Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Пространственно-временная картина репликации (обзорлитературы) , 10
1.1. Ориджины репликации 10
1.2. Инициация репликации 11
1.3. Программирование времени инициации репликации 13
1.3.1. Программирование в клеточном цикле 14
1.3.2. Положение в ядре играет важную роль в программировании ориджинов 14
1.3.3. Статус ацетилирования гистонов ориджинов определяет время инициации репликации 16
1.3.4. У S. cerevisiae существует несколько независимых механизмов программирования позднего включения ориджинов 17
1.3.5. Участие ORC в определении временной программы репликации 19
1.4. Эффективность ориджинов репликации 19
1.5. Фокусы репликации . 20
1.6. Скорость репликации 22
1.7. Время репликации отдельных участков генома 24
1.8. О связи транскрипции и репликации 27
1.9. Значение точной временной последовательности репликации генома 30
1.10. Пространственно-временная картина репликации в политенных тканях D,
melanogaster 32
1.10.1. Эндоцикл 34
1.10.2. Репликация политенных хромосом слюнных желез 36
1.11. Белок SUUR специфически контролирует недорепли кацию вСЖ 39
Глава 2 Материалы и методы 43
2.1. Условия проведения опытов 43
2.2. Линии D. melanogaster 43
2.3. Приготовление давленых препаратов слюнных желез 45
2.4. Приготовление препаратов политенных хромосом для гибридизации in situAS
2.5. Процедура гибридизации in situ 45
2.6. Приготовление препаратов для иммуноокрашивания политенных хромосом 46
2-7. Иммуноокрашивание политенных хромосом 46
2.8. Анализ препаратов 47
2.9. Детекция апоптоза... 48
2.10. EMS мутагенез 48
2.11. Получение трансгенных мух 49
2.12. Вестерн-блот анализ 49
Глава 3. Результаты 51
ЗЛ.Цитогенетический анализ прицентромерного района политенной X- хромосомы 51
3.1.1 .Морфология района 20 51
3.1.2. Построение карты района 20 в линиях, несущих мутацию SuUR и цитологический анализ границ инверсий, разрывающих прицентромерный гетерохроматин Х-хромосомы 51
3.1.3. Локализация генетических маркеров 56
3.2. Фенотипы, вызванные эктопической экспрессией SUUR 58
3.2.1. Эктопическая экспрессия SUUR ингибирует политенизацию в слюнных железах . 60
3.2.2. Повсеместная экспрессия SUUR ингибирует личиночный рост и приводит к летальности 61
3.2.3. Влияние эктопической экспрессии SUUR на диплоидные ткани 61
3.2.3.2. Экспрессия в крыловом имагинальном диске 61
3.2.3.3.Экспрессия в других тканях 64
3.3. Создание линий, экспрессирующих укороченные формы белка SUUR 65
3.3.1.Мутагенез, направленный на получение мутаций в трансгене \JAS-SuUR65
3.3.2. Анализ мутаций в трансгене 66
3.3.3, ^-элементные конструкции на основе С-концевой части SUUR 68
3.4. Анализ функциональной значимости отдельных участков SUUR 69
3,4.1 Фенотипы эктопической экспрессии фрагментов SUUR 69
3.4.2. Связывание фрагментов SUUR с хромосомами СЖ 72
3.4.3. Фрагменты SUUR специфично узнают районы ИГХ 77
3.4.4.Влияние эктопической экспрессии N-концевых фрагментов SUUR на эндогенный SUUR 81
3.4.5. Влияние фрагментов SUUR на недорепликацию в политенных хромосомах СЖ . 86
3.4.6.Фрагменты SUUR вызывают реорганизацию структуры политенных хромосом..,. 87
Слипание дисков политенных хромосом 93
Влияние на пуфы 95
3,4.7.Влияния эктопической экспрессии фрагментов SUUR на распределение НР1 на политенных хромосомах СЖ 96
3.4.7.1 .Оверэкспрессия SUUR вызывает перераспределение НР1 на хромосомах 96
3.4.7.2.Исследование влияния эктопической экспрессии фрагментов SUUR на распределение НР1 на политенных хромосомах СЖ 97
3,4.8.Исследование взаимодействия эктопически экспрессированных фрагментов с избыточным полноразмерным SUUR 98
Глава 4 Обсуждение 101
4.1. Влияние мутации SuUR на прицентромерный район политенной X-хромосомы . 101
4.2. Использование системы GAL4-UAS для исследования функционального значения гена SuUR 104
4.3. Использование доминантных фенотипов в системе GAL4-UAS, для получения функциональных мутаций в трансгене UAS-SuUR 107
4.4. Анализ функциональных участков SUUR 109
4.4.1.Влияние на репликацию 109
4.4.2.Связывание с хромосомами 109
4.4,3. Самоагрегация , 112
4.4.4.Влияние на структуру хромосом 113
Выводы 116
Список литературы
- Программирование времени инициации репликации
- Приготовление давленых препаратов слюнных желез
- Построение карты района 20 в линиях, несущих мутацию SuUR и цитологический анализ границ инверсий, разрывающих прицентромерный гетерохроматин Х-хромосомы
- Влияние мутации SuUR на прицентромерный район политенной X-хромосомы
Введение к работе
Актуальность проблемы
Исследования последних лет показали, что общим свойством организации геномов эукариот является их разделение на дискретные структурно-функциональные домены. Важнейшей характеристикой таких доменов является стабильное эпигенетичекое состояние, определенное положение в ядре и синхронная репликация в S-фазе. Во многих случаях именно время репликации является определяющим для поддержания эпигенетического состояния домена. Пространственно-временная картина репликации генома, в свою очередь, жестко регулируется в клеточном цикле. Механизмы, лежащие в основе такой регуляции, высоко консервативны у эукариот.
