Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Введение
1.1. Актуальность проблемы 6
1.2. Цели и задачи исследования 8
1.3. Научная новизна и практическая ценность работы 9
1.4. Апробация работы 9
1.5. Структура и объем работы 10
1.6. Публикации 10
1.7. Вклад автора 11
1.8. Благодарности 11
1.9. Список использованных сокращений 12
Глава 2. Обзор литературы
2.1. Онкогенез и тумор-супрессоры 13
2.2. Нейрофиброматоз 2 типа 14
2.3. Характеристика белкового семейства ERM
2.3.1. Функциональная организация 15
2.3.2. Регуляция активности ERM белков 18
2.4. MERLIN - особый член семейства ERM 19
2.4.1. Регуляция активности мерлина путем фосфорилирования 20
2.4.2. Структурные особенности мерлина в сравнении с ERM белками 21
2.4.3. Модельные организмы для изучения белка мерлин 22
2.4.4. Локализация белка мерлин в органах и тканях 23
2.4.5. Гомология дрозофилиного и человеческого мерлина 24
2.4.6. Участие белка мерлин в сигнальных путях и его тумор-супрессорные свойства 25
2.4.7. Характеристика мутаций гена Merlin у дрозофилы 27
2.4.8. Функциональные домены белка мерлин, необходимые
для его активности и правильной внутриклеточной локализации 28
2.4.8.1. Внутриклеточая локализация усеченных форм мерлина 29
2.4.8.2. Способность усеченных форм мерлина спасать летальный эффект мутации Мег4 30
2.4.8.3. Фенотипы, наблюдаемые при сверхэкспрессии 30 усеченных и мутантных форм мерлина
2.5. Основные этапы сперматогенеза у дрозофилы 32
2.6. Использование системы GAL4-UAS для изучения функций продуктов генов 38 Заключение по обзору литературы: 42
Глава 3. Материалы и методы
3.1. Линии дрозофилы, использованные в работе, и работа с ними 43
3.2. Выделение геномной ДІЖ дрозофилы 44
3.3. Проведение полимеразной цепной реакции 44
3.4. Очистка продуктов ПЦР 46
3.5. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции и ее очистка 46
3.6. Трансформация E.coli плазмидной ДНК 47
3.7. Выделение плазмидной ДНК 48
3.8. Лигирование ДНК 48
3.9. Трансформация компетентных клеток E.coli лигазной смесью 49
3.10. Отбор клонов, содержащих плазмиду со встройкой гена, кодирующего мутантную форму белка мерлин 49
3.11. Рестрикционный анализ плазмид, выделенных из клонов E.coli после трансформации лигазной смесью 50
3.12. Определение нуклеотидной последовательности полученных конструкций 50
3.13. Трансформация клеток зародышевого пути D. melanogaster 51
3.14. Иммуноцитохимическое окрашивание крыловых имагинальных дисков и семенников 52
3.15. Окраска семенников DAPI 5 3
3.16. Окраска семенников MitoTracker Red (Invitrogen) 53
3.17. Окраска семенников ацетоорсеином 54
Глава 4. Результаты
4.1. Аномалии сперматогенеза у мутантов по гену Merlin 56
4.2. Локализация белка мерлин в сперматогенезе дрозофилы 59
4.3. Нарушение поляризации цист у мутантов Мег3 и Мег4 60
4.4. Электронномикроскопические исследования семенников 65
4.5. Получение трансгенных линий D. melanogaster, несущих различные аллели гена Merlin в составе вектораpUASp 61
4.5.1. Анализ эктопической экспрессии мутантных вариантов белка мерлин в соматической ткани 68
4.5.2. Восстановление сперматогенеза у мутантов Мег4 с помощью экспрессии усеченных копий гена Merlin 69
4.6. Нерасхождение хромосом в линиях дрозофилы, мутантных по гену Merlin 71
4.7. Эктопическая экспрессия усеченных копий гена Merlin в сперматогенезе на фоне нормального белка мерлин 77
4.7.1. Анализ влияния эктопической экспрессии конструкций UASp-mycMer+ и UASp-inycMer345'635 на сперматогенез на фоне нормального белка мерлин 79
