на 7 стадий: эмбрионы 0-3 часов развития (Э1), эмбрионы 3-10 часов развития (Э2), эмбрионы 10-24 часов развития (ЭЗ), личинки (Л), куколки (К), взрослые самцы (сГ) и

взрослые самки (). Данные для каждого гена на каждой стадии были усреднены, после чего расположенные в соответствии с геномной позицией были обработаны с помощью плавающего окна размером в 9 генов {см. Материалы и методы). Таким способом были обнаружены районы, содержащие гены, имеющие сходные программы экспрессии. Поиск транскрипционных территорий в геноме дрозофилы показал, что помимо

14.5 15.0 15.5 16.0 16.5 17.0 17.5 18.0 18.5 19.0 19.5 М.П.Н

PP НР-/ПР фНР/ПР HP фНР/ПР PP HP фНР/ПР PP фНР/ПР HP фНР/ПР PP НР-/ПР PP НР-ПР

Рис. 10. Корреляция времени репликации и транскрипционных территорий на участке 5,8 м.п.н. хромосомного плеча 2R. Сверху и снизу показана геномная шкала, на которой указаны участки, характеризующиеся разным временем репликации. А - схематическое изображение четырех типов районов (верхний и ножний ряд столбцов): HP - черный цвет, фНР/ПР и НР-/ПР - серый цвет, РР - белый цвет, а также пять типов специфически экспрессирующихся генов из исследования Boutanaev et a I., 2002. Гены, имеющие специфическую программу, показаны пятью рядями столбцов: семенники - синим, яичники -красным, эмбрионы - голубым, личинки/куколки - зеленым, головы - фиолетовым цветом. Б - определение транскрипционных территорий с использованием "плавающего окна" на основании данных по экспрессии генов в развитии D. melanogaster (Arbeitman et al., 2002). Э1 - эмбрионы 0-3 часов развития, Э2 эмбрионы 3-Ю часов, ЭЗ -10-24 часов, Л - личинки, К - куколки, о"- взрослые самцы,? - взрослые самки. Каждая точка представляет статус гена: ниже горизонтальных линий - пониженная экспрессия, выше - повышенная экспрессия на каждой из семи стадий развития. Обнаруженные транскрипционные территории заключены в желтые прямоуугольники.

генов, специфически активируемых в семенниках, существуют и другие группы, имеющие различные программы активации, однако, как было замечено выше, именно эта группа наиболее представлена в поздно реплицирующихся районах и, по-видимому, образует в них транскрипционные территории. При этом границы этих транскрипционных территорий достаточно точно совпадают с границами поздно реплицирующихся и недореллицирующихся районов (Рис. 10). На рисунке наиболее крупные транскрипционные территории обведены рамками.

Аналогичное наблюдение можно сделать и в случае результатов по представленности транскриптов. Мы расположили гены, для которых была показана специфичность экспрессии (Boutanaev et al., 2002) в порядке их положения в геноме, и сравнили с паттернами репликации, полученными для культуры клеток Кс (Schuebeler et al., 2002) и полученными в этом исследовании (Рис. 11 А). Оказалось, что в этом случае также наблюдается концентрация генов, активных в семенниках самца, в HP районах. При наложении на временной паттерн репликации, схематически изображенный разными цветами, видно, что во многих случаях обнаруженные транскрипционные территории совпадают с поздно и недореплицированными районами.

8 целом, эти данные позволяют нам предложить модель функциональной организации генома дрозофилы, в которой время репликации и включение/выключение транскрипции генов тесно связаны между собой, образуя в результате эволюции высокоорганизованную структуру генома (Рис, 11 Б).

Связь между транскрипционной корегуляции генов и времени репликации в S фазе клеточного цикла позволила нам провести подробный геномный анализ групп корегулируемых генов (транскрипционных территорий), используя данные об экспрессии генов в развитии (Рис. 10) (Arbeitman et af., 2002). В результате была обнаружена значительная корреляция между границами выявленных транскрипционных территорий и HP или ПР районами, позволяющая предположить, что одни и те же

2L

2R

Г ' І^79Е

і і

і» !

|iri!

I 1

С 1

і J

І ТВ

Рис. 11. Распределение генов с разной специфичностью в геноме дрозофилы в зависимости от времени репликации. А - гены, проявляющие специфическую экспрессию в семенниках (синий), яичниках (красный), эмбрионах (голубой), личинках/куколках (зеленый) и головах взрослых мух (фиолетовый), показаны в порядке их расположения в геноме; также показаны районы HP (черный цвет), ПР районы в клетках Кс (серый цвет). Цитологические обозначения районов HP приведены сбоку. Б - связь между транскрипционной специфичностью (для семенников, яичников и эмбрионов) и организацией генома. Гены, активные в семенниках, кластеризуются в ПР районах, в то время как рано реплицирующиеся районы содержат гены, экспрессирующиеся в эмбрионах и яичниках.

семенники яичники

эмбрион HP

личинки/куколки ч ПР
голова РР

S-фаза

=г

с; rz си о.

геном

эмбрионы

белковые комплексы (например, содержащие SU(UR), НР1) могут служить регуляторами как транскрипции, так и времени репликации. Как и ожидалось, большинство транскрипционных территорий связаны с генами, специфичными для семенников, яичников или эмбрионов. Кроме того, 30 обнаруженных HP районов (58%; 3-х кратное обогащение по сравнению со случайно ожидаемым, Р<0,01) перекрываются с обнаруженными ранее в геноме дрозофилы транскрипционными территориями (Таб. 4) (Spellman and Rubin, 2002).

Обобщение данных геномного исследования недорепликации в политенных хромосомах и результатов нескольких других широкомасштабных исследований транскрипции и репликации у дрозофилы при использовании аннотированной геномной последовательности в качестве шкалы, позволили провести молекулярно-генетический анализ районов недорепликации и поздней репликации, который, возможно, облегчит понимание функциональной организации генома. В этом исследовании мы использовали уникальную способность белка SU(UR) регулировать недорепликацию в политенных хромосомах дрозофилы и охарактеризовали значительную долю генов (1036, 7,5%), находящихся в 52 HP районах. Эти районы располагаются в ПР сайтах хромосом и связываются с репрессирующими факторами, такими как НР1 (96% районов) и/или Pc-G (61% районов). Более того, 96% обнаруженных районов также поздно реплицируются в неполитенных клетках культуры Кс, демонстрируя удивительное соответствие программы репликации в двух физиологически очень различающихся типах клеток. Используя результаты других геномных исследований, мы показали, что гены, находящиеся в HP районах политенных хромосом и в ПР районах клеток Кс, образуют группы корегулирующихся генов, имеющих характерную экспрессию в семенниках, но не в яичниках и эмбрионах. К тому же, эти транскрипционные территории кластеризуются на более высоком уровне в разных плечах хромосом. Таким образом, была выявлена закономерность организации генома,

характеризующийся кластеризацией генов, имеющих общий контроль репликации и экспрессии.

Геномная кластеризация и дифференциальная репликация могут служить механизмами одновременного выключения генов, экспрессирующихся только в очень специализированных тканях. Эти процессы могут регламентироваться локус-контролирующими районами, и другими регуляторными элементами, подобными описанному для р-глобинового кластера у млекопитающих (Fraser et al., 1998). Инактивация HP районов может распространяться из особых центров, как это происходит в ПГХ (Zhimulev, 1998).