В политенных тканях D. melanogaster временная картина репликации имеет особенности, свойственные только этим тканям. Гетерохроматиновые районы политенных хромосом слюнных желез реплицируются значительно дольше, чем эухроматиновые, не успевают закончить репликацию до конца S-фазы, и остаются недопредставленными. Было показано, что эти зоны недорепликации в значительной степени совпадают с поздно реплицирующимися районами в культуре клеток дрозофилы. Это указывает на общность организации и контроля репликации в разных тканях.
Ключевым регулятором времени репликации в политенных хромосомах слюнных желез D. melanogaster является ген Suppressor of Underreplication (SuUR). Белок SUUR связывается с районами прицентромерного, интеркалярного гетерохроматина, а также с районами хромосом, подверженными компактизации в результате эффекта положения мозаичного типа. У мутантов SuUR эти районы хромосом заканчивают репликацию раньше в S-фазе. Как следствие, на политенных хромосомах исчезают разломы, и вместо /3- гетерохроматина в прицентромерных районах наблюдается дисковый рисунок.
В данной работе для выяснения механизмов действия SUUR, мы исследовали влияние мутации гена и избыточной экспрессии белка на структуру эу- и гетерохроматиновых районов лолитенных хромосом.
Уникальный цитологический фенотип мутации SulIR оказался удобным инструментом для цитогенетического анализа. Поэтому первая часть работы посвящена анализу прицентромерного района Х-хромосомы у мутантов SuVR, Мы исследовали, как соотносятся видимые на морфологическом уровне структуры политеннои хромосомы с молекулярно-генетическими маркерами гетерохроматина митотической Х-хромосомы.
Для исследования структуры и функции белка SUUR мы применили новый подход - эктопическую экспрессию в системе GAL4-UAS. При помощи этой системы мы экспрессировали различные фрагменты белка, что позволило выяснить функциональное значение его отдельных доменов.
Цель и задачи исследования
Целью данной работы было изучение влияния белка SUUR на структуру эу- и гетерохроматиновых районов политенных хромосом и выявление функционального значения отдельных его фрагментов.
В связи с этим были поставлены следующие конкретные задачи:
Провести цитогенетический анализ ^гетерохроматина политеннои X-хромосомы и исследовать влияние мутации Sul/R на его структуру.
Проанализировать доминантные фенотипы, возникающие при эктопической экспрессии SUUR в разных тканях в системе GAL4-UAS.
Получить мутации в трансгене UAS-SuUR при помощи EMS мутагенеза.
Получить трансгенные линии, экспрессирующие С-концевые фрагменты SUUR.
Исследовать функциональную значимость отдельных участков SUUR на основании цитогенетического анализа фенотипов, возникающих под влиянием эктопической экспрессии мутантных трансгенов.
Научная новизна
Впервые построена цитологическая карта района 20 политенноЙ X-хромосомы, позволяющая локализовать наиболее проксимальные гены района. Впервые показано, что для района 20 характерны значительные межлинейные различия морфологии, связанные как с транс-модификаторами, так и с цис-факторами. Показано, что в политенной Х-хромосоме значительная доля fi-гетерохроматина относится к митотическому эухроматину. Впервые получены доминантные фенотипы эктопической экспрессии SUUR в системе GAL4-UAS. Впервые показано, что SUUR имеет как минимум два отдельных района связывания с хромосомами, его С-концевая часть контролирует недорешшкацию в интеркалярном и прицентромерном гетерохроматине. Эктопическая экспрессия N-концевых фрагментов SUUR удаляет эндогенный SUUR с политенных хромосом, вызывая фенотип SulIRT, и индуцирует специфические морфологические изменения в гетерохроматине.
Практическая ценность
Впервые построенная' цитологическая карта проксимального района политенной Х-хромосомы вплоть до районов, соответствующих границе митотического гетерохроматина Х-хромосомы, что позволяет производить тонкое картирование многочисленных цитогенетических маркеров, относимых к району 20. Показано, что для этого района характерна высокая межлинейная вариабельность морфологии, что снимает противоречия между литературными данными относительно правильного картирования этого района. Характеристика доминантных фенотипов при эктопической экспрессии SUUR и его фрагментов является базой для дальнейших исследований структуры и функции гена SuUR D. melanogaster.
Апробация работы
Результаты работы представлены на международных конференциях в докладах и стендовых сообщениях: на 5-ой международной конференции по гетерохроматину (Кортона, Италия, 2001), 6-ой международной конференции по гетерохроматину (Равелло, Италия, 2003), 14-ой международной хромосомной конференции (Вюрцбург, Германия 2001), международной конференции «Хроматин и регуляция транскрипции» (Москва, 2003), Лаврентьевской конференции молодых ученых (Новосибирск, 2003), 44-ой и 45-оЙ конференциях по дрозофиле (Нью-Йорк, США, 2003, 2004).
