Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 11
1.1. Систематика, географическое распространение и филогения подгруппы melanogaster рода Drosophila 11
1.2. Гибридизация в подгруппе melanogaster 18
1.3. Особенности оогенеза и раннего развития дрозофилы 20
1.4. Основные принципы организации интерфазного ядра 26
1.5. Ткане- и видоспецифичность архитектуры ядер с политенными хромосомами у двукрылых насекомых 29
1.6. Системная реорганизация генома при видообразовании 31
1.7. Явление гибридного дисгенеза 33
1.7.1. Р-М система гибридного дисгенеза 34
1.7.2.1-R система гибридного дисгенеза 36
1.8. Факультативные доминантные летальные мутации 38
1.8.1. Предпосылки для выделения мутаций 38
1.8.2. Свойства факультативных доминантных летальных мутаций 39
1.8.3. Модель регуляторного гена 41
1.9. Роль хромосомных перестроек в видообразовании 44
2. Материал и методы 50
2.1. Виды и линии дрозофил 50
2.2. Постановка скрещиваний 51
2.3. Приготовление и анализ цитологических препаратов 51
2.4. Получение хромосомных перестроек 53
2.5. Получение летальных мутаций в Х-хромосоме 54
2.6. Статистическая обработка данных 55
3. Результаты и обсуждение 56
3.1. Пространственное расположение хромосом в ядрах трофоцитов яичников у Drosophila santomea 56
3.2. Взаимное расположение первичных политенных хромосом в ядрах трофоцитов различных линий и межлинейных гибридов D. melanogaster 61
3.3. Влияние пространственных взаимоотношений хромосом на проявление факультативных доминантных летальных мутаций у дрозофилы 74
3.3.1. Выделение факультативных доминантных леталей и их основные свойства 74
3.3.2. Модификация летального эффекта мутаций хромосомными перестройками 79
3.3.3. Цитогенетический анализ гетерозигот по перестройкам 83
3.3.4. Влияние хромосомных перестроек на функционирование генов у дрозофилы 89
Заключение 97
Выводы 99
Список использованных источников и литературы
- Систематика, географическое распространение и филогения подгруппы melanogaster рода Drosophila
- Ткане- и видоспецифичность архитектуры ядер с политенными хромосомами у двукрылых насекомых
- Приготовление и анализ цитологических препаратов
- Пространственное расположение хромосом в ядрах трофоцитов яичников у Drosophila santomea
Введение к работе
Актуальность темы
Изучение пространственной организации ядер клеток генеративной сферы и причин ее изменения в процессе видообразования является актуальным. Не менее важно исследование роли пространственных взаимоотношений хромосом в регуляции активности генов. Дрозофила является удобным модельным объектом для различных исследований в области эволюционной [Lemeunier, Ashburner, 1976; Стегний, 1993; Андрианов и др., 2003], популяционной генетики [Вайсман, Захаров, 2003], генетики клеточного цикла [Лебедева, Трунова, Омельянчук, 2005], генетики поведения [Субочева, Ромашова, Ким, 2004], регуляции активности генов [Корочкин, 1983; Мельник и др., 2004; Карпова, Грун-тенко, Раушенбах, 2005], пространственной организации ядра [Baiborodin et al., 1993; Стегний, Вассерлауф, 1994; Шарахов и др., 1997; Чубыкин, 2001] и многих других. Известно, что эволюция двукрылых насекомых (малярийных комаров, дрозофил) связана с преобразованиями архитектуры ядер генеративных клеток (системными мутациями). Взаимное расположение хромосом в трофоцитах (питающих клетках) яичников является видоспецифичным [Стегний, 1979; 1993]. Изучение особенностей архитектуры ядер трофоцитов у Drosophila santomea позволит уточнить систематическое положение и филогенетические отношения этого вида с другими видами подгруппы «melanogaster» рода Drosophila.