4.7.2. Анализ влияния эктопической экспрессии конструкций UASp-mycMer3, UASp-mycMer*83 и UASp-mycMer1'379 на сперматогенез на фоне нормального белка мерлин 82
Глава 5. Обсуждение
5.1. Восстановление жизнеспособности мутации Мег4 в соматической ткани 86
5.2. Отличие усеченной формы мерлина mycMer1"330 от mycMer1"
5.3. Восстановление сперматогенеза у самцов Мег4 при
эктопической экспрессии различных форм мерлина 88
5.4. Роль белка мерлин в соматической и генеративной тканях 89
5.5. Значение С-концевого домена мерлина в сперматогенезе дрозофилы 91
5.6. Значение мерлина в стабилизации структуры небенкерна 92
5.7. Участие мерлина в цитокинезе 95
5.8. Сравнительный анализ нарушений, вызванных мутациями гена Merlin, и нарушений, возникающих в результате эктопической экспрессии 98
5.9. Внутриклеточная локализация мерлина 99
Заключение 101
Выводы 107
Список цитированной литературы
- Научная новизна и практическая ценность работы
- Регуляция активности мерлина путем фосфорилирования
- Проведение полимеразной цепной реакции
- Электронномикроскопические исследования семенников
Введение к работе
1.1. Актуальность проблемы Способность к регуляции пролиферации - важнейшее свойство многоклеточных организмов, необходимое им, чтобы контролировать свой размер и форму, поэтому нарушения в контроле деления клетки могут иметь тяжелые последствия для организма в целом. Ошибочная активация пролиферации часто заканчивается формированием опухоли и развитием рака. Многие гены, как непосредственно контролирующие пролиферацию, так и косвенно вовлеченные в контроль клеточного цикла, были идентифицированы в качестве онкогенов и тумор-супрессоров.
Среди известных тумор-супрессоров интересен открытый в 1993 году ген Neurofibromatosis 2 (Nf2), кодирующий белок мерлин (или шванномин), принадлежащий к суперсемейству р4.1 - большой группе цитоплазматических белков, связанных с мембраной. Наибольшую степень сходства он имеет с белками подсемейства ERM (EZRIN- RADIXIN- MOESIN). Отсюда название MERLIN - MOESIN-EZION-RADIXIN-like- protein. Мутация этого гена вызывает у человека заболевание; нейрофиброматоз второго типа, характеризующееся формированием билатеральной акустической шванномы, поражающей восьмую пару черепномозговых нервов, а также других опухолей, ассоциированных с центральной нервной системой, таких как менингиомы и эпендимомы (Martuza, Eldridge, 1988; Trofatter et al., 1993; Rouleau et al., 1993).
Чтобы исследовать клеточные функции белка мерлин, используют его гомологи у мыши и у дрозофилы. У обоих видов особи, гомозиготные по мутации, не выживают, что свидетельствует о жизненно важных функциях мерлина (McClatchey et al., 1997; Fehon et al., 1997). В отличие от человека у мышей, гетерозиготных по Nf2 мутации, не образуются шванномы и другие характерные опухоли. У них развиваются злокачественные остеосаркомы и фибросаркомы, причем метастатического характера (McClatchey et al., 1998).
Что касается дрозофилы, то она тоже подходит для изучения функций белка мерлин, несмотря на отсутствие шванновских клеток - мишени болезни у человека. Эксперименты с использованием мутаций с потерей функций мерлина и FLP-FRT системы для получения соматических мозаичных клонов мутантных эпителиальных клеток показали, что, как и у млекопитающих, мерлин-дефицитные клетки дрозофилы характеризуются гиперплазией. Таким образом, мерлин выполняет функцию тумор-супрессора и у дрозофилы (LaJeunesse et al., 1998).