Объем работы
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, обсуждения, а также выводов и списка цитируемой литературы, в которые входит 212 ссылок. Работа изложена на 136 страницах машинописного текста, содержит 4 таблицы и 35 рисунков.
Публикации
Колесникова Т.Д., Коряков Д.Е., Семешин В.Ф., Беляева Е.С., Жимулев И.Ф. Межлинейные различия в морфологии прицентромерного района политенной Х-хромосомы в слюнных железах Drosophila melanogaster// Генетика. 2001. Т.37. N.12. С. 1632-1641. Volkova, E.I., Yurlova, А.А., Kolesnikova. T.D.. Makunin, I.V., Zhimulev, l.F. Ectopic expression of the Suppressor of Vnderreplication gene inhibits endocycles but not the mitotic cell cycle in Drosophila melanogaster!I Molea Genet. Genomics. 2003. V.270(5). P.387—393. Zhimulev, I.F., Belyaeva, E.S., Makunin, I.V., Pirrotta, V., Semeshin, V.F., Alekseyenko, A.A., Belyakin, S.N., Volkova, E.L, Koryakov, D.E., Andreyeva, E.N., Demakova, O.V., Kotlikova, I.V., Kolesnikova. T.D., Boldyreva, L.V., Nanayev, R.A. Intercalary heterochromatin in Drosophila melanogaster polytene chromosomes and the problem of genetic silencing// Genetica. 2003. V.117(2-3). P.259—270.
4. Жимулев И.Ф., Беляева E.C., Колесникова Т.Д., Волкова Е.И. (2004). Интеркалярный гетерохроматин и проблема сайленсинга// Вестник ВОГиС. Т.8(2). С.81-85. Kolesnikova T.D., Makunin I.V., Volkova E.I., Pirrotta V., Belyaeva E.S., Zhimulev J.F. Functional dissection of the Suppressor of UnderReplication protein of Drosophila melanogaster: identification of domains influencing chromosome binding and DNA replication// Genetica. 2005. (in press).
Троценко (Колесникова) Т.Д.. Коряков Д.Е., Жимулев И.Ф. Цитогенетический анализ прицентромерного района политенной Х-хромомсомы дрозофилы Drosophila melanogaster!) Цитология. 2000, т. 42. С. 312. Koryakov D.E., Domanitskaya E.V., Kolesnikova T.D., Belyakin S.N., Belyaeva E.S., Semeshin V.F., Zhimulev I.F. Genetic control of heterochromatin differential polytenization m Drosophila!I Chrom. Res. 2001. V.9 (suppl. 1). P.122-123. Kolesnikova, T.D., Volkova, E.I., Makunin, I.V., Pirrotta, V., Zhimulev, I.F. Isolation of mutations in VAS-SuUR transgene// A Dros. Res. Conf. 44. 2003. P.321C. Yurlova A.A., Kolesnikova T.D., Volkova E.I., Makunin I.V., Zhimulev I.F. Mutation of ATP-binding domein of the SuUR protein// A Dros. Res. Conf. 45. 2004. P.328A.
10. Белякин C.H., Колесникова Т.Д., Макунин И.В., Волкова Е.И., Алексеенко АА., Нанаев Р.А., Болдырева Л.В., Беляева Е.С., Жимулёв И.Ф. Интекалярный гетерохромаатин в политенных хромосомах D. melanogaster и проблема гентического сайленсинга// Съезд ВОГиС. Москва. 2004. Т. 2. С. 238.
Вклад автора
Основные результаты получены автором самостоятельно. Электронно-микроскопический анализ политенных хромосом проводился совместно с д. б. н. В.Ф. Семешиным. Анализ влияния SUUR и его фрагментов на распределение НР1 на политенных хромосомах проводился совместно с Л. В. Болдыревой.
Благодарности
Автор выражает глубокую признательность член-корр. РАН И.Ф, Жимулеву, д.б.н. Е. С. Беляевой, к.б.н. Е. И. Волковой, к. б. н. И. В. Макунину, к. б. н. Д. Е.
Корякову, д. б. н. В. Ф. Семешину и к. б. н. А. А. Горчакову за помощь в работе и обсуждение результатов. Автор также благодарен всем сотрудникам лаборатории молекулярной цитогенетики за постоянную поддержку.
Список использованных сокращений
СЖ слюнные железы
ИГХ - интеркалярный гетерохроматина
ПГХ — прицентромерный гетерохроматин т, п. н. - тысяч пар нуклеотидов ак. - аминокислот
Программирование времени инициации репликации
Эукариотическая репликация начинается на множестве ориджинов, каждый из которых имеет характерное время включения в ходе S-фазы, воспроизводимое в разных клеточных циклах. Инициация репликации на данном ориджине представляет собой сложный процесс, требующий связывания с ориджином множества белков в несколько этапов (Weinreich et al., 2004). Несмотря на то, что консервативной последовательности ДНК, необходимой для инициации репликации, у высших эукариот не обнаружено, белки и этапы инициации репликации у них в большой степени консервативны (DePamphilis, 1999; Bell, Dutta, 2002; Weinreich et al., 2004). Наиболее изучен процесс инициации репликации у дрожжей S. cerevisiae.