Выяснение факторов, лежащих в основе системной реорганизации генома, важно для понимания процесса видообразования. Предполагается, что возникновение системных мутаций связано с наличием определенных условий, таких как особая структурная организация генома, инбредное размножение, а также воздействие неблагоприятных абиотических и биотических факторов среды обитания в условиях экологической периферии [Стегний, 1993]. Согласно гипотезе Сведа, изолированное существование лабораторных и природных популяций дрозофилы может привести к возникновению различий в пространственной ориентации хромосом в ядрах половых клеток. При скрещивании особей из разных популяций у гибридов могут возникать несоответствия в ко-ориентации гомологичных хромосом в зиготе, которые приводят к гибридному дисгенезу - комплексу нарушений, возникающих в генеративной сфере [Sved, 1976]. Изучение взаимосвязи явления гибридного дисгенеза с системным мутагенезом может способствовать лучшему пониманию микроэволюционных процессов.
В настоящее время интенсивно проводится секвенирование геномов различных организмов. Установлена первичная последовательность нуклеотидов ДНК дрозофилы, человека и ряда других биологических объектов. Однако до сих пор наши знания о регуляции работы генов недостаточно глубоки. Предполагается, что одним из важных факторов в регуляции активности генов является взаимодействие различных локусов в пространстве ядра [Гвоздев, 2001; Marshall, 2003]. Экспрессия гена может зависеть от его положения в системе генотипа (эффект положения) [Бир-штейн, 1976; Жимулев, 1993] и от физического спаривания (конъюгации) гомологов (трансвекция) [Lewis, 1954]. Исследование влияния перестановки генетического материала на проявление генов дрозофилы является актуальным, поскольку может приблизить нас к пониманию того, как осуществляется контроль экспрессии.
Цель и задачи исследования
Цель работы: изучить особенности пространственной организации хромосом трофоцитов (питающих клеток) яичников дрозофил различных видов и линий. Задачи:
Установить пространственное расположение хромосом в ядрах трофоцитов яичников у Drosophila santomea.
Исследовать особенности архитектуры ядер питающих клеток яичников у межвидовых гибридов D. santomea с другими видами комплекса «yakuba»: D. уакиЪа, D. teissieri, D. erecta.
Изучить пространственное расположение гомологичных хромосом у межлинейных гибридов Drosophila melanogaster (Canton *S x Berlin; Canton *S x Oregon R; Berlin x Canton \S; Berlin x Oregon R; Oregon R x Berlin; Oregon R x Canton *S).
Установить особенности взаимного расположения гомологичных хромосом у межлинейных гибридов D. melanogaster в Р-М {Oregon R х к2; Canton S х к2) и I-R {Cha х Lu; Cha х W1118; Cha х Cha RC+; JA х Lu; JA x W1118; JA x Cha RC+) системах гибридного дисгенеза и реципрокных гибридов (W1U8xJA; Lu х Cha).
Исследовать влияние хромосомных перестроек (Т(Х; 2L) IE, 23CD;Ln(l) 7В-С, 12E-F; Іп(1)1Е, 20В-С; Іп(1) 4В-С, 20С; Ln(2LR)Cy; Ln(2LR)Pm; In(3LR)D) на проявление летальности факультативных доминантных летальных мутаций у D. melanogaster.
(х Провести цитогенетический анализ трофоцитов яичников самок Drosophila melanogaster с хромосомными перестройками (инверсиями и транслокацией) в гетерозиготном состоянии.
Научная новизна
В настоящей работе впервые изучено пространственное расположение хромосом в ядрах питающих клеток яични
ков у Drosophila santomea Lachaise and Harry и его межвидовых гибридов с D. yakuba. Показано, что для политенных
хромосом трофоцитов яичников D. santomea характерно отсутствие локального хромоцентра, объединение плеч вто
рой и третьей аутосом в центромерной области, отсутствие видимых контактов хромосом с ядерной оболочкой и меж
ду собой. Анализ межвидовых гибридов
D. santomea с D. yakuba показал видоспецифичность архитектуры ядер питающих клеток дрозофилы. Впервые про
веден анализ взаимного расположения хромосом трофоцитов у межлинейных гибридов D. melanogaster. Показаны
некоторые отличия в ко-ориентации гомологов различных линий в гибридных ядрах. Впервые проведен детальный
цитогенетический анализ трофоцитов яичников у гетерозигот D. melanogaster по инверсиям и транслокациям. Показа
но неоднозначное влияние хромосомных перестроек на конъюгацию политенных хромосом питающих клеток.