К настоящему времени описаны четыре мутации гена Merlin у дрозофилы. Ни один из аллелей не вызывает эмбриональной гибели, три из этих мутаций, Мег1, Мег , Мег4 , вызывают гибель на стадии личинки и куколки. Единственный жизнеспособный аллель - Мег . Мухи, гомозиготные по Мег3, доживают до взрослого состояния, но стерильны, их крылья более широкие, для глаз характерна нерегулярность фасеток, а на голове образуются аномальные кутикулярные структуры (Fehon et al., 1997).
Чтобы выяснить, каким образом мутация Мег вызывает стерильность самцов, нами были проведены исследования сперматогенеза. Drosophila melanogaster. Сперматогенез объединяет в себе два типа клеточных делений: митотическое и мейотическое, а также процессы клеточного роста и дифференцировки. Таким образом, он является удобной экспериментальной моделью для изучения функций белков на клеточном и молекулярном уровнях. Нами было обнаружено, что мутация Мег влияет на процессы компактизации ядер и поляризации цисты, что приводит к серьезным нарушениям сперматогенеза на стадии индивидуализации спермиев, что и вызывает стерильность самцов.
Ранее было показано, что мутация Мег3 затрагивает особый участок белка - «Blue Box» (170YQMTREM177), который идентичен у человеческого и дрозофилиного гомологов белка. Он имеет важное значение для правильного функционирования белка (LaJeunesse et al., 1998). Для изучения этого района, а также других функциональных доменов мерлина, были созданы конструкции, кодирующие различные мутантные и усеченные копии белка на основе вектора pUAST, который позволяет экспрессировать копии генов в соматической ткани в системе GAL4-UAS (LaJeunesse et al., 1998).
Спецификой нашей работы является использование модифицированного UAS-вектора - pUASp, который позволяет достичь высокого уровня экспрессии белков в генеративных тканях дрозофилы (Rorth, 1998).
Чтобы определить функционально значимые районы белка, необходимые для правильного протекания сперматогенеза дрозофилы, мы создали конструкции на основе вектора pUASp, кодирующие различные мутантные формы мерлина. Нами было показано, что белок мерлин, который является тумор-супрессором в соматических тканях дрозофилы, играет существенную роль в процессах сперматогенеза. В частности, открытая форма белка участвует в агломерации митохондрий на стадии «луковицы», а закрытая влияет на цитокинез в мейозе. Таким образом, в соматической и генеративной тканях мерлин функционирует по-разному.
Научная новизна и практическая ценность работы
Выражаю свою глубокую признательность за помощь и огромный вклад в выполнение этой работы, в первую очередь, д.б.н. Омельянчуку Л.В, к.б.н. Дороговой Н.В. и к.б.н. Гусаченко A.M. Также я глубоко признательна коллективу лаборатории генетики клеточного цикла- к.б.н. Федоровой С.А., Нерушевой О.О., Галимовой Ю.А., Дубатоловой Т.Д., д.б.н. Лебедевой Л.И., к.б.н. Копылу С.А., д.б.н. Груздеву А.Д. за помощь в экспериментальной работе и дружескую поддержку. Я выражаю огромную благодарность коллегам и друзьям, оказавшим на разных этапах моей работы неоценимую помощь: Баричевой Э.М., Карагодину Д.А., Блинову А.Г., Головниной К.А., Демакову С.А., Волковой Е.И. и многим другим. 1.9. Список использованных сокращений Nf2 - Neurofibromatosis 2, нейрофиброматоз второго типа ERM - подсемейство белков эзрин, радиксин, моезин UAS - Upstream Activated Sequence FERM - Four-point one, ezrin, radixin, moezin ERMAD - ERM association domain PIP2- фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфат EGFR- эпителиального фактора роста РАК - р21-активируемая киназа РКА - цАМФ зависимая протеинкиназа А КЗП - клетки зародышевого пути LB - бульон Лурия DABCO - l,4-diazabicyclo[2.2.2]octane DAPI - 4 ,6 -диамидино-2-фенилиндол
Мутации, которые приводят к онкологическим заболеваниям, обычно затрагивают участки хромосом, в которых расположены гены, регулирующие рост и дифференцировку клеток. В результате таких мутаций клетки имеют укороченный клеточный цикл и измененную способность к клеточной дифференцировке, способны вторгаться в соседние ткани, метастазировать и провоцировать врастание кровеносных сосудов в новообразования (Kastan, 2007; Sherr, McCormick, 2002; Stewart, Weinberg, 2006; Wikman, Kettunen, 2006).