На первом этапе происходит формирование на ориджине шестисубъединичного комплекса ORC (origin recognition complex). ORC остается связанным с ориджином в течение почти всего клеточного цикла, а у S. cerevisiae постоянно, и, следовательно, одной из его функций может быть маркирование сайтов инициации репликации. У D. melanogaster синтез и связывание ORC с хромосомами регулируется в клеточном цикле (Asano, Wharton, 1999).
На втором этапе ORC запускает сборку на ориджине мультибелкового комплекса, называемого пререпликативным комплексом (pre-RC). Для формирования pre-RC необходимы как минимум ORC, Cdc6p, Cdtl и субкомплекс МСМ. Cdc6p непосредственно взаимодействует с ORC, и вместе с Cdtlp эти белки необходимы для посадки МСМ (предполагается, что субкомплекс МСМ является основной геликазой в процессе репликации) (Diffley, Labib, 2002). Сборка pre-RC происходит в фазе Gl (Raghuraman et al., 1997; Dimitrova, Gilbert, 1999).
На третьем этапе, непосредственно перед инициацией репликации на данном ориджине, происходит его активация. Pre-RC последовательно присоединяет дополнительные белки и превращается в преинициаторный комплекс (pre-IC). К таким белкам относятся Cdc45p, RPA и участвующие в репликации ДНК-пол им еразы.
В отличие от предыдущих этапов, этот этап происходит в не одновременно на разных ориджинах и находится под контролем регуляторних киназ. Это позитивный контроль киназами группы CDK (циклин-зависимые киназы, работают в комплексе с циклинами) и киназой Cdc7 в комплексе с регуляторной субъединицей Dbf4, а также негативный контроль киназами, участвующими в клеточном ответе на повреждение ДНК (intra-S-phase checkpoint). Так, у дрожжей присутствие специфичных для S-фазы активных CDK и Dbf4/Cdc7 открывает ориджины и облегчает посадку Cdc45p (Aparicio et al., 1999) и, соответственно, RPA (Tanaka, Nasmyth, 1998), Присутствие киназы Rad53p приводит к гиперфосфорилированию и удалению Dbf4 с хроматина (локально), и тем самым препятствует преждевременной активации поздних ориджинов, не влияя на активацию ранних (см. ниже, Tanaka, Nasmyth, 1998; Donaldson, Blow, 2001; Diffley, Labib, 2002). Итак, в ходе S-фазы ориджины активируются не одновременно.
Понятие «ранних» и «поздних» ориджинов
В течение всей S-фазы клеточного цикла включаются все новые ориджины (см. напр. Ragnuraman et al., 2001). Тем не менее, принято говорить о «ранних» и «поздних» ориджинах. Оказывается, все ориджины можно разделить на два класса в зависимости от того, влияет ли на инициацию репликации на данном ориджине система контроля повреждений ДНК в S-фазе (intra-S-phase checkpoint) (Shirahige et al., 1998).
Повреждения ДНК и остановившиеся репликационные вилки запускают каскад событий, который приводит к остановке движения всех репликационных вилок и блокированию инициации репликации на поздних ориджинах. Ранние ориджины сохраняют способность инициировать репликацию, однако репликационная вилка, идущая от такого ориджина, будет вскоре остановлена. Такие паузы в клеточном цикле необходимы для репарации повреждений ДНК. В случае значительных повреждений клетка вступает в апоптоз. Для искусственной инициации остановки клеточного цикла в этой контрольной точке на клетки воздействуют гидроксимочевиной (HU).
Существование точки контроля в S-фазе открыли лишь в конце 90-х годов у S. cerevisiae (Shirahige et al., 1998; Santocanale, Diffley, 1998). Позднее показали, что система ответа на повреждение ДНК консервативна у эукариот. Блокирование инициации репликации на поздних ориджинах в присутствии HU (или аналогичных химических агентов) наблюдали у S. cerevisiae (Shirahige et al., 1998; Santocanale, Diffley, 1998), S. pombe (Kim, Huberman, 2001), млекопитающих (Dimitrova, Gilbert, 2000; Miao et al., 2003), в экстракте яиц Xenopus (Marheineke, Hyrien, 2001) и у D. melanogaster (MacAlpine et al., 2004). Так, например, геномное исследование 5. cerevisiae показало, что из 260 ориджинов репликации 143 (ранние) включались в присутствии HU, в то время как 104 ориджина в тех же условиях не включались (Yabuki et al., 2002). У D. melanogaster, вероятно, лишь небольшая доля ориджинов способна к инициации репликации в присутствии HU (MacAlpine et al., 2004).
В предыдущей главе мы говорили о том, что ранние и поздние ориджины могут по-разному реагировать на сигналы клеточного цикла в ответ на повреждение ДНК. Следовательно, к началу S-фазы они должны быть каким-то образом маркированы как «ранние» и «поздние». Далее мы рассмотрим, как и на каком этапе клеточного цикла происходит такое «программирование».