В заключение можно предложить модель, связывающую время репликации и транскрипционную активность генов (Рис. 11 Б). Согласно этой модели, гены, имеющие определенные программы экспрессии, могут кластеризоваться в геноме в виде транскрипционных территорий, что дает возможность их согласованной регуляции в развитии. При этом, гены, работающие в развитии семенников, остаются инактивированными большую часть времени и в большинстве тканей, подобно р-глобиновым генам млекопитающих. Это может быть также связано с тем, что у дрозофилы презумптивные клетки зародышевого пути целлюляризируются раньше соматических и, по-видимому, могут сильно отличаться по своим свойствам. Эмбриональные гены и гены, экспрессирующиеся в яичниках, проявляют противоположную тенденцию, располагаясь в основном в рано реплицирующихся областях генома. Дополнительно, было показано неожиданное сходство программ репликации в двух таких разных типах клеток, как культура Кс и клетках слюнных желез. Однако оба типа имеют соматическое происхождение и в рамках предлагаемой модели такое сходство становится более закономерным. Тем не менее, было бы интересно провести анализ временной программы репликации в клетках развивающихся семенников, поскольку, согласно нашей гипотезе, поздно реплицирующиеся районы должны реплицироваться рано в этом типе клеток и иметь иную хроматиновую организацию, обеспечивающую

нормальную работу заключенных в них генов Все районы поздней репликации в слюнной железе, по-видимому, имеют сходную структуру хроматина, поскольку регулируются единым хроматиновым фактором -белком SU(UR). Это может предполагать существование единого механизма, контролирующего такие участки. Это может прояснять эволюционный аспект появления таких кластеров. Возможно, часть районов возникла как генетические дупликации и потому содержат ортологичные гены (районы 89Е, 83Е, 39Е). В остальных районах не наблюдается скопления ортологов, более того, анализ базы данных Gene Ontology не показал обогащения HP районов генами, имеющими общее происхождение или биохимическую функцию. Это может означать, что гены, экспрессирующиеся в четко определенных клетках, собирались в кластеры под действием эволюционного отбора по принципу общей регуляции, что, безусловно, упрощает и повышает надежность этой регуляции. В пользу такого предположения может говорить факт, что хромосомные перестройки, в которых одна точка разрыва лежит в недореплицированном районе, вторая точка разрыва также происходит в недореплицированном участке (Kaufmann, 1946; Дубинин et at., 1941). При этом, обмен генами происходит между районами, имеющими сходную регуляцию, и не вызывает кардинальных изменений в работе генов. В то же время, в случае перенесения поздно реплицирующегося гена в рано реплицирующееся окружение, он может попадать под влияние иных регуляторных элементов и значительно изменять программу экспрессии. Поэтому, обмен генами между поздно реплицирующимися районами может быть более предпочтителен.

Таким образом, нами проведено исследование поздно реплицирующихся гетерохроматиновых районов в геноме дрозофилы. Анализ последовательностей ДНК из районов прицентромерного гетерохроматина, проведенный с помощью метода микроклонирования, значительно расширил сведения о моле кул ярно-генетической организации этих районов:

4.3. Выводы

1. в результате анализа библиотек микроклонов, полученных из прицентромерных районов политенных хромосом, обнаружены ранее неизвестные повторенные и уникальные последовательности.

2. районы прицентро мерного гетерохроматина имеют сходную молекулярную организацию с полностью политенизирующимися основаниями плеч хромосом, которые, по-видимому, могут рассматриваться как зона перехода между эу- и гетерохроматином.

3. с помощью микрочипов определены границы и степень представленности ДНК в 52 районах недорепликации и построена геномная карта недорепликации ДНК в политенных хромосомах слюнных желез D. meianogaster.

4. клетки в культуре Кс и клетки слюнных желез имеют похожую картину репликации

5. гены, экспрессирующиеся в процессе дифференцировки тканей зародышевого пути самцов, организованы в кластеры, располагающиеся в недореплицированных и поздно реплицирующихся районах генома D. meianogaster,

6. предложена и обсуждена модель организации генома D. meianogaster, связывающая временную программу репликации и регуляцию генов.

5. БЛАГОДАРНОСТИ

Автор благодарит Игоря Федоровича Жимулева проводившего научное руководство представленной работой, Гиоргоса Кристофидеса и Фотиса Кафатоса из Европейской Молекулярно Биологической Лаборатории, с которыми автор сотрудничал во время выполнения части работы, касающейся проведения экспериментов с микрочипами и анализа полученных результатов, Елену Сергеевну Беляеву, Сергея Анатольевича Демакова и Артема Анатольевича Алексеенко за активное и заинтересованное обсуждение работы и помощь в выполнении некоторых экспериментов, Валерия Федоровича Семешина за предоставление электронно-микроскопических фотографий политенных хромосом, Виктора Шлому, Алексея Пиндюрина и многих-многих других людей, с которыми автор контактировал во время выполнения работы.

6. СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

7. Дубинин, Н.П., Хвостова, В.В. and Мансурова, В.В. (1941) хромосомные аберрации,летальные мутации и доза Х-лучей. Докл АН СССР, 31, 386-388.

8. Прокофьева-Бельговская, А.А. (1986} Гетерохроматические районы хромосом. Москва. Наука, 1-432.

9. Abad, J.P., Agudo, М., Molina, I., Losada, A., Ripoll, P. and Villasante, A. (2000) Pericentromeric regions containing 1.688 satellite DNA sequences show anti-kinetochore antibody staining in prometaphase chromosomes of Drosophila melanogaster. Мої Gen Genet, 264, 371-377.

10. Abad, J.P., Carmena, M., Baars, S., Saunders, R.D., Glover, D.M., Ludena, P., Sentis, C, Tyler-Smith, C. and Villasante, A. (1992) Dodeca satellite: a conserved G+C-rich satellite from the centromertc heterochromatin of Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci USA, 89,4663-4667.

11. Alekseyenko, A.A., Demakova, O.V., Belyaeva, E.S., Makarevich, G.F., Kotlikova, I.V., Nothiger, R. and Zhimulev, I.F. (2002) Dosage compensation and intercalary heterochromatin in X chromosomes of Drosophila melanogaster. Chromosome, 111,106-113.

12. Arbeitman, M.N., Furlong, E.E., Imam, F., Johnson, E., Null, B.H., Baker, B.S., Krasnow, M.A., Scott, MP., Davis, R.W. and White, K.P. (2002) Gene expression during the life cycle of Drosophila melanogaster. Science, 297, 2270-2275.

13. Belyaeva, E.S., Zhimulev, I.F., Volkova, EL, Alekseyenko, A.A., Moshkin, Y.M. and Koryakov, D.E. (1998) $u(UR)E$: a gene suppressing DNA underreplication in intercalary and pericentric heterochromatin of Drosophila melanogaster polytene chromosomes. Proc Natl Acad Sci U S A, 95, 7532-7537.

14. Berghella, L, and Dimitri, P. (1996) The heterochromatic rolled gene of Drosophila melanogaster is extensively polytenized and

transcriptionally active in the salivary gland chromocenter. Genetics, 144, 117-125.