Одними из таких генов являются протоонкогены, превращение которых в онкогены в результате мутаций, приводящих к изменению структуры специфического белка, или в результате повышения уровня экспрессии протоонкогена, служит причиной образования опухолевых клеток (Hemann, Narita, 2007).
Открытие онкогенов дало предпосылку к открытию другого класса генов - супрессоров опухолей (или тумор-супрессоров). Почти все такие гены были открыты в течение последних 17 лет (Sherr, 2004). Тумор-супрессорные гены вовлечены в клеточный цикл, участвуют в убиквитинизации и деградации белков, участвуют в передаче сигналов и клеточной дифференцировке (Sherr, 2004). Основные функции тумор-супрессоров - это контроль над клеточной пролиферацией и обеспечение постоянства клеточного состава организма. Поэтому мутации в этих генах приводят к развитию онкологических заболеваний. Даже одной копии гена тумор-супрессора, в большинстве случаев, достаточно для защитной функции. Для развития опухоли требуется «двойная» инактивации обоих аллелей гена тумор-супрессора (Knudson, 1971). В случае образования опухолей, тумор-супрессорные гены теряют свои функции в результате мутаций в них или в результате делеций. В случае наследственных онкологических заболеваний пациенты, как правило, имеют одну инактивированную копию гена тумор-супрессора, полученную от одного из родителей, и дополнительную соматическую мутацию. Полная потеря функции гена может происходить или при потере гетерозиготности или по эпигенетическому механизму. Тумор-супрессорные гены зачастую мутируют в спорадических опухолях (Sherr, 2004). Изучение этих генов дополняет в целом понимание природы онкологических заболеваний.
Относительно недавно были открыты микро-РНК, которые влияют на экспрессию генов через подавление транскрипции, путем расщепления матричной РНК. Эти микро-РНК вовлечены в некоторые виды онкологических заболеваний человека, где они могут действовать как онкогены и как тумор-супрессоры (Dalmay, Edwards, 2006; Zhang et al., 2007).
Регуляция активности мерлина путем фосфорилирования
Традиционно считалось, что белки суперсемейства р4.1 играют структурную роль, связывая трансмембранные белки с цитоскелетом. Поэтому открытие в 1993 году того факта, что белок мерлин, член этого суперсемейства, выполняет роль тумор-супрессора, было неожиданным. Ранее не было показано, что белки, члены этого семейства, или какие-либо другие белки, связывающиеся с цитоскелетом, участвуют в регуляции пролиферации. Это пробудило у исследователей интерес к более детальному изучению функций и структурных особенностей белков семейства ERM, как наиболее гомологичных мерлину. Первые исследования мерлина основывались на предположении, что он работает подобно другим ERM белкам, в силу своего структурного сходства (Trofatter et al.,1993; Rouleau et al., 1993). Но вскоре стало ясно, что, несмотря на то, что их функции во многом перекрываются, мерлин, все же, имеет свои уникальные функции, которые до настоящего момента остаются неясными. Исследования на культуре клеток показали, что мерлин концентрируется в актин-богатых доменах клетки, таких как мембранные выпячивания на переднем крае мигрирующих клеток (Gonzalez-Agosti et al., 1996; Sainio et al., 1997). Это вполне согласуется с данными по локализации ERM белков. Однако, распределение внутри клетки и регуляция активности белка мерлин указывают на то, что его функции отличаются от функций ERM белков.