Практическая ценность
Полученная коллекция факультативных доминантных летальных мутаций может быть использована для дальнейших исследований. Результаты работы включены в курсы лекций «Теория мутагенеза», «Эволюционная генетика» для студентов Томского госуниверситета.
Апробация результатов
Результаты проведенных исследований были представлены на I, II, III Международных конференциях «Проблема вида и видообразования» (2000, 2001, 2004 гг., г. Томск), на 2-й Международной конференции «Retrotransposons: their impact on organisms, genomes, and biodiversity» (Хельсинки, Финляндия, 2002 г.), на Первом съезде Общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2003г.), на Третьем Съезде ВОГиС (Генетика в 21 веке: современное состояние и перспективы развития, Москва, 6-12 июня 2004 г.).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 9 работ.
Структура и объем диссертации
Систематика, географическое распространение и филогения подгруппы melanogaster рода Drosophila
Род Drosophila относится к семейству Drosophilida отряда Diptera. Этот род подразделяют на 8 подродов (субродов). В подроде Sophophora выделяют на 7 видовых групп: willistoni, saltans, obscura, melanogaster, mommai, firma и populi [Lemeunier, Ashburner, 1976]. Группа melanogaster включает 174 вида [Schawaroch, 2002], которые относят к 12 подгруппам: ananassae, montium, melanogaster, elegans, eugracilis, ficusphila, suzukii, takahashii, denticulate, flavohirta, nipponica, rhopaloa. Филогенетические взаимоотношения внутри этой группы изучались с помощью морфологических, цитологических, молекулярных данных [Clark et al., 1998; Kastanis et al., 2003; Kopp, True, 2002; Schawaroch, 2002; Yang et al., 2004; Young, Coleman, 2004].
К подгруппе melanogaster в настоящее время относят 9 близких видов дрозофил, которые на основе различных данных подразделяют на два комплекса: «yakuba» и «melanogaster». Комплекс «yakuba» включает пять видов: D. yakuba [Burla, 1954, цит. по Ashburner, 1989], D. teissierri [Tsacas, 1971, цит. по Ashburner, 1989], D. erecta [Tsacas, Lachaise, 1974, цит. no Ashburner, 1989], D. orena [Tsacas, David, 1978, цит. no Ashburner, 1989], D. santomea [Lachaise, Harry, 2000]. Иногда в этом комплексе выделяют две отдельные ветви: D. огепа — D. erecta и D. teissierri — D. yakuba — D. santomea. Комплекс «melanogaster» включает 4 вида: D. melanogaster [Meigen, 1830, цит. no Ashburner, 1989], D. simulans [Sturtevant, 1919, цит. no Ashburner, 1989], D. mauritiana [Tsacas, David, 1974, цит. no Ashburner, 1989], D. sechellia [Tsacas, Bachli, 1981, цит. no Ashburner, 1989]. Мухи этой подгруппы являются морфологически очень похожими друг на друга, за исключением D. santomea [Lachaise et al., 2000]. Однако их можно идентифицировать по половым органам самцов (гипопигиям).
Мухи рода Drosophila распространены повсеместно, хотя большинство видов живет в тропической и субтропической зонах. Некоторые из них -D. melanogaster, D. funebris, D. virilis — синантропные, их распространение тесно связано с человеком [Митрофанов, 1977]. D. simulans и D. melanogaster являются видами-космополитами. Однако D. simulans отличается от D. melanogaster в экологическом отношении тем, что встречается вдали от поселений человека. Остальные виды являются эндемиками. D. sechellia обитает только на некоторых островах Сейшельского архипелага (Cousin, Praslin, Frigate), a D. mauritiana обнаружена только на острове Маврикий, где нет ни D. simulans, ни D. melanogaster. D. erecta встречается только в экваториальной Западной Африке. Места её обитания тесно связаны с деревьями Pandanus candelabrum. D. orena найдена в горах Западного Камеруна на высоте 2100 м. Виды D. teissierri и D. уакиЪа широко распространены в афротропическом регионе (Рисунок 1.1.1) [Ashburner, 1989].
