Введение к работе
Актуальность исследования В настоящее время уже не вызывает сомнения тот факт, что особенности генетической активности и структурной организации интерфазных хромосом взаимосвязаны между собой Однако механизмы этой взаимосвязи до сих пор во многом не понятны Их изучение является одной из главных задач современной биологии "Классические" политенные хромосомы двукрылых, которые рассматриваются в качестве модели интерфазной хромосомы, открывают большие возможности в этом направлении Они представляют собой пучки из нескольких тысяч параллельно расположенных хроматид, каждая из них соответствует интерфазной хромосоме с характерным рисунком чередования компактных хроматиновых структур (хромомеров) и менее плотных межхромомеров Поскольку хроматиды располагаются в одном порядке, эти рисунки совпадают, что приводит к образованию дисков и междисков и определяет поперечную исчерченность политенных хромосом Большие размеры хромосом и относительно высокая специфичность дискового рисунка позволяют легко идентифицировать отдельные хромосомы и их районы
Исследования на политенных хромосомах позволили достичь значительного прогресса в понимании генетической организации хромомеров (дисков) и особенностей их функционирования Однако до сих пор очень мало известно о функциях межхромомеров (междисков) В ряде работ отмечается возможная транскрипционная активность междисков (см обзор Zhimulev et al, 2004) Эти наблюдения в совокупности с данными об относительном постоянстве дискового рисунка политенных хромосом поддерживают гипотезу о междисках как районах, содержащих постоянно активные гены (Speiser, 1974, Gersh, 1975, Zhimulev, Belyaeva, 1975) Были предложены и другие гипотезы, в которых соседние диск и междиск рассматривались в качестве единой функциональной единицы (Спек, 1971, Paul, 1972, Sorsa, 1984)
Несмотря на интенсивные исследования, до сих пор неясно, на каком уровне организации хроматина возникают различия в упаковке ДНП дисков и междисков и насколько эти различия обусловлены свойствами ДНК из этих районов Было бы интересно и важно понять, существует ли корреляция между дисковым рисунком политенных хромосом и петельно-доменной организацией хромосом, обнаруженной в интерфазных ядрах многих эукариотических клеток (Roberge and Gasser, 1992, Jackson et al, 1992, Razm, 1996) Предполагается, что данная организация необходима для регуляции процессов клеточного деления, репликации и транскрипции (Razin, Gromova, 1995, Bouhkas, 1995, Hart, Laemmh, 1998) Функциональная роль междисков может быть определена в результате анализа их молекулярной организации, и такие попытки предпринимались (Kress et al, 1985, Whitmore, 1986, Rykowski et al, 1988) Однако малые размеры междисков, низкое содержание ДНК в них и, как следствие, отсутствие адекватных методов не позволяют точно
соотнести между собой молекулярные и цитологические данные для этих районов
Метод Р элемент-опосредованной трансформации генома дрозофилы фрагментами ДНК с известными молекулярно-генетическими характеристиками (Spradlmg, Rubin, 1982) в сочетании с электронно-микроскопическим (ЭМ) анализом трансформированных районов хромосом открывает принципиальную возможность обнаружения новых морфологических структур, образованных материалом Р-транспозонов, и изучения их стуктурно-функциональных особенностей в составе хромосом (Semeshm et al, 1986) Учитывая эти факты, проблему точной привязки молекулярных и цитологических структур в районах междисков можно решить следующим образом С помощью ЭМ картирования выявить встройки транспозонов в районах междисков Затем клонировать ДНК междисков, прилегающую к встройкам, и исследовать молекулярно-генетическую организацию этих районов
Цель и задачи исследования Целью данной работы является определение молекулярно-генетических характеристик междисковых районов и выяснение функциональной роли этих структур в политенных хромосомах дрозофилы Конкретные задачи исследования состояли в следующем-
Провести электронно-микроскопический анализ трансформированных районов политенных хромосом и определить в них локализацию встроек Р-транспозонов.