9. Bonaccorsi, S., Gatti, M., Pisano, С and Lohe, A. (1990) Transcription of a satellite DNA on two Y chromosome loops of Drosophila meianogaster. Chromosome, 99, 260-266.

10. Bonaccorsi, S., Pisano, C, Puoti, F. and Gatti, M. (1988) Y chromosome loops in Drosophila meianogaster. Genetics, 120, 1015-1034.

11. Boutanaev, A.M., Kalmykova, A.I., Shevelyov, Y.Y. and Nurminsky, D.I. (2002) Large clusters of co-expressed genes in the Drosophila genome. Nature, 420, 666-669.

12. Brosseau, G. (1960) Genetic analysis of the male fertility factors on the Y chromosome of Drosophila meianogaster. Genetics, 45, 257-274.

13. Caizzi, R., Caggese, С and Pimpinelli, S. (1993) Bari-1, a new transposon-iike family in Drosophila meianogaster w'Ah a unique heterochromatic organization. Genetics, 133, 335-345.

14. Carmena, M., Abad, J.P., Villasante, A. and Gonzalez, C. (1993) The Drosophila meianogasterdodecasatellite sequence is closely linked to the centromere and can form connections between sister chromatids during mitosis. J Cell Sci, 105 ( Pt 1), 41-50.

15. Cayirlioglu, P., Ward, W.O., Silver Key, S.C. and Duronio, R.J. (2003) Transcriptional repressor functions of Drosophila E2F1 and E2F2 cooperate to inhibit genomic DNA synthesis in ovarian follicle cells. Мої Cell Biol, 23, 2123-2134.

16. Cenci, G., Belloni, G. and Dimitri, P. (2003) 1(2)41Aa, a heterochromatic gene of Drosophila meianogaster, is required for mitotic and meiotic chromosome condensation. Genet Res, 81, 15-24.

17. Cheutin, Т., McNairn, A.J., Jenuwein, Т., Gilbert, D.M., Singh, P.B. and Misteli, T. (2003) Maintenance of stable heterochromattn domains by dynamic HP1 binding. Science, 299, 721-725.

18. Cimbora, D.M., Schubeler, D., Reik, A., Hamilton, J,, Francastel, C, Epner, E.M. and Groudine, M. (2000) Long-distance control of origin choice and replication timing in the human beta-globin locus are independent of the locus control region. Мої Cell Biol, 20, 5581-5591.

19. Cordeiro, M., Wheeler, L, Lee, C.S., Kastritsis, CD. and Richardson, R.H. (1975) Heterochromatic chromosomes and satellite DNAs of Drosophlla nasutoides. Chromosoma, 51, 65-73.

20. Devlin, R.H., Bingham, B. and Wakimoto, ВТ. (1990) The organization and expression of the light gene, a heterochromatic gene of Drosophlla melanogaster. Genetics, 125, 129-140.

21. DiBartolomeis, S.M., Tartof, K.D. and Jackson, F.R. (1992) A superfamily of Drosophlla satellite related (SR) DNA repeats restricted to the X chromosome euchromatin. Nucleic Acids Res, 20, 1113-1116.

22. Dickson, E., Boyd, J.B. and Laird, CD. (1971) Sequence diversity of polytene chromosome DNA from Drosophlla hydei. J Мої Biol, 61, 615-627.

23. Dimitri, P. (1991) Cytogenetic analysis of the second chromosome heterochromatin of Drosophlla melanogaster. Genetics, 127, 553-564.

24. Dimitri, P. (1997) Constitutive heterochromatin and transposable elements in Drosophlla melanogaster. Genetica, 100, 85-93.

25. Dorer, D.R., Rudnick, J.A., Moriyama, E.N. and Christensen, А.С (2003) A family of genes clustered at the Triplo-lethal locus of Drosophlla melanogaster has an unusual evolutionary history and significant synteny with Anopheles gambiae. Genetics, 165, 613-621.

26. Eberl, D.F., Duyf, B.J. and Hilliker, A.J. (1993) The role of heterochromatin in the expression of a heterochromatic gene, the rolled locus of Drosophlla melanogaster. Genetics, 134, 277-292.

27. Endow, S.A. and Gall, J.G. (1975) Differential replication of satellite DNA in polyploid tissues of Drosophita virilis. Chromosoma, 50, 175-179.

28. Endow, S.A., Polan, M.L. and Gall, J.G. (1975) Satellite DNA sequences of Drosophlla melanogaster. J Мої Biol, 96, 665-692.

29. Ferguson, B.M. and Fangman, W.L. (1992) A position effect on the time of replication origin activation in yeast. Cell, 68, 333-339.

30. Fraser, P., Gribnau, J. and Trimbom, T. (1998) Mechanisms of developmental regulation in globin loci. CurrOpin Hematol, 5, 139-144.

31. Ganetzky, B. (1977) On the components of segregation distortion in Drosophila melanogaster. Genetics, 86, 321-355.

32. Gatti, M- and Baker, B.S. (1989) Genes controlling essential cell-cycle functions in Drosophila melanogaster. Genes Dev, 3, 438-453.

33. Gatti, M. and Pimpinelli, S. (1992) Functional elements in Drosophila melanogaster heterochromatin. Annu Rev Genet, 26, 239-275.

34. Gilbert, DM. (2002) Replication timing and transcriptional control: beyond cause and effect. Curr Opin Cell Biol, 14, 377-383.

35. Goldstein, L.S., Hardy, R.W. and Lindsley, D.L. (1982) Structural genes on the Y chromosome of Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad SciUSA, 79, 7405-7409.

36. Greil, F., van der Kraan, I., Delrow, J., Smothers, J.F., de Wit, E., Bussemaker, H.J., van Driel, R._T Henikoff, S. and van Steensel, B. (2003) Distinct HP1 and Su(var)3-9 complexes bind to sets of developmental^ coexpressed genes depending on chromosomal location. Genes Dev, 17, 2825-2838.

37. Hecht, A., Strahl-Bolsinger, S. and Grunstein, M. (1996) Spreading of transcriptional repressor SIR3 from telomeric heterochromatin. Nature, 383, 92-96.

38. Heun, P., Laroche, Т., Raghuraman, M.K. and Gasser, S.M. (2001) The positioning and dynamics of origins of replication in the budding yeast nucleus. J Cell Biol, 152, 385-400.

39. Hild, M., Beckmann, В., Haas, S.A., Koch, В., Solovyev, V., Busold, C, Fellenberg, K., Boutros, M., Vingron, M., Sauer, F., Hoheisel, J.D. and Paro, R. (2003) An integrated gene annotation and transcriptional profiling approach towards the full gene content of the Drosophila genome. Genome Biol, 5, R3.

40. Hilliker, A.J. (1976) Genetic analysis of the centromeric heterochromatin of chromosome 2 of Drosophila melanogaster. deficiency mapping of EMS-induced lethal complementation groups. Genetics, 83, 765-782.

41. Hilliker, A.J., Appels, R. and Schalet, A. (1980) The genetic analysis of D. melanogaster heterochromatin. Cell, 21, 607-619.

42. Holmquist, G.P. (1987) Role of replication time in the control of tissue-specific gene expression. Am J Hum Genet, 40, 151-173.