Девятый вид подгруппы - D. santomea Lachaise and Harry - был обнаружен несколько лет назад на острове Sao Tome западной Экваториальной Африки французскими исследователями [Lachaise et al., 2000]. Этот вид хорошо отличим от других видов подгруппы по желтой окраске тела и отсутствию типичной пигментации на брюшке [Lachaise et al., 2000; Llopart et al., 2002]. Сравнение политенных и митотических хромосом, гена period и аллозимов показало, что данный вид является близким с видом D. yakuba (Рисунок 1.1.2 в, г).
Филогенетические отношения внутри подгруппы melanogaster интенсивно изучались при помощи различных методов: цитогенетических -анализ метафазных и политенных хромосом (Рисунок 1.1.2 а, б) [Lemeunier, Ashburner, 1976; 1984], биохимических - анализ электрофоретической подвижности белков (Рисунок 1.1.2 в) [Eisses et al., 1979; Cariou, 1987; Kalantzi-Makri et al., 1999; Lachaise et al., 2000], гистохимических особенностей слюнных желез [Thomopoulos et al., 2004], гибридологического анализа [Lee, Watanabe, 1987], морфологических - сравнения ультраструктуры оболочки яиц [Kalantzi-Makri et al., 1999] и секреторных гранул слюнных желез [Thomopoulos et al., 2004], а также молекулярных методов (Рисунок 1.1.2 г) [Ashburner et al., 1984; Caccone et al., 1996; Lachaise et al., 2000; O Grady et al., 2001; Ко et al., 2003]. Однако до сих пор нет единого мнения в отношении того, какой вид занимает стволовую позицию, каковы относительные позиции гомосеквентных видов: D. simulans, D. sechellia, D. mauritiana, а также порядок пар видов D. yakuba — D. teissieri и D.erecta — D. orena. Полученные данные трактуются весьма противоречиво.
Существует минимум три взгляда на взаимное положение видов подгруппы melanogaster на филогенетическом древе. Одни исследователи (Рисунок 1.1.2 в) [Cariou, 1987] предполагают, что пара видов D. yakuba — D. teissieri более близка к комплексу «melanogaster». Другие [Lemeunier, Ashburner, 1976, 1984; Ко et al., 2003] выделяяют ветвь D. yakuba -D. teissieri + D.erecta — D. orena. Третьи [Schlotterer et al., 1994], опираясь на данные, полученные при анализе ITS региона гена рРНК, поместили D. orena ближе к комплексу «melanogaster».
Впервые филогенетические отношения между видами этой подгруппы были изучены с помощью анализа межвидовых фиксированных хромосомных инверсий (Рисунок 1.1.2 a) [Lemeunier, Ashburner, 1976; 1984]. В первой из двух работ авторы поместили вид D. melanogaster в терминальное положение по отношению к двум гомосеквентным видам {D. mauritiana и D. simulans), в последующей — в стволовое положение. Это противоречие основано на том, что у D. melanogaster в кариофонде имеется полиморфная перицентрическая инверсия во второй хромосоме с разрывами, близкими по локализации к фиксированной межвидовой перицентрической инверсии 2LRa, отличающей комплекс видов «melanogaster» от комплекса видов «yakuba». А также на убеждении авторов [Lemeunier, Ashburner, 1984], что видообразование на основе хромосомных инверсий осуществляется путем перехода полиморфных инверсий в фиксированное состояние.