Мерлин также вовлечен в рециркуляцию рецепторов и эндоцитоз. Он ингибирует распад рецептора тромбоцитарного фактора роста и связывает субстрат тирозинкиназы, который регулируется гепацитарным фактором роста (HRS). Также мерлин регулирует рециркуляцию и обновление рецептора эпителиального фактора роста- EGFR (Curto et al., 2007). Мерлин расположен на мембране и способен связываться с мембранными рецепторами и регулировать их функции и локализацию. Через связь с микротрубочками тумор-супрессоры вовлечены в регуляцию пролиферации клеток, а также регулируют деление клеток, эндоцитоз и рециркуляцию рецепторов факторов роста. Мерлин также играет важную роль в организации цитоскелетньгх микротрубочек (Muranen et al., 2007).
Мерлин регулирует пролиферацию во многих типах клеток, но тумор-супрессорные функции мерлина напрямую связаны с его фосфорилированием.
Мерлин, как и другие белки семейства ERM, может существовать в открытой и закрытой формах за счет внутримолекулярной ассоциации С- и N- концевых доменов. Закрытая форма мерлина обладает тумор-супрессорными функциями, в то время как открытая форма не способна регулировать рост клеток. Фосфорилирование серина в положении 518 на С-концевом участке белка с помощью р21-активируемой киназы (РАК) или цАМФ зависимой протеинкиназы A (PICA) регулирует самоассоциацию мерлина и инактивирует активность белка как тумор-супрессора (Alfthan, Heiska, 2004; Rong et al., 2004; Kissil et al., 2002). Однако регуляция функций мерлина остается до сих пор неясной.
РКА киназа фосфорилирует не только серии в положении 518, но и серии в положении 10 на N-концевом домене белка. Нефосфорилированная форма по положению SerlO влияет на морфологию клеток, а его фосфорилирование оказывает влияние на организацию актинового цитоскелета. Так мерлин S10A (серии в положении 10 заменен на аланин -аналог константно-нефосфорилированной формы) уменьшает количество клеточного F-актина, а Мерлин S10D (серии в положении 10 заменен на аспаргиновую кислоту- аналог константно-фосфорилированной формы) стабилизирует F-актиновые филаменты. Мерлин локализуется на плазматической мембране и связывает актиновый цитоскелет с мембранными белками, фосфорилирование мерлина по серину в положении 10 играет существенную роль в этом связывании. (Laulajainen et al., 2007). Структурные особенности мерлина в сравнении с ERM белками
Как и другие белки семества ERM, мерлин можно условно разделить на три части: N-концевой FERM домен, протяженный участок coiled-coil и короткий С-концевой домен (Shimizu et al., 2002; Kang et al., 2002).
FERM домен мерлина также образует структуру «трилистника» и взаимодействует с некоторыми белками, с которыми связывается FERM домен ERM белков, - в частности, с CD44 (Shimizu et al., 2002; Kang et al., 2002).
Первое явное отличие мерлина от других белков семейства ERM- это отсутствие сайта связывания с фибриллярным актином на С-концевом домене, найденного у всех ERM белков (Turanen et al., 1994; Gary, Bretscher, 1995). Показано, что мерлин взаимодействует с фибриллярным актином, используя сайты связывания, находящиеся в пределах FERM домена (Хи, Gutmann, 1998; Morrison et al., 2001, Sainio et al., 1997).
Учитывая разницу в расположении актин-связывающих сайтов, можно предположить, что мерлин взаимодействует с актиновым цитоскелетом каким-то другим способом, отличающимся от того, который предполагается для ERM белков. Мерлин способен «заякоривать» актиновые филаменты в плазматической мембране за счет связывания с трансмембранным рецептором CD44 (Morrison et al., 2001, Sainio et al., 1997), /31-интегрином (Obremski et al., 1998) и паранодином (Denisenko-Nehrbass et al., 2003).