43. Hoskins, R.A., Smith, CD., Carlson, J.W., Carvalho, A.B., Halpern, A., Kaminker, J.S., Kennedy, C, Mungall, C.J., Sullivan, B.A., Sutton, G.G., Yasuhara, J.C, Wakimoto, ВТ., Myers, E.W., Celniker, S.E., Rubin, G.M. and Karpen, G.H. (2002) Heterochromatic sequences in a Drosophila whole-genome shotgun assembly. Genome Biol, 3, RESEARCH0085.

44. Hsieh, T. and Brutlag, D. (1979) Sequence and sequence variation within the 1.688 g/cm3 satellite DNA of Drosophila melanogaster. J Мої Biol, 135, 465-481.

45. Jenuwein, T. and Allis, CD. (2001) Translating the histone code. Science, 293, 1074-1080.

46. Kaufmann, B.P. (1946) Organization of the chromosome I. Break distribution and chromosome recombination in Drosophila melanogaster. J ExptlZool, 102, 293-320.

47. Kaufmann, B.P. and Gay, H. (1958) The nuclear membrane as an intermediary in gene-controlled reactions. The Nucleus, 1, 57-74.

48. Kay, M.A., Zhang, J.Y. and Jacobs-Lorena, M. (1988) Identification and germline transformation of the ribosomal protein rp21 gene of Drosophila: complementation analysis with the Minute QUI locus reveals nonidentity. Мої Gen Genet, 213, 354-358.

49. Koryakov, D.E., Alekseyenko, A.A. and Zhimulev, I.F. (1999) Dynamic organization of the beta-heterochromatin in the Drosophila melanogaster polytene X chromosome. Мої Gen Genet, 260, 503-509.

50. Koryakov, D.E., Belyaeva, E.S., Alekseyenko, A.A. and Zhimulev, IF (1996) Alpha and beta heterochromatin in polytene chromosome 2 of Drosophila melanogaster. Chromosome, 105, 310-319.

51. Le, M.H., Duricka, D. and Karpen, G.H. (1995) Islands of complex DNA are widespread in Drosophila centric heterochromatin. Genetics, 141,283-303.

52. Levinger, L. and Varshavsky, A. (1982a) Protein D1 preferentially binds A + T-rich DNA in vitro and is a component of Drosophila melanogaster r\ucleosomes containing A + T-rich satellite DNA. Proc Natl AcadSciUSA, 79, 7152-7156.

53. Levinger, L. and Varshavsky, A. (1982b) Selective arrangement of ubiquitinated and D1 protein-containing nucleosomes within the Drosophila genome. Cell, 28, 375-385.

54. Lohe, A.R. and Brutlag, D.L. {1986) Multiplicity of satellite DNA sequences in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci USA, 83, 696-700.

55. Lohe, A.R. and Hilliker, A.J. (1995) Return of the H-word (heterochromatin). CurrOpin Genet Dev, 5, 746-755.

56. Lohe, A.R., Hilliker, A.J. and Roberts, P.A. (1993) Mapping simple repeated DNA sequences in heterochromatin of Drosophila melanogaster. Genetics, 134, 1149-1174.

57. Makunin, I.V., Volkova, E.I., Belyaeva, E.S., Nabirochkina, E.N., Pirrotta, V. and Zhimulev, I.F. (2002) The Drosophila suppressor of underreplication protein binds to late-replicating regions of polytene chromosomes. Genetics, 160, 1023-1034.

58. Merchant, G.E. and Holm, D.G. (1988) Genetic Analysis of the Heterochromatin of Chromosome 3 in Drosophila melanogaster. II. Vital Loci Identified Through EMS Mutagenesis. Genetics, 120, 519-532.

59. Miklos, G.L. and Cotsell, J.N. (1990) Chromosome structure at interfaces between major chromatin types: alpha- and beta-heterochromatin. Bioessays, 12,1-6.

60. Miklos, G.L., Yamamoto, M.T., Davies, J. and Pirrotta, V. (1988) Microcloning reveals a high frequency of repetitive sequences characteristic of chromosome 4 and the beta-heterochromatin of Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A 85, 2051-2055.

61. Moshkin, Y.M., Alekseyenko, A.A., Semeshin, V.F., Spierer, A., Spierer, P., Makarevich, G.F., Belyaeva, E.S. and Zhimulev, IF. (2001) The bithorax complex of Drosophila melanogaster. Underreplication and morphology in poiytene chromosomes. Proc Natl Acad Sci USA, 98, 570-574.

62. Murphy, T.D. and Karpen, G.H. (1995) Localization of centromere function in a Drosophila minichromosome. Cell, 82, 599-609.

63. Myster, S.H., Wang, F., Cavallo, R„ Christian, W., Bhotika, S., Anderson, C.T. and Peifer, M. (2004) Genetic and bioinformatic analysis of 41С and the 2R heterochromatin of Drosophila melanogaster. a window on the heterochromatin-euchromatin junction. Genetics, 166, 807-822.

64. Oda, H., Uemura, Т., Shtomi, K., Nagafuchi, A., Tsukita, S. and Takeichi, M. (1993) Identification of a Drosophila homologue of alpha-catenin and its association with the armadillo protein. J Cell Biol, 121, 1133-1140.

65. Oellers, N. and Hafen, E. (1996) Biochemical characterization of rolledSem, an activated form of Drosophila mitogen-activated protein kinase. J Biol Chem, 271, 24939-24944.

66. Parks, S. and Wieschaus, E. (1991) The Drosophila gastrulation gene concertina encodes a G alpha-like protein. Cell, 64, 447-458.

67. Pimpinelli, S., Berloco, M., Fanti, L, Dimitri, P., Bonaccorsi, S., Marchetti, E., Caizzi, R., Caggese, C. and Gatti, M. (1995) Transposable elements are stable structural components of Drosophila melanogaster heterochromatin. Proc Natl Acad Sci USA, 92, 3804-3808.

68. Rodriguez Alfageme, C, Rudkin, G.T. and Cohen, L.H. (1980) Isolation, properties and cellular distribution of D1, a chromosomal protein of Drosophila. Chromosome, 78,1-31.

69. Rollins, R.A., Morcillo, P. and Dorsett, D. (1999) Nipped-B, a Drosophila homologue of chromosomal adherins, participates in activation by remote enhancers in the cut and Ultrabithorax genes. Genetics, 152, 577-593.

70. Ross, J.M. and Zarkower, D. (2003) Polycomb group regulation of Hox gene expression in C. elegans. Dev Cell, 4, 891-901.

71. Rubtsov, N., Senger, G., Kuzcera, H., Neumann, A., Kelbova, C, Junker, K., Beensen, V. and Claussen, U. (1996) Interstitial deletion of chromosome 6q: precise definition of the breakpoints by microdissection, DNA amplification, and reverse painting. Hum Genet, 97, 705-709.

72. Schuebeler, D., Scalzo, D., Kooperberg, C, van Steensel, В., Delrow, J. and Groudine, M. (2002) Genome-wide DNA replication profile for Drosophila melanogaster. a link between transcription and replication timing. Nat Genet, 32, 438-442.

73. Schulze, S., Sinclair, D.A., Silva, E., Fitzpatrick, K.A., Singh, M., Lloyd, V.K., Morin, K.A., Kim, J., Holm, D.G., Kennison, J.A. and Honda, B.M. (2001) Essential genes in proximal 3L heterochromatin of Drosophila melanogaster. Мої Gen Genet, 264, 782-789.