В. Н. Стегнием и И. Э. Вассерлауф [1994] была проведена ревизия локализации полиморфной и фиксированной инверсий и выяснено, что точки разрывов этих инверсий хотя и близки, но не совпадают на 2-3 диска. Авторы придерживаются мнения, что полиморфные инверсии не имеют отношения к видообразованию, а фиксированные инверсии, отличающие один вид от другого, никогда не были распространены в полиморфном состоянии более 2-3 поколений. На основании комплексных данных В.Н. Стегний и И.Э. Вассерлауф поместили D. simulans в стволовое положение в комплексе, a D. melanogaster - в терминальное.
Интересное предположение было сделано на основании данных, полученных при изучении морфологии и гистохимических особенностей секреторных гранул клеток слюнных желез 8 видов подгруппы melanogaster [Thomopoulos et al., 2004]. Авторы выдвинули гипотезу, что стволовым видом в данной подгруппе является D. erecta.
Ткане- и видоспецифичность архитектуры ядер с политенными хромосомами у двукрылых насекомых
Архитектура ядер с политенными хромосомами у двукрылых насекомых является ткане- и видоспецифичной. В соматических тканях (слюнные железы, мальпигиевые сосуды) малярийных комаров и дрозофил хромосомы объединяются в единый центромерный узел по принципу эктопической конъюгации [Фролова, 1938; Стегний, 1979; 1987 а]. В питающих клетках яичников малярийных комаров локальный хромоцентр отсутствует. Видовая специфика проявляется как по признаку наличия -отсутствия связей хромосом с оболочкой (XL и 2R хромосомы), так и по морфологическим особенностям зон прикрепления хромосом (XL и 3R хромосомы) [Стегний, 1979; 1987 б].
Изучение политенных ядер дрозофил [Стегний, Вассерлауф, 1991 а; 1991 б; Вассерлауф, Стегний, 1992; Стегний, Вассерлауф, Ананьина, 1996] показало, что для них также характерны существенные различия пространственной организации хромосом в соматических и генеративных клетках (трофоцитах яичников). В питающих клетках яичников D. melanogaster до первых стадий эндоредупликации S3.4 выявляется хромоцентр [King, 1970]. Изучение взаимного расположения политенных хромосом трофоцитов у этого вида на более поздних стадиях развития показало отсутствие локального хромоцентра. Возможно, он сохраняется, но в виде диффузной, рассредоточенной структуры. Отдельные хромосомные плечи разобщены в пространстве ядра и прикрепляются к ядерной оболочке центромерными или боковыми (локусоспецифичными) участками хромосом, а XL-плечо ещё и теломерным. Плечи хромосом 2 и 3 имеют некоторое рассредоточение в участках прикрепления центромерных районов. Взаиморасположение хромосом, определяемое местами хромосомно-мембранных связей, по-видимому, симметрично и приблизительно соответствует 120 для XL-плеча, хромосом 2 и 3, причем хромосомы расположены (по часовой стрелке) в порядке XL - 2 - 3. Хромосома 4 очень компактная, находится в зоне прикрепления центромерных районов хромосомы 3 [Стегний, Вассерлауф, 1991а].
Анализ взаимного расположения вторичных политенных хромосом, имеющих хорошую дисковую исчерченность, у мутантных линий D. melanogaster (otu,fes) [Стегний, Вассерлауф, 1991а; Шарахов, Вассерлауф, Стегний, 1997] выявил его идентичность с расположением первичных политенных хромосом трофоцитов яичников. Эти данные демонстрируют принципиальные отличия архитектуры хромосом клеток генеративной системы от клеток соматических тканей.
Изучение пространственной организации хромосом трофоцитов яичников гомосеквентных видов D. simulans, D. mauritiana и D. sechellia также показало отсутствие локального хромоцентра. Отдельные хромосомы рассредоточены в пространстве ядра. Вместе с тем каждый вид имеет характерные видоспецифичные особенности архитектуры (Рисунок 1.1.3) [Стегний, Вассерлауф, 19916].