Практически во всех случаях сами по себе ориджины, клонированные как автономные, реплицирующиеся плазмиды, инициируют репликацию рано, независимо от времени их репликации в нативном положении (см. обзор Diffley, Labib, 2002). Следовательно, время репликации ориджинов должно определяться окружающими последовательностями ДНК или состоянием прилежащего хроматина, т. е. какими-то цис-элементами. Существуют специфические последовательности ДНК, связывающие факторы поздней инициации репликация. Совсем недавно такие специфические консервативные последовательности ДНК были обнаружены у дрожжей S. pombe. Эти последовательности встречаются вблизи всех известных у этого организма поздних ориджинов и влияют на время их репликации (Yompakdee, Huberman, 2004).
Приготовление давленых препаратов слюнных желез
Кормление самцов \JAS-SuUR мутагеном осуществлялось в банках объемом 250 мл. В банки предварительно на дно укладывалась влажная (для придания формы дна) фильтровальная бумага и высушивалась. В каждую банку помещали по 100 самцов VAS-SuUR (F9-F9-2), предварительно выдержанных 2 часа в пустых стаканах. В каждую банку капали по 1 мл раствора EMS с сахарозой (на 100 мл раствора 5% сахарозы 0,26 г EMS), согласно стандартному протоколу (Grigliatti, 1998). В качестве денатурирующего раствора (для нейтрализации мутагена после работы) использовали 10% фиксаж (NaS203 100 г/л). Через 7 часов самцов пересаживали в банки с кормом и самками C323-GAL4. Через три дня самок рассаживали в стандартные стаканы по 10 мух на стакан и каждые два дня пересаживали в свежие стаканы. Все потомство анализировали на предмет восстановления фенотипа, вызванного эктопической экспрессией UAS-SuUR (то есть искали фертильных самок). 3000 самцов после воздействия мутагена скрестили с самками C323-GAL4, в потомстве отобрали фертильных самок и тотально скрестили с самцами у w ; CyO/If; MKRS/TM6. Самки c323-GAlA UAS-SuUR стерильны, поэтому появление потомства свидетельствовало о мутационном событии в трансгене VAS-SuUR либо же в гене, необходимом для работы гена SuUR. Из тех пробирок, где появилось потомство, самок-родителей рассадили в индивидуальные пробирки. Всего было обнаружено шесть самок, давших потомство. Все самки были выведены в линии.
Для трансформации эмбрионов D. melanogaster использовали стандартный протокол (Spradling, Rubin, 1982). 8 мкг ДНК конструкций, полученных на основе Р-транспозонов (И.В. Макунин), смешивали с 2 мкг ДНК хелперной плазмиды pUChs delta 2-3 (pTturbo), содержащей ген транспозазы, в общем объеме 20 мкл воды. Мухи линии у w в течение 3 дней выдерживались в банках с кормом, на поверхность которого наносились дрожжи для активации откладки яиц. Далее мух каждые 20 мин пересаживали в новые стаканы со съемным дном со смазанным дрожжами кормом. Эмбрионы собирали на скотч, снимали хорион при помощи препаровальной иглы, раскладывали в ряд на полосы скотча на стекле, подсушивали 5-7 мин и покрывали маслом Voltalef 10S (Франция). Инъекцию ДНК проводили с помощью микроманипулятора. Имаго GO индивидуально скрещивали с мухами у w67, в потомстве искали мух с пигментированными глазами за счет маркерного гена mini-white из транспозона. По пять независимых встроек были выведены в линии.
Мухи с производными UAS-SuUR скрещивались с da-GAlA для того, чтобы стимулировать повсеместную экспрессию, и потомство от этого скрещивания брали для приготовления тотального белкового экстракта.
На Вестерн-блоте антитела Е45, полученные против средней части белка SUUR, позволяют детектировать только оверэкспрессированный SUUR (Makunin et al., 2002). Поэтому мы использовали в качестве позитивного контроля экстракты из мух hs-SuURi предварительно подвергнув их тепловому шоку в течение 1 часа.
По двадцать мух {десять самцов и десять самок) гомогенизировались в 150 мкл буфера для гомогенизации белков (8 М мочевина, 100 мМ Na PCf, 10 мМ Tris-HCl рН 6.4). Затем добавляли 150 мл буфера для нанесения (125 мМ Tris-HCl рН=6.8, 0,2% SDS, 5% -меркаптоэтанол, 0,0025% бромфеноловый синий, 20% глицерин), образцы кипятили на водяной бане 3-5 минут и наносили на гель.
Разделяющий гель готовили из расчета 8-12% акрил амид (смесь 30% акриламида с 0,8% бисакриламидом), 375 мМ Tris-HCl рН=8.8, 0,1% SDS, 0,1% персульфат аммония, 0,04% TEMED. Сразу же после заливки разделяющего геля на него наслаивали раствор 0,1% SDS, и во время полимеризации готовили концентрирующий гель: 5% акриламид, 125 мМ Tris-HCl рН=6.8, 0Д% SDS, 0,1% персульфат аммония, 0,04% TEMED. По окончании полимеризации разделяющего геля раствор SDS удаляли, заливали концентрирующий гель, вставляли гребёнку и дожидались полной полимеризации геля, не допуская его подсыхания.