74. Selig, S., Okumura, K., Ward, DC. and Cedar, H. (1992) Delineation of DNA replication time zones by fluorescence in situ hybridization. EmboJ, 11, 1217-1225.

75. Semeshin, F., Belyaeva, S. and Zhimulev, F. (2001) Electron microscope mapping of the pericentric and intercalary heterochromatic regions of the polytene chromosomes of the mutant Suppressor of underrepiication in Drosophila melanogaster, Chromosoma, 110, 487-500.

76. Simon, I., Tenzen, Т., Mostoslavsky, R., Fibach, E., Lande, L, Milot, E., Gribnau, J., Grosveld, F., Fraser, P. and Cedar, H. (2001) Developmental regulation of DNA replication timing at the human beta globin locus. EmboJ, 20, 6150-6157.

77. Spellman, P,T. and Rubin, G.M. (2002) Evidence for large domains of similarly expressed genes in the Drosophila genome. J Biol, 1, 5.

78. Spotswood, H.T. and Turner, B.M. (2002) An increasingly complex code. J CHn Invest, 110, 577-582.

79. Stevenson, J.B. and Gottschling, D.E. (1999) Telomeric chromatin modulates replication timing near chromosome ends. Genes Dev, 13,146-151.

80. Strahl, B.D. and Allis, CD. (2000) The language of covalent histone modifications. Nature, 403,41-45.

81. Tchurikov, N.A., Kretova, O.V., Chernov, B.K., Golova, Y.B., Zhimulev, IF. and Zykov, I.A. (2004) SuUR protein binds to the boundary regions separating forum domains in Drosophila melanogaster. J Biol Chem, 279,11705-11710.

82. Telenius, H., Carter, N.P., Bebb, C.E., Nordenskjold, M., Ponder, B.A. and Tunnacliffe, A. (1992) Degenerate oligonucleotide-primed PCR. general amplification of target DNA by a single degenerate primer. Genomics, 13, 718-725.

83. Torok, T„ Harvie, P.D., Buratovich, M. and Bryant, P.J. (1997) The product of proliferation disrupter is concentrated at centromeres and required for mitotic chromosome condensation and cell proliferation in Drosophila. Genes Dev, 11, 213-225.

84. Tudor, M., Mitchelson, A. and O'Hare, K. (1996) A 1.5 kb repeat sequence flanks the suppressor of forked gene at the euchromatin-heterochromatin boundary of the Drosophila melanogaster X chromosome. Genet Res, 68, 191-202.

85. Tulin, A., Stewart, D.andSpradling, AC. (2002) The Drosophila heterochromatic gene encoding poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) is required to modulate chromatin structure during development. Genes Dev, 16,2108-2119.

86. van Steensel, В., Delrow, J. and Henikoff, S. (2001) Chromatin profiling using targeted DNA adenine methyitransferase. Nat Genet, 27, 304-308.

87. Vaury, С, Bucheton, A. and Pelisson, A. (1989) The beta heterochromatic sequences flanking the I elements are themselves defective transposable elements. Chromosoma, 98, 215-224.

88. Volkova, E.I., Yurlova, A.A., Kolesnikova, T.D., Makunin, I.V. and Zhimulev, I.F. (2003) Ectopic expression of the Suppressor of Underreplication gene inhibits endocycles but not the mitotic cell cycle in Drosophila melanogaster. Мої Genet Genomics, 270, 387-393.

89. Wakimoto, B.T. and Hearn, M.G. (1990) The effects of chromosome rearrangements on the expression of heterochromatic genes in chromosome 2L of Drosophila melanogaster. Genetics, 125, 141-154.

90. Warner, T.S., Sinclair, D.A., Fitzpatrick, K.A., Singh, M., Devlin, R.H. and Honda, B.M. (1998) The light gene of Drosophila melanogaster encodes a homologue of VPS41, a yeast gene involved in cellular-protein trafficking. Genome, 41, 236-243.

91. Williams, S.M. and Robbins, L.G. (1992) Molecular genetic analysis of Drosophila rDNA arrays. Trends Genet, 8, 335-340.

92. Yang, I.V., Chen, E., Hasseman, J.P., Liang, W., Frank, B.C., Wang, S., Sharov, V., Saeed, A.I., White, J., Li, J., Lee, N.H., Yeatman, T.J. and Quackenbush, J. (2002) Within the fold: assessing differential expression measures and reproducibility in microarray assays. Genome Biol, 3, research 0062.

93. Zhang, P. and Spradling, A.C. (1995) The Drosophila salivary gland chromocenter contains highly polytenized subdomains of mitotic heterochromatin. Genetics, 139, 659-670.

94. Zhimulev, I.F. (1998) Polytene chromosomes, heterochromatin, and position effect variegation. Adv Genet, 37, 1-566.

95. Zhimulev, I.F. and Belyaeva, E.S. (2003) Intercalary heterochromatin and genetic silencing. Bioessays, 25, 1040-1051.

96. Zhimulev, I.F., Belyaeva, E.S., Makunin, I.V., Pirrotta, V., Semeshin, V.F., Alekseyenko, A.A., Belyakin, S.N., Volkova, E.I., Koryakov, D.E., Andreyeva, E.N., Demakova, O.V., Kotlikova, I.V.,

Kolesnikova, T.D., Boldyreva, L.V. and Nanayev, R.A. (2003a) Intercalary heterochromatin in Drosophila melanogaster polytene chromosomes and the problem of genetic silencing. Genetica, 117, 259-270.

97. Zhimulev, I.F., Belyaeva, E.S., Makunin, I.V., Pirrotta, V., Volkova, E.I., Alekseyenko, A.A., Andreyeva, E.N., Makarevich, G.F., Boldyreva, L.V., Nanayev, R.A. and Demakova, O.V. (2003b) Influence of the SuUR gene on intercalary heterochromatin in Drosophila melanogaster polytene chromosomes. Chromosome, 111, 377-398.

98. Zhimulev, I.F., Belyaeva, E.S. and Semeshin, V.F. (1981) Informational content of polytene chromosome bands and puffs. CRC Crit Rev Biochem, 11, 303-340.

99. Zhimulev, I.F., Belyaeva, E.S., Semeshin, V.F., Shloma, V.V., Makunin, I.V. and Volkova, E.I. (2003c) Overexpression of the SuUR gene induces reversible modifications at pericentric, telomeric and intercalary heterochromatin of Drosophila melanogaster polytene chromosomes. J Cell Set, 116, 169-176.

100. Zhimulev, IF., Makunin, I.V,, Volkova, E.I., Pirrotta, V. and Beliaeva, E.S. (2000) [Effect of four doses of the Su(UR)ES gene on intercalary heterochromatin in Drosophila melanogaster]. Genetika, 36, 1061-1070.

101. Zhimulev, IF., Pokholkova, G.V., Bgatov, A.V., Semeshin, V.F., Umbetova, G.H. and Belyaeva, E.S. (1983) Genetic interpretation of polytene chromosomes banding pattern. Мої Biol Rep, 9, 19-23.