Наиболее значительно отличается архитектура ядер трофоцитов у D. mauritiana. Третья хромосома этого вида имеет объединенные в центромерном районе плечи и яркий блок центромерного гетерохроматина. Плечи XL, 2L и четвертая хромосома имеют связи с ядерной оболочкой. D. simulans и D. sechellia имеют растянутый по ядерной оболочке хроматиновый «мостик» (диффузный хромоцентр), объединяющий все хромосомные плечи по центромерным участкам, которые в то же время связаны с ядерной оболочкой [Стегний, Вассерлауф, 19916; 1994].
Анализ некоторых экспериментальных межвидовых гибридов дрозофил комплекса «melanogaster» показал, что спаривание гомеологичных хромосом в питающих клетках нарушено. Несконъюгированными могут быть центромерные районы или же целые плечи. В гибридных ядрах полностью сохраняются характерные для каждого вида особенности архитектуры. Так, например, у гибрида D. таигШапа х D. simulans центромерные участки гомеологов «simulans» объединяются в диффузный хромоцентр, характерный для данного вида. Гомеологи «таигШапа» не обнаруживают подобного объединения [Стегний, Вассерлауф, 1991 б].
Детальное исследование архитектуры ядер трофоцитов второго комплекса подгруппы melanogaster - комплекса «yakuba» - подтвердило видоспецифичность пространственного расположения хромосом (Рисунок 1.1.3) [Вассерлауф, Стегний, 1992]. D. огепа имеет типичную хромоцентральную организацию хромосом. Как было показано ранее [Lemeunier et al., 1978], этот вид отличается от остальных наибольшим содержанием гетерохроматина в геноме. У D. erecta центромерные районы объединены в диффузный хромоцентр. На ранних стадиях развития хромосом видна связь центромерных районов хромосом 2 и 3 с ядерной оболочкой. У Х-хромосомы такой связи не выявлено. D. yakuba и D. teissieri существенно отличаются от других видов тем, что плечи хромосом 2 и 3 плотно объединены в центромерном районе. Отсутствует явная связь между хромосомами и с ядерной оболочкой [Вассерлауф, Стегний, 1992].
Приготовление и анализ цитологических препаратов
Для получения цитологических препаратов трофоцитов яичников брали 1-1,5 суточных самок дрозофилы, выращенных на стандартном дрожжевом корме. Яичники выделяли в растворе 0,7% NaCl и фиксировали в этанол-уксусном фиксаторе (соотношение 3:1). Окраску производи лактоацетоорсеиновым красителем в течение 10-20 минут. После этого яичники отмывали в 45 % растворе уксусной кислоты и слегка давили на предметном стекле. Препараты хромосом слюнных желез готовили аналогичным способом без предварительной фиксации из личинок третьего возраста. Для анализа пространственного расположения хромосом в ядре у D. santomea готовили недавленые препараты. Для этого окрашенные яичники накрывали покровным стеклом без надавливания для сохранения целостности ядер.
Цитологический анализ трофоцитов яичников проводили при помощи микроскопа Laboval-4 при увеличении 10 х 100 с использованием масляной иммерсии. Анализировали ядра с хорошо развитыми первичными политенными хромосомами. Подсчитывали количество ядер с нарушениями конъюгации гомологичных хромосом (асинапсисами).
У межлинейных гибридов Fl Canton S х Berlin, Oregon R х 7 J А х W1118 ядра, имеющие асинапсисы, относили к одному классу. При анализе трофоцитов гетерозигот по хромосомным перестройкам выделяли три класса ядер: 1) ядра без видимого нарушения спаривания гомологов; 2) ядра с небольшими участками асинаптирования; 3) ядра со значительными нарушениями конъюгации гомологичных хромосом.