Клонировать ДНК, прилежащую к встройкам транспозонов в районах междисков, и определить последовательность нуклеотидов в ней
Провести сравнительный и филогенетический анализ последовательностей нуклеотидов ДНК из районов междисков
4 Исследовать транскрипционную активность междисков
5. Исследовать нуклеосомную организацию междисков
Экспериментально проверить возможное взаимодействие ДНК междисков с ядерным матриксом
На основе Р-транспозонов создать и изучить конструкции, позволяющие моделировать междисковые структуры в составе политенных хромосом
Научная новизна Основным научным результатом данной работы является создание нового направления по изучению молекулярно-генетической организации политенных хромосом на ультраструктурном уровне Вклад автора состоит в разработке и реализации подхода по моделированию хромосомных структур фрагментами ДНК, встроенными в геном D melanogaster путем трансформации, и изучению их информационного содержания В работе впервые проведен ЭМ анализ 23-х районов политенных хромосом слюнных желез линий мух, гомозиготных по встройкам Р-транспозонов с определенными молекулярно- генетическими характеристиками На основании полученных данных о преимущественном встраивании транспозонов в районы междисков, предложен оригинальный подход к клонированию ДНК из районов междисков С помощью этого
подхода впервые клонированы и охарактеризованы на молекулярно-генетическом уровне ДНК из тринадцати районов междисков
Впервые точно показана нуклеосомная организация ДНК междисков и ее взаимодействие с ядерным матриксом
Впервые на молекулярном уровне усиновлена генетическая гетерогенность междисков На основании полученных данных междиски можно разделить, по крайней мере, на два типа первый тип представлен постоянно активным белок-кодирующим геном "домашнего хозяйства", ко второму типу относятся междиски, которые не содержат белок-кодирующих последовательностей и в слюнных железах проявляют очень низкую транскрипционную активность
Впервые показана принципиальная возможность исследования механизмов формирования междисков и хромомомерной организации политенных хромосом в целом с помощью моделирования диск-междисковых структур на основе трансгенных конструкций с применением сайт-специфичных систем рекомбинации в составе политенных хромосом
Практическая значимость Предложен новый подход к клонированию ДНК из районов междисков и их моделированию в составе политенных хромосом, что имеет существенное значение для дальнейшего анализа структурно-функциональной организации интерфазных хромосом и эукариотического генома в целом Полученные в работе результаты используются при чтении лекций в ряде вузов страны (Новосибирск, Санкт-Петербург, Томск)
Апробация работы Результаты данного исследования докладывались на 6-м Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва, 1987), 6-м Всесоюзном совещании по генетике дрозофилы (Одесса, 1989), 10-м Всесоюзном симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (Гродно, 1990), 7-м Международном совещании "Молекулярная биология и биология развития дрозофилы" (Крит, Греция, 1990), 7-м Всесоюзном совещании "Структура и функции хромосом" (Пущино, 1991), 7-м Всероссийском симпозиуме «Структура и функции клеточного ядра» (Санкт-Петербург, 1996), 6-м Европейском энтомологическом конгрессе (Чешские Будеёвицы, Чехия, 1998), Международной летней школе «Хроматин и регуляция транскрипции» (Москва, 1998, 2003), 2-й Международной конференции по биоинформатике регуляции и структуры генома, секция ИНТАС (Новосибирск, 2000), 14-й Международной конференции по хромосоме (Вюрцбург, Германия, 2001), 8-м и 9-м Международных симпозиумах по структуре и функции клеточного ядра (Санкт-Петербург, 2002 и 2005), 19-й Европейской конференции по изучению дрозофилы (Эгер, Венгрия, 2005)
Структура и объем работы Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и обсуждения, а также выводов и списка цитируемой литературы, в который входит 620 ссылок Работа изложена на 315 страницах машинописного текста, содержит 10 таблиц и 61 рисунок По теме диссертации опубликовано 29 печатных
работ Работа по ЭМ анализу трансформированных районов политенных хромосом была проведена совместно с В Ф Семешиным Остальные результаты получены автором самостоятельно Ряд экспериментов выполнен с участием С В Разина, В В Шломы, Е С Юдинковой, X Модолея и С Кампузано, а также сотрудников и студентов-дипломников, работавших под руководством автора ЮБ Шварца, И А Зыкова, ИВ Шароглазовой, А А Горчакова, П И Зимина, Т Ю. Ватолиной
Благодарности Автор глубоко признателен всем коллегам за помощь при выполнении настоящей работы Особую благодарность автор выражает зав лабораторией молекулярной цитогенетики ИФ Жимулеву, который инициировал и активно поддерживал на всех этапах проведение данной работы, Е С Беляевой за неизменно дружеское и полезное обсуждение полученных данных, и, безусловно, В Ф Семешину за участие и неоценимую помощь в проведении электронно-микроскопических экспериментов на всех этапах работы Автор также весьма признателен В А Мельникову, А Ю Керкису и НБ Рубцову за содействие в организации электронно-микроскопических исследований