Актуальность проблемы

Впервые описаны последовательности из прицентромерных районов, политенизирующихся у мутантов Su(UR) . В ходе этой работы были прокартированы цитологически несколько протяженных участков ДНК, которые не были прокартированы в рамках проекта по секвенированию генома Drosophila melanogaster. Впервые построена точная молекулярная карта политенизации, на которой нанесены 52 протяженных района недорепликации, на всех длинных плечах хромосом дрозофилы. Проведено обобщение нескольких наборов данных, полученных разными авторами, касающихся репликации и экспрессии генома дрозофилы, что позволило сделать вывод об обогащении районов недорепликации генами, специфически коактивируемыми в клетках зародышевого пути самцов дрозофилы. Предложен новый принцип организации генома D. melanogaster - кластеризация генов в поздно реплицирующихся областях, облегчающая их совместную регуляцию.

Определено генетическое содержание части прицентромерного гетерохроматина. Построена геномная карта политенизации ДНК в слюнной железе D. melanogaster, на основании которой определены границы и генетический состав 52 районов интеркалярного гетерохроматина, содержащих 1036 генов, что позволяет исследовать содержащиеся в них гены и особенности репликации ДНК. 1.4. Апробация работы Основные результаты этой работы были представлены: На Международных Студенческих Конференциях 2000 и 2001 годов На V и VI международных конференциях по гетерохроматину 2001 и 2003 годов. На XIII Всероссийском симпозиуме «Структура и функции клеточного ядра», Санкт-Петербург, 2000. На Съезде ВОГиС, Москва, 2004 г 1.5. Список публикаций по теме диссертации

1. Белякин С.Н., Мошкин Ю.М., Рубцов Н.Б., Кокоза Е.Б., Спирер П., Жимулев И.Ф. Анализ последовательностей ДНК из районов прицентромерного гетерохроматина в линии Su(UR)ES у Drosophila meianogaster. (Тезисы на XIII Всероссийском симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (Санкт-Петербург, октябрь, 2000) Цитология 42, 264-265 (Тезисы)) 2. Koryakov D.E., Domanitskaya E.V., Kolesnikova T.D., Belyakin S.N., Belyaeva E.S., Semeshin V.F. and Zhimulev I.F. (2001). Genetic control of heterochromatin differential polytenization in Drosophila. Chromosome Research 9, S1,122-123 (Тезисы).

3. Belyakin S.N., Moshkin Yu. M., Rubtsov N.B., Semeshin V.F., Kokoza E.B., Alekseyenko A.A., Volkova E.I., Belyaeva E.S., Makunin IV., Spierer P., Zhimulev I.F. Cloning and charachterization of DNA of the Plato Atlantis region in polytene chromosomes of the Su(UR)ES mutant. Fifth International Conference on Drosophila heterochromatin, June 18-22, 2001, Cortona, Italy (Тезисы).

4. Koryakov D.E., Domanitskaya E.V., Kolesnikova T.D., Belyakin S.N., Belyaeva E.S., Semeshin V.F., Zhimulev I.F. Genetic control of heterochromatin differential polytenization in Drosophila. Fifth International Conference on Drosophila heterochromatin, June, 2001, Cortona, Italy (Тезисы).

5. Moshkin Yu. M., Belyakin S.N., Rubtsov N.B., Kokoza E.B , Alekseyenko A.A., Volkova E.I., Belyaeva E.S., Makunin I.V., Spierer P., Zhimulev I.F. (2002). Microdissection and sequence analysis of pericentric heterochromatin from the Drosophila melanogaster Suppressor of underreplication mutant. Chromosoma 111:114-125.

6. Koryakov D.E. Domanitskaya E.V., Belyakin S.N., Zhimulev !.F. (2003) Abnormal tissue-dependent polytenization of a block of third chromosome pericentric heterochromatin in Drosophila melanogaster. J Cell Sci 2003, 116, 1035-1044

7. Belyakin, S.N., Christophides, G.K., Alekseyenko, A.A., Nanayev, R.A., Boldyreva, L.V., Belyaeva, E.S., Makunin, I.V., Para, R., Kafatos F.C., Zhimulev, I.F. Microarray analysis of under-replication in salivary gland of Drosophila melanogaster June, 2003, Ravello, Italy (Тезисы).

8. Zhimulev I.F., Belyaeva E.S., Makunin I.V., Pirrotta I. V., Semeshin V.F., Alekseyenko A.A., Belyakin S.N., Volkova E.I., Koryakov D.E., Andreyeva E.N., Demakova O.V., Kotlikova I.V., Kolesnikova T.D., Boldyreva L.V., Nanayev R.A. (2003) Intercalary heterochromatin in Drosophila melanogaster polytene chromosomes and the problem of genetic silencing. Genetica, 117, 259-270.

9. Белякин C.H., Колесникова Т.Д., Макунин И.В., Волкова Е.И., Алексеенко А.А., Нанаев Р.А., Болдырева Л.В., Беляева Е.С., Жимулёв И.Ф. Интекалярный гетерохроматин в политенных хромосомах D. melanogaster и проблема генетического сайленсинга. Съезд ВОГиС, Москва, июнь, 2004 г. (Тезисы).

10.S.N. Belyakin, G.K. Christophides, A.A. Alekseyenko, E.V. Kriventseva, E.S. Belyaeva, R.A. Nanayev, IV. Makunin, Heidelberg Fly Array Consortium, F.C. Kafatos and I.F. Zhimulev (2005). Genomic analysis of DNA underreplication in Drosophila polytene chromosomes reveals a link between replication control and transcriptional territories. Proc Nat Acad Sci, принято к публикации

В политенных хромосомах дрозофилы выделяют два типа гетерохроматина - прицентромерный (далее ПГХ) и интеркалярный гетерохроматин (ИГХ), ПГХ располагается в основаниях плеч хромосом, а районы ИГХ рассеяны по геному и чередуются с длинными эухроматиновыми участками. Оба типа гетерохроматина проявляют позднюю репликацию в слюнных железах личинок дрозофилы. Из-за особого типа клеточного цикла (эндоцикл), характерного для тканей с политенными хромосомами, в котором одна S фаза следует за другой без расхождения гомологов, поздняя репликация во многих случаях приводит к недорепликации, которая является характерным признаком гетерохроматина. ПГХ политенных хромосом слюнных желез занимает 1 -2% общей длины хромосом по сравнению с 30% в митотических хромосомах, а в районах ИГХ недорепликация приводит к возникновению разломов хромосом, или слабых точек, с частотой, характерной для каждого района.

Практическая ценность

Прицентромерные районы всех плеч политенных хромосом слюнных дрозофилы объединяются в хромоцентр, в котором можно выделить две структуры: а- и р-ГХ. а-ГХ представляет собой плотное компактное тело, а р-ГХ - это бесструктурное сетчатое образование, к которому присоединены плечи хромосом (Heitz, 1934, цит. по: (Zhimulev, 1998). Была предложена модель организации ПГХ, согласно которой р-ГХ представляет собой промежуточную зону между митотическим эу- и гетерохроматином, которая имеет сходную с эухроматином плотность генов и степень политенизации в ПХ, но обогащена некоторыми специфическими повторенными последовательностями {Dr. D.) и связывается со специфическими белками (Miklos and Cotsell, 1990). Однако некоторые участки даже в глубоком гетерохроматине имеют высокую степень политенизации, сравнимую с представленностью эухроматиновых последовательностей (Berghella and Dimitri, 1996; Dimitri, 1997; Zhang and Spradling, 1995). Таким образом, ПГХ неоднороден по представленности разных его участков в политенном ядре.