При оценке контрольной линии yellow и гетерозигот по транслокации Т(1;2)1Е; 23C-D ко второму классу относили ядра с асинапсисом одного из пяти плеч. При анализе гетерозигот по парацентрическим инверсиям в Х-хромосоме: 1) In(l)7B-C; 12E-F; 2) 1п(1)1Е;20В-С\ и 3) Іп(1)4В-С; 20С во второй класс включали ядра с нарушением конъюгации гомологов в 1-2 плечах, гетерозигот по перицентрическим инверсиям (In(2LR) Су О; In(2LR) Pm) — в 1-3 плечах. Это связано с тем, что наличие в генотипе инверсии в гетерозиготном состоянии, как правило, нарушает спаривание гомологов. Таким образом, к третьему классу относили ядра, в которых имелось более одного асинапсиса, не связанного с наличием в плече инверсии. Достоверность различий между опытами и контролем по количеству ядер с асинапсисами рассчитывали с помощью критерия Хи-квадрат. Количество проанализированного материала представлено в таблице 2.3.1.
Для получения хромосомных перестроек в Х-хромосоме на основе линии yellow брали самцов и облучали гамма-лучами в дозе 3000 Gr (установка «Игур-1»). Затем их скрещивали с виргинными самками линии, несущей цепочку маркеров в Х-хромосоме - у ее cv ct vf. Полученных от скрещивания дочерей, имеющих одну облученную Х-хромосому, а вторую — с цепочкой маркеров, сажали индивидуально с самцами у ее cv ct v f Отбирали самок, в потомстве которых не было кроссоверных сыновей, или их было мало. Их сыновей, которые не несли цепочку маркеров, вводили в культуру, скрещивая с самками линии Muller-5 и линии, несущей сцепленные Х-хромосомы. Полученные культуры проверяли на наличие перестроек цитологически.
Полученные хромосомные перестройки поддерживали в культуре путем скрещивания самцов yellow с перестройкой в Х-хромосоме с самками со сцепленными Х-хромосомами C(1)DX, у2 wf. Чтобы исключить влияние аутосом в тестах по действию перестроек на проявление леталей, самок исходной линии C(1)DX, у2 w/в течение десяти поколений скрещивали с самцами линии yellow. Такая процедура обеспечивает замену аутосом исходной линии C(1)DX, у2 w f на аутосомы линии yellow. Далее самцов с перестройкой скрещивали с этими самками. Таким образом, самцы с хромосомными перестройками отличались от фондовых самцов yellow только наличием перестройки.
Для получения самок-гетерозигот по инверсиям и транслокации самок фондовой линии yellow скрещивали с самцами, несущими перестройки. Виргинных самок F1 использовали для тестирования мутаций.
Пространственное расположение хромосом в ядрах трофоцитов яичников у Drosophila santomea
Архитектура ядер трофоцитов яичников двукрылых насекомых (дрозофила, малярийный комар) является видоспецифичным показателем. Анализ пространственного расположения хромосом в этих ядрах позволяет идентифицировать близкие виды, в том числе и гомосеквентные, а также установить филогенетические отношения в видовых комплексах [Стегний, 1979; 1987; Стегний, Вассерлауф, 1994; Стегний, Вассерлауф, Ананьина, 1996].
Исследование трофоцитов яичников у Drosophila осложняется отсутствием развитых политенных хромосом. Однако для оценки общих принципов пространственной организации ядра, таких, как наличие -отсутствие локального хромоцентра, прикрепление отдельных хромосом к ядерной оболочке, степень разобщенности хромосом и других, вполне подходящими являются первичные политенные хромосомы [Стегний, Вассерлауф, 1991 а]. Первичные политенные хромосомы значительно короче обычных политенных хромосом, не имеют четко выраженной дисковой структуры, представлены рыхлыми пучками хромонем. Тем не менее, они вполне надежно диагностируются по отдельным участкам [Жимулев, 1992]. Изучение пространственного расположения хромосом в ядрах трофоцитов яичников у D. santomea — вида комплекса «yakuba» — является актуальным, поскольку оно позволит уточнить систематическое положение и филогенетические отношения этого вида с другими видами подгруппы «melanogaster» рода Drosophila.