Проведение полимеразной цепной реакции
Геномную ДНК дрозофилы выделяли по стандартной методике с модификациями (Bender et al, 1983). Мух или личинок гомогенизировали в пробирке Eppendorf объемом 1,5 мл с помощью пестика, затем, добавляли 200 мкл лизирующего буфера (0,1М NaCl; 0,2М сахарозы, 0,05М ЭДТА, 0,1М Трис, 0,5% SDS, 0,5 % DEPC) и снова гомогенизировали. Полученный гомогенат инкубировали при 65С в течение 30 мин. Затем к нему добавляли 300 мкл водного раствора, содержащего ЗМ ацетата калия и 2М уксусной кислоты; полученную смесь перемешивали и инкубировали 30 мин на льду. Содержимое пробирки снова перемешивали и центрифугировали 10 минут 12 тыс. об/мин (на центрифуге Eppendorf 5415 D). Супернатант переносили в новую пробирку и добавляли к нему равный объём (500 мкл) 96 % этанола; перемешивали смесь и инкубировали при комнатной температуре 5-10 мин. Затем центрифугировали в 10 минут 12 тыс. об/мин (на центрифуге Eppendorf 5415 D). Супернатант отбрасывали, осадок промывали 500 мкл 70 % этанола и центрифугировали 3-5 минут 12 тыс. об/мин. Супернатант снова отбрасывали, осадок сушили при 37С в течение 10 мин. Высушенный осадок, содержащий ДНК, растворяли в 50 мкл ТЕ буфера (0,01 М Трис-НС1 рН 8,0, 0,001М ЭДТА).
Фрагменты ДДК, содержащие различные мутантные варианты гена Merlin, получали путем ПЦР, используя в качестве матрицы геномную ДНК дрозофилы, содержащей встроенную в вектор pUAST кДНК мутантных аллелей Мег3, Мег345 635\МегАВЬ\ Мег1 379, Мег1 169, а также нормального аллеля Мег+, с использованием следующих олигонуклеотидных праймеров: прямого 5 GAATACAAGAAGAGAACTCTGAATAGGGAATTG-3 и обратного 5 -CAGAAGTAAGGTTCCTTCACAAAGATCCTC-3 ПЦР проводили в 0,2 мл пробирках (BioTip, Германия) с использованием следующих стоковых растворов: dNTP - 10 мМ (СибЭнзим, Россия) Буфер - 10 кратный (СибЭнзим, Россия) Праймеры - 10 мкМ Thermus Aquaticus DNA Polymerase (Taq рої) — 5 е.а. /мкл (СибЭнзим, Россия) MgCl2 - 25 мМ Состав реакционного буфера (1-кратного): 60 мМ Tris-HCl (рН 8,5 при 25С), 25 мМ КС1, 1,5 мМ MgCl2, 10 мМ 2-меркапоэтанол, 0,1% Тритон Х-100. Реакцию проводили в 20 мкл: 1 нг геномной ДНК, 2,5 мМ MgCl2, 0,2 мМ dNTP, по 0,1 мкМ каждого праймера, 1х буфер, 1 е.а. Taq рої. Реакцию проводили на амплификаторе БИС-111 по следующей программе: 95 С 2 мин. 95 С ІминЛ 54 С 1 мин. 25 циклов 72 С 2 мин. 72 С 2 мин. тусМег+ - ген, кодирующий полноразмерный белок мерлин; тусМег1 169 — кодирует N-концевой участок белка, содержащий аминокислотные остатки с 1 по 169; тусМег1 379 — кодирует N-концевой участок белка, содержащий аминокислотные остатки с 1 по 379; mycMer345 635 — кодирует С-концевой участок белка, содержащий аминокислотные остатки с 345 по 635; mycMer3 - кодирует белок, в котором метионин в положении 177 заменен на изолейцин; mycMer 88 - кодирует белок, в котором удален район «Blue Box».
Реакционную