Электрофорез проводили в трис-глициновом буфере (0,1% SDS, 192 мМ глицин, 25 мМ Tris-HCl рН=8.3) при напряженности поля 20 В/см. Гель окрашивали в растворе 0,25% кумасси синего R-250 в водном растворе 50% метанола и 10% уксусной кислоты и отмывали в растворе состава: 10% уксусная кислота, 30% метанол.
Электроперенос белков на мембрану Hybond-C extra проводили в трис-глициновом буфере без SDS 1,5-2 ч при напряженности поля 22 В/см. Мембрану блокировали в течение ночи при 4С в 15 мл раствора состава: 1% обезжиренное сухое молоко, 2% эмбриональная телячья сыворотка в lxTBST (10 мМ Tris-HCl рН=8.0, 150 мМ NaCl, 0,05% Tween 20). Инкубацию мембраны с первичными антителами (Е45 при разведении 1:1000 (Makunin et al., 2002)) и вторичными (anti-rabbit IgG-AP коньюгатами с щелочной фосфатазой) при разведении 1:7500 (Santa Cruz Biotechnology) проводили при комнатной температуре не менее одного часа, чередуя с отмывками трижды по 5-10 минут в lxTBST при постоянном покачивании. Затем проводили активацию конъюгированной щелочной фосфатазы инкубацией мембраны с АР-буфером (100 мМ Tris-HCl рН=9.5, 100 мМ NaCl, 5 мМ MgCh) в течение 5 минут. Детекцию проводили в растворе 330 мкг/мл NBT и 115 мкг/мл ВС1Р на основе АР-буфера в затемненном помещении без покачивания до появления окраски. Реакцию останавливали дистиллированной водой.
Построение карты района 20 в линиях, несущих мутацию SuUR и цитологический анализ границ инверсий, разрывающих прицентромерный гетерохроматин Х-хромосомы
В линиях дикого типа в районе 20 виден лишь один четкий диск 20А1-2, а также относительно тонкий и не очень четкий диск В1-2 (Semeshin et al., 2001, Рис. 3.1 А), Некоторые авторы относят этот диск либо к подсекции 20А (Прокофьева-Бельговская, 1986, Schalet, Lefevre, 1976), либо к участку 20В-С (Koryakov et al., 1999, Belyaeva et al., 1998). Анализ на электронно-микроскопическом уровне также позволяет выявить только один четкий диск 20А1-2; материал проксимального участка этой секции обычно представлен сетью анастомозов и тяжей (Semeshin et al., 2001, Рис. 3.1 А).
В линиях с перестройками (локализация гетерохроматиновых точек разрыва перестроек относительно карты митотического гетерохроматина Х-хрмосомы представлена на рис. 2.1) картина несколько улучшается. Диск 20В1-2 выявляется постоянно и достаточно четко, при этом во всех случаях, кроме rsr, он тоньше, чем 20А1-2 (Рис. 3.2). В линиях wm4, sc и rst нам удалось увидеть и другие диски в проксимальной части района, которые точно прокартировать не удалось (обозначены стрелками), так как они выявляются редко и не имеют четкого рисунка. Таким образом, мы подтвердили литературные данные (Прокофьева-Бельговская, 1945, Schalet, Lefevre 1973, Schalet, Lefevre 1976), что перестройки влияют на морфологию района, позволяя увидеть иногда до шести (в случае scs) дисков (Рис. 3.2 В).
Исследование этих же перестроек на фоне SuUR выявило следующие закономерности:
1. В линиях с мутацией район 20 "эухроматинизирован": часто выявляется тонкая структура, постоянно присутствуют до пяти крупных дисков, по которым
2. район был разделен на секции A-F (рис. 3.1 Б-Г; см. также Belyaeva et al., 1998, Semeshin et al., 2001). Несмотря на то, что эктопическая конъюгация между районами В-С, Е и F часто затрудняет выявление отдельных дисков, в пределах каждой линии они легко идентифицируются.
3. При сравнении дискового рисунка в разных линиях обнаружилось, что установить полное соответствие между отдельными дисками трудно: для каждой линии характерен свой вариант морфологии района. На рис. 3.1 Б-Г области А-С совпадают. В области D-E число крупных дисков сохраняется, но меняется их толщина и расстояние между ними.
Район 20F существенно отличается между линиями по своему размеру. В м т4; SuUR он наиболее мощный, в редких случаях разделен на отдельные диски, чаще представлен крупным вакуолизированным блоком (Рис. 3.1 В). В линии sc ; SuUR этот район меньше, в дистальной части выделяется не более двух дисков, проксимальная часть компактна и сливается с материалом района 1 (Рис. 3.1 Г).
Только гибридизация in situ ДНК гена su(f), локализовавшая этот ген на границе районов Е и F (см. ниже), помогла определить, где начинается район 20F в линии sc4; SuUR. В линии sc2; SuUR подсекция выглядит более компактной и разделена на три диска; на некоторых препаратах видно соединение дисков из подсекции 20 F с материалом ядрышка (Рис. 3.3 Е).
Таким образом, нам удалось с точностью до буквенных секций идентифицировать крупные диски в отдельных линиях, однако существуют заметные межлинейные различия морфологии района 20 (См. рис. 3.3).