В ходе выполнения настоящей работы изучена архитектура ядер трофоцитов яичников 23 самок D. santomea, всего проанализировано 549 ядер на разных стадиях компактизации первичных политенных хромосом. Условно выделяли три типа хромосом по морфологии: 1) тонкие на ранних стадиях развития; 2) средние (Рисунок 3.1.1 а); 3) компактные хромосомы перед началом распада (Рисунок 3.1.1 б).
Для первичных политенных хромосом трофоцитов яичников D. santomea характерно следующее взаимное расположение (Рисунок 3.1.1 а, б): локальный хромоцентр отсутствует, плечи второй и третьей аутосом объединены в центромерной области. Явных контактов хромосомных плеч с ядерной оболочкой не выявлено. Левое плечо Х-хромосомы не имеет видимой связи с аутосомами. В целом, данное расположение хромосом в ядре D. santomea в значительной степени напоминает таковое у D. уакиЪа (рис. 3.1.1 в, г) и D. teissieri, отличается от расположения хромосом у D. erecta и D. огепа (комплекс уаи6 я»)[Вассерлауф, Стегний, 1992]. Кроме того, архитектура ядер трофоцитов D. santomea имеет общие черты с архитектурой D. mauritiana комплекса «melanogaster» [Стегний, Вассерлауф, 1991 б].
При проведении данного исследования был выявлен незначительный внутрииндивидуальный полиморфизм у D. santomea по структурным особенностям хромосом. Обнаружено, что в части проанализированных ядер наблюдается отсутствие плотного контакта плеч одной или двух аутосом в центромерной зоне. Доля ядер с такими нарушениями различалась в зависимости от стадии компактизации хромосом. Для ядер с тонкими хромосомами она составляла в среднем 16,5 ± 3,9 %, со средними - 4,4 ±1,2 %, с компактными - 3,7 ± 1,5%. В среднем по всем стадиям - 6,2 ± 1,0 %. Сравнение частот ядер с отсутствием плотного контакта на разных стадиях формирования политенных хромосом при помощи фи-критерия Фишера показало, что доля таких ядер достоверно выше на ранних стадиях развития трофоцитов (Fi=ll,92 и F2=ll,80). На двух других выделенных стадиях различия по частоте встречаемости ядер с разобщенными плечами не достоверны (F=0,13). Возможно, это связано с увеличением степени эндорепликации и/или компактности хроматина, либо с особенностями функционирования хромосом на более ранних стадиях развития. Кроме того, среди проанализированных ядер были выявлены незначительные нарушения синапсиса гомологов (около 3 % ядер).
Одним из главных показателей видоспецифичности архитектуры хромосом является сохранение индивидуальных позиций гомеологов у гибридов. Это проявляется в разобщенности мест прикрепления гомеологов к ядерной оболочке, а также в нарушении спаривания гомеологичных хромосом (асинапсисе) в гибридных ядрах [Стегний, 1993]. Поскольку пространственное расположение хромосом трофоцитов яичников у D. santomea визуально сходно с таковым у D. уакиЪа, мы провели гибридизацию этих двух видов дрозофил для сравнения пространственных позиций их геномов. По литературным данным известно, что D. santomea и D. уакиЪа успешно гибридизуются в естественных и лабораторных условиях обитания. В обоих направлениях скрещиваний возникают фертильные самки и стерильные самцы [Lachaise et al., 2000; Coyne et al., 2002].
Анализ препаратов трофоцитов яичников гибридных самок D. santomea х D. уакиЪа и D. yakuba х D. santomea выявил наличие нарушений спаривания гомеологичных хромосом. Проведен подсчет ядер с асинапсисом у гибридов D. yakuba х D. santomea. Проанализировано 10 препаратов яичников гибридных самок, всего 164 ядра трофоцитов. Единообразия по характеру асинаптирования хромосом не наблюдалось. Показано, что нарушение конъюгации отдельных хромосомных плеч может быть частичным (Рисунок 3.1.1 д) или полным (Рисунок 3.1.1 е). Как правило, частичное асинаптирование наблюдалось в прицентромерных областях.