В состав ПГХ, согласно определению, данному А.А. Прокофьевой-Бельговской (Прокофьева-Бельговская, 1986), входят высоко и средне повторенные последовательности. Под первыми следует понимать сателлитную ДНК, располагающуюся кластерами до нескольких миллионов пар нуклеотидов в прицентромерном гетерохроматине. Фракция средне повторенных последовательностей состоит из различных типов ДНК: неактивных мобильных элементов, повторенных функциональных последовательностей и других последовательностей, функции которых не известны. Кроме того, в ГХ были обнаружены гены. Их плотность примерно в 100 раз ниже, чем в эухроматине, что было показано с помощью анализа индуцированных мутаций (Hilliker et al., 1980). Однако согласно последним данным геномного проекта, в гетерохроматиновой части генома дрозофилы предсказано наличие около 450 генов (Hoskins et al., 2002).

Значительную часть - около 20% генома и, соответственно, около 70% ПГХ Drosophila melanogaster занимают простые тандемно повторенные последовательности или сателлиты (Lohe and Brutlag, 1986). Изначально сателлитная ДНК была выделена как дополнительные (сателлитные) пики 1.672, 1.686, 1.688 и 1.705 г/мп при центрифугировании геномной ДНК в градиенте плотности CsCI. Эксперименты по ренатурации ДНК D. hydei и других видах показали, что 20% ДНК, выделенной из куколок и эмбрионов, составляют быстро ренатурирующие, а 80% - медленно ренатурирующие уникальные последовательности. В слюнной железе фракция медленно ренатурирующих последовательностей сохраняется, однако резко снижено содержание быстро ренатурирующих (до 4-5%). Центрифугирование в градиенте плотности CsCI показало, что различие в ДНК куколок и слюнных желез выявляется только в содержании сателлитной ДНК, количество которой в слюнной железе в 4 - 5 раз ниже, чем в куколках. Эти данные свидетельствуют о сильной недорепликации сателлитной ДНК, которая расположена в ПГХ (Cordeiro et al., 1975; Dickson et al., 1971; Endow and Gall, 1975; Lohe et al., 1993).

В дальнейшем в составе сателлитных пиков было обнаружено несколько типов повторов, и для некоторых из них были определены последовательности нуклеотидов (Endow et al., 1975). Наиболее распространенными сателлитными последовательностями являются ААТАТ (1.672), занимающий 3% генома, AAGAG и AAGAGAG (1.705) - 6% и 1.5% генома соответственно, AAGAC (1.686) - 2.4%, AATAACATAG (1.686) -2% (Lohe et al., 1993). Главной составляющей сателлита 1.688 является повтор, состоящий из 359 п.н. Его доля в геноме 4% (Hsieh and Brutlag, 1979).

Основная часть сателлита 359 п.н. расположена в гетерохроматине Х-хромосомы; кроме этого, наблюдали мечение хромосом 2 и 3, но не 4 и У (Koryakov et al., 1999; Lohe et al., 1993). Предполагается, что аутосомная локализация этого сателлита может быть связана с присутствием последовательностей, гомологичных ему на 63-81%, которые были найдены также во многих сайтах в эухроматине. Например, в районах ЗС и 10Е1-2 они представлены трактами из 2-4 копий, и наиболее распространенными гомологами являются повторы из 254 и 353 п.н. (DtBartolomeis et al., 1992).

Кроме описанных последовательностей в геноме D. melanogaster присутствуют малокопийные, так называемые минорные сателлиты, составляющие лишь 0.1 - 0.5%. Те из них, которые удалось прокартировать, были локализованы в различных сайтах на У-хромосоме (Loheetal., 1993).

Репликация и транскрипционная активность гетврохроматина

Корреляция времени репликации и транскрипционной активности описывается в литературе на протяжении многих лет. Поздно реплицирующиеся районы являются, как правило, транскрипционно неактивными, а рано реплицирующиеся демонстрируют высокое содержание экспрессирующихся генов (Zhimulev, 1998). В недавнем геномном исследовании Schubeler с соавторами показали, что в геноме культуральных клеток дрозофилы Кс рано реплицирующиеся гены в основном транскрипционно активны в этих клетках, в то время как процент активных генов в поздно реплицирующихся районах заметно снижен. При этом была построена геномная карта репликации 8 клетках Кс, позволяющая обнаружить поздно реплицирующиеся районы (Schuebeler et al., 2002).

У дрожжей показано, что теломерная ДНК обладает способностью делать рано активирующиеся участки инициации репликации (ориджины) поздно реплицирующимися. В этом процессе играют важную роль белки, отвечающие за установление теломерного сайленсинга, то есть за подавление активности генов, располагающихся вблизи теломер (Ferguson and Fangman, 1992; Hechtet al., 1996; Stevenson and Gottschling, 1999).

Кластеры хорионовых генов в геноме дрозофилы, подвергаются выборочной амплификации в фолликулярных клетках яйцевых камер. Амплификация хорионовых генов является необходимой для их нормальной экспрессии: нарушение амплификации ведет к недоразвитию хорионовой оболочки и стерильности самок (Cayirlioglu et al., 2003). Эктопическая экспресия гена Su(UR)+ в яичниках самок дрозофилы приводит к похожим нарушениям. Как оказалось, в этом случае происходит подавление амплификации хорионовых кластеров (Volkova et al., 2003).

В геноме человека на примере отдельных генов была показана общая корреляция между активностью генов и временем репликации. Так, «гены домашнего хозяйства», необходимые для общих клеточных процессов, реплицируются в ранней S-фазе клеточного цикла, в то время как гены, работающие в дифференцированных тканях, могут реплицироваться поздно в большинстве тканей.(Holmquist, 1987; Selig et al., 1992). Подробно описана регуляция репликации и транскрипции на примере кластера р-гл оби новых генов млекопитающих. В неэритроидных клетках этот кластер упакован в гипоацетилированный, устойчивый к ДНКазе! и поздно реплицирующийся хроматин, содержащий около 300 т.п.н. Однако, в эритробластах этот участок генома приобретает противоположные свойства, характерные для активного состояния генов. Репликация на этом участке регулируется LCR (Locus Control Region), расположенным на расстоянии около 50 т.п.н. от глобинового кластера, являющимся цис-регулятором времени репликации (Gilbert, 2002; Simon et al., 2001). Репликация кластера р-глобиновых генов происходит с одного ори джина репликации во всех тканях, но его временная активация тканеспецифична (Cimboraetal., 2000).

Эти примеры означают, что функционирование широкого спектра высокоспециализированных генов могут быть связаны с действием механизма, активно регулирующего их экспрессию и раннюю репликацию в определенных типах клеток и инактивацию и позднюю репликацию в остальных тканях.

Регуляция генов и репликация генома определяется свойствами хроматина. При этом многие исследователи наблюдали определенную корреляцию между временем репликации и транскрипционной активностью. Поздно реплицирующиеся гены, как правило, транскрипционно неактивны. При этом в поздно реплицирующихся районах генома часто присутствуют белки сайленсинга, которые также могут являться факторами, изменяющими хроматиновую укладку. Также есть указания на то, что поздно реплицирующиеся районы содержат в основном гены, работающие в узко специализированных типах клеток или тканях, например, [3-глобиновые гены млекопитающих, которые активны только в еритробластах. Что интересно, в этом типе клеток р-глобиновые гены не только начинают экспрессироваться, но и становятся рано реплицирующимися.