Морфологические особенности, характерные для каждой линии, сохраняются и у гетерозигот. Два гомолога Х-хромосомы на Рис. 3.4 имеют морфологию, характерную для родительских линий w; SuUR и wm4; SuUR. Если у неперестроенного гомолога наблюдается рыхлый гранулярный диск 20F, то у инвертированного большой блок материала разделен на два диска.
В целом мы не видели зависимости числа и толщины дисков 20 D-F от количества митотического гетерохроматина, соседствующего с ним. Так, например, w; SuUR (без перестройки), ирп2Ь; SuUR (точка разрыва в правом плече Х-хромосомы) имеют в 20 D-F морфологию, сходную с таковой в scV2; SuUR, где инверсия оставляет рядом с 20 D-F значительно меньше гетерохроматина, Одинаковый рисунок дисков наблюдается в линиях ru h SuUR (без перестройки) и sc8; SuUR, в то время как две линии без перестроек (w; SuUR и ru h SuUR) различаются по морфологии данного района.
Однако во всех линиях с точками разрыва в дистальном гетерохроматине (sc4; SuUR, rsl3; SuUR и w ; SuUR) рисунок дисков в районе 20B-F наиболее четкий, лучше выявляется,
Для установления соответствия новых дисков, возникающих только на фоне SuUR, районам митотической Х-хромосомы, мы гибридизовали in situ клоны ДНК гена su(f) и рДНК (на рис. 2.1 представлена локализация этих клонов на карте митотического гетерохроматина Х-хромосомы).
Гибридизацию in situ гена su(f) проводили с полите иными хромосомами линий sc4; SuUR и wm4; SuUR. В обоих случаях метка локализовалась между крупными дисками районов 20Е и F (Рис. 3.5 Б). Таким образом, мы прокартировали самый проксимальный маркер эухроматина Х-хромосомы D. melanogaster, ген su(f), на границе районов 20Е и F.
По картине гибридизации in situ рДНК с хромосомами линии sc2; SuUR, в которой инверсия разрывает ядрышковый организатор, мы пришли к заключению, что многочисленные тяжи и глыбки материала, соединенные в этой линии с районом 1В1-2 (Belyaeva et al., 1998), соответствуют материалу ядрышкового организатора. Кроме того, метка была обнаружена и в наиболее проксимальной области района 20F (Рис. 3.5 В, Г). Эти результаты указывают на то, что проксимальный гетерохроматин митотической Х-хромосомы не представлен в дисковой области района 20 даже на фоне мутации SuUR, а весь дистальный гетерохроматин представлен небольшим фрагментом хромосомы - районом 20F. Очевидно, что он остается нереплицированным, при этом разлома здесь на фоне мутации SuUR не наблюдается.
Влияние мутации SuUR на прицентромерный район политенной X-хромосомы
В политенных хромосомах к ПГХ относят два типа морфологических структур. Это компактный, интенсивно окрашивающийся ацетоорсеином, а-гетерохроматин и сетчатый, диффузный -гетерохроматин, формирующий основную массу хромоцентра политенных хромосом. Считается, что к первому относятся участки митотического хроматина, не политенизирующиеся в политенных хромосомах, в то время как к /-гетерохроматину относятся последовательности, которые реплицируются частично (Gall et al., 1971; Miklos et al., 1988; Travers, Pardue, 1989; Devlin et al., 1990).
/?-гетерохроматин хромосом 2 и 3 возникает при агрегации нескольких реплицированных доменов, которые физически разделены нереплицированными зонами (Travers, Paidue, 1989; Zhang, Spradling, 1995; Berghella, Dimitri, 1996), и границы митотического гетерохроматина картируются в дисковой области хромосом (Koryakov et al., 1996). jff-гетерохроматин Х-хромосомы, вероятно, соответствует переходной зоне между митотическим эу- и гетерохроматином и характеризуется градиентом политенизации (Shalet, Lefevre, 1976; Yamamoto et al., 1990; обзор см, Miklos, Cotsell, 1990).
Район 20 политенной Х-хромосомы объединяет в себе черты организации и гетерохроматиновых и эухроматиновых районов. Как и гетерохроматин, он поздно реплицируется (Прокофьева-Бельговская, 1986; Большаков, Жимулев, 1990), связывает белок НР1 (Belyaeva et al., 1993). Кроме того, для этого района характерна обогащенность умеренно-повторенной ДНК (Miklos et al., 1988; Moshkin et al., 2002) и неполная политенизация (Yamamoto et al., 1990). В тоже время по числу генов район 20 не отличается от эухроматина (Perrimon et al., 1989), но исследованные на молекулярном уровне генетические локусы (su(f)t uncoordinated) имеют особенности, характерные для гетерохроматиновых генов It и rl (Mitchelson et al., 1993, Devlin et al., 1990, Berghella, Dimitri 1996). Прилежащие районы и интроны этих генов состоят из умеренно повторенных последовательностей ДНК (Healy et al., 1988, Mitchelson et al., 1993). Недавно было обнаружено, что в прицентромерных областях сосредоточено около 160 генов, для экспрессии которых необходимы белки НР1 и Su(var)3-9, белки, которые обычно связаны с формированием доменов «молчащего» хроматина (Greil et al., 2003). Эти данные говорят о том, что прицентромерные районы могут представлять собой хроматиновые домены с уникальной для этих районов молекулярно-генетической организацией. Вероятно, именно эти домены, а также внутренние гетерохроматиновые домены с подобной молекулярной структурой формируют /7-гетерохроматин политенных хромосом.