Политенные хромосомы являются уникальной моделью для изучения этих явлений, так как гетерохроматиновые районы легко визуализируются. Однако они остаются слабо изучены генетически. Для исследования этих вопросов мы разработали новый подход с использованием уникальных эффектов гена Su(UR).

Линии мух

Для получения ДНК из прицентромерных районов политенных хромосом был использован метод микродиссекции, разработанный для человеческих хромосом и модифицированный для диссекции политенных хромосом. Микроманипуляции производили на инвертированном микроскопе Axivert 10 (40х, 10х) микроманипулятором MR mot (Zeiss). Вырезание фрагментов хромосом проводили силиконизированной стеклянной иглой, управляемой микроманипулятором. Цитологические препараты хромосом были изготовлены на покровных стеклах 60x24 мм в 45% уксусной или в 50% пропионовой кислоте. Вырезанные районы хромосом переносили в 1-2 нл каплю стерильного Tritone Х100, находящуюся в вытянутом кончике пипетки Пастера диаметром 60-80 мкм. Было собрано 10-30 фрагментов хромосом для каждого образца. После этого конец пипетки обламывали в 0.5 мл пробирку. Затем добавляли 3 мкл смеси, содержащей 0.25х буфер для секвеназы (Amersham), 0.2% Tritone Х100 (Sigma). Смесь нагревали до 90С (1 мин.) и охлаждали до 30С (1 мин.). Нагревание и охлаждение повторяли 5 раз, после чего добавляли 0.1 мкл протеиназы К (14 мг/мл; Boehringer Mannheim) и инкубировали 18 часов при 60С. Следующим шагом добавляли 2 мкл раствора, содержащего 1х буфер для секвеназы, 0.5 мМ dATP, dCTP, dGTP, dTTP (Boehringer Mannheim) и 5 пмоль праймера MW6 (5 -CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3 ) (Teienius et al., 1992). Протеиназу К инактивировали в течение 6 мин при 96СС, после чего проводили 8 циклов полимеразной цепной реакции с секвеназой (Sequenase Т7 DNA polymerase Version 2): 1 мин 95С, 2 мин 30С, 2 мин 37С. После каждой денатурации добавляли 0,2 мкл фермента. Следующим этапом добавляли 45 мкл смеси для ПЦР и проводилась наработка фрагментов ДНК, фланкированных последовательностью праимера MW6 в 33 циклах ПЦР с термофильной ДНК полимеразой (Stoffel fragment AmpliTaq Polymerase, Perkin Elmer): 1 мин 94C, 1 мин 56C, 2 мин 72C и 10 мин 72C после последнего цикла (Rubtsov et al., 1996). Наработанная ДНК вырезанных районов была гидролизована ферментом рестрикции Sfr2751 (Сибэнзим, Новосибирск), изошизомером Xhol в течение 3 часов при 50С и очищена с помощью колонок QUIAquick Spin Column (QUIAGEN, Germany). 300 нг ПЦР продукта и 300 нг вектора (pBluescript II KS+ или pGEMEasy, Promega) лигировали в 15 мкл в течение 12 часов при 16С. Лигазная смесь был трансформирован в компетентные клетки E.coliXLBIue\.

Гибридизация in situ

Мечение ДНК проводили в дополнительных 15 циклах ПЦР с 2 мкл наработанного продукта. 20 мкл реакции содержали 0.4 е.а. AmpliTaq polymerase (Perkin Elmer) с подходящим буфером, 200 мМ dATP, dGTP, dCTP, 160 мМ dTTP и 40 мМ biotin-16-dUTP (Boehringer, Mannheim), и 20 пмопь праимера MW6 (Telenius et al. 1992). Клонированные индивидуальные фрагменты ДНК были помечены в тех же условиях, но в 30 циклах ПЦР и со стандартными ТЗ и Т7 праймерами. Препараты политенных хромосом инкубировали в 2xSSC в течение одного часа при 65С, денатурировали в 2xSSC, 0.07N NaOH (1.5 мин) и обезвоживали последовательно в 70%, 80% и 96% этиловом спирте по 5 мин в каждом, после чего высушивали на воздухе. Меченный денатурированный зонд смешивали с 1.5х буфером (75% формамид, 15% декстран сульфат, 3xSSC) из расчета 30 мкл гибридизационной смеси на препарат. Гибридизацию проводили при 37С 12 часов. Несвязавшийся зонд смывали тремя сменами 0.2xSSC (42С, 3 раза по 15 мин), после чего препараты помещали в раствор, содержащий 2% Blocking reagent (Boehringer Mannheim), 4xSSC, 0.1% Triton-X100 (37C, 30 мин) Окраску avidin-FITC проводили в том же растворе {концентрация avidin-FITC 0,025 мг/мл) при 37С 30 мин. После этого препараты промывали 3 раза по 5 мин в 4xSSC, 0.1% Triton-ХЮО при 42С. В случае индивидуальных микрокпонов проводили усиление сигнала с помощью биотинилированных антител к авидину и повторной окраски avidin-FITC- эта процедура проводилась до получения удовлетворительной интенсивности сигнала. После этого хромосомы подкрашивали propidium iodide (Sigma) (2 мкгУмл в 0.2xSSC) и ополаскивали в 0.2xSSC. После этого препараты высушивали, покрывали антифейдом и анализировали сигнал в ультрафиолетовом свете на микроскопе Olympus (Japan).

Похожие диссертации на Геномное исследование гетерохроматина политенных хромосом Drosophila melanogaster

Локализация в политенных хромосомах Drosophila melanogaster некоторых trans- регуляторных факторов транскрипции Котликова Ирина Витальевна

Влияние гена SuUR на эффект положения и локализацию белков гетерохроматина в политенных хромосомах Drosophila melanogasterБолдырева Лидия Валерьевна

Закономерности организации гетерохроматиновых районов политенных хромосом Drosophila melanogaster: цитогенетические аспектыПохолкова Галина Витальевна

Влияние белка SUUR на структуру политенных хромосом Drosophila melanogasterКолесникова Татьяна Дмитриевна

Молекулярно-генетическая организация междисков политенных хромосом Drosophila melanogasterДемаков Сергей Анатольевич

Изучение нерасхождения и потерь половых хромосом в мейозе у Drosophila melanogaster при нарушении синтеза белков теплового шокаКомарова Анна Владимировна

Изучение особенностей пространственной организации хромосом трофоцитов яичников некоторых видов подгруппы "melanogaster" рода DrosophilaМитренина Елизавета Юрьевна

Математическое моделирование эукариотических систем управления экспрессией генов: исследование динамики генных сетей Drosophila melanogaster и arabidopsis thaliana, управляющих онтогенетическими процессамиГалимзянов Александр Валерьевич

Молекулярно-генетическое исследование экспрессии гена Est-S Drosophila virilis в трансгенных линиях Drosophila melanogasterФридман Марина Владиславовна

Исследование регуляторных элементов ретротранспозона copia и влияния его инсерций на приспособленность Drosophila melanogasterМорозова Татьяна Викторовна