При мутации SuUR в прицентромерных районах исчезает морфологический /3-гетерохроматин, вместо него возникает дисковый рисунок. Это позволило нам сопоставить районы с -гетерохроматиновой морфологией с митотической картой Х-хромосомы. Локализация цитогенетических маркеров из разных районов митотического гетерохроматина подтверждает, что значительная доля /3-гетерохроматина политенной Х-хромосомы, в отличие от /Ї-гетерохроматина хромосом 2 и 3, действительно соответствует переходной зоне между эу- и гетерохроматином. Весь представленный в политенной Х-хромосоме митотический гетерохроматин может быть локализован только в районе 20F. Хромосомный материал, расположенный проксимальнее точки разрыва инверсии In(l)sc4 -наиболее дистального известного маркера митотического гетерохроматина X-хромосомы - не политенизируется даже у мутанта SuUR.
Таким образом, мы показали, что SuUR действует лишь на определенный класс районов прицентромерного гетерохроматина политенных хромосом. Большая часть митотического гетерохроматина у мутантов SuUR остается недореплицированной.
Постоянство рисунка поперечной исчерченности считается фундаментальным свойством политенных хромосом. Дисковая структура, за исключением минорных отличий, воспроизводится в различных тканях организма (Holden, Ashburner, 1978; Hochstrasser, 1987; Heino, 1989; Mal ceva et al., 1995; для обзора см. Жимулев, 1994). В литературе упоминается, что для прицентромерных районов характерно варьирование морфологии между дисковой и -гетерохроматиновой (Прокофьева Бельговская, 1986, Жимулев, 1993, Koiyakov et al., 1999). При таком варьировании изменяется выявляемость, но не морфология отдельных дисков.
Первая карта К. Бриджеса (Bridges, 1935), была подвергнута тщательной проверке на уровне электронной микроскопии (Семешин и др., 1979; Беляева и др., 1980; Semeshin et al., 1982; Saura et al., 1993) и была подтверждена для большинства районов, но не для прицентромерного района Х-хромосомы. Другие авторы пытались построить карту данного района и получили противоречивые результаты (Bridges, 1935; 1938; Поркофьева-Бельговская,1945; Schalet, Lefevre, 1973; Lefevre, 1976; Saura et al., 1993; Koryakov et al., 1999). Ранее такое отсутствие согласованности результатов связывали исключительно с тем, что 0-гетерохроматиновая морфология района затрудняет его анализ. На фоне мутации SuUR в хромоцентре исчезает морфологический /?-гетерохроматин, вместо него возникает дисковый рисунок. Тем не менее даже на фоне мутации мы столкнулись с исключительной вариабельностью морфологии района в различных линиях D. meianogaster. Рисунок крупных дисков воспроизводился между линиями, однако тонкая структура района существенно отличалась.
Мы предполагаем, что такое варьирование определяется несколькими факторами.
1. Существенную роль играет уровень политенизации района. Так, например, диск 20В1-2 (20В-С), который виден и в линиях SuUR+t в хромосомах мутантов SuUR выглядит значительно толще. У мутантов SuUR в районах ИГХ восстанавливается 100% уровень политенизации, и вместо разломов возникают толстые диски (Belyaeva et al., 1998). Вероятно, аналогичную картину мы видим и в районе 20В-С.
2. На морфологию района влияют хромосомные перестройки. В тех линиях, где точки разрыва инверсий находятся в дистальном гетерохроматине, дисковый рисунок особенно четкий. Чем меньше гетерохроматина прилегает к району 20, тем более «эухроматиновым» он выглядит.
3. Две линии без перестроек имеют различный дисковый рисунок в районе 20. Кроме того, в каждой линии есть характерные особенности морфологии, которые сохраняются у гетерозигот. Такое поведение гомологов в гетерозиготе говорит о том, что различия дискового рисунка связаны с внутренними свойствами самого района. Можно предположить, что межлинейные различия в морфологии района 20 обусловлены различиями в количестве последовательностей, способных к дополнительной политенизации на фоне SuUR. Известно, что район 20 на 60% состоит из умеренно-повторенной ДНК (Miklos et al., 1988), причем число копий, например, повтора SCLR может различаться между линиями в шесть раз (Гвоздев и др., 1999). Учитывая размер копии (до 60 т.п.н.), можно полагать, что различия в дисковом рисунке могут быть связаны с присутствием или отсутствием длинных трактов таких повторенных элементов, тем более что не все повторенные последовательности проходят дополнительную репликацию под влиянием мутации SuUR (Belyaeva et al., 1998). Кроме того, известно, что перестройки, затрагивающие гетерохроматин, могут быть сложными (Pokholkova, 1993; Koryakov et al., 2002), и, возможно, в некоторых линиях в районе 20 присутствуют дополнительные перестройки, которые трудно обнаружить цитологически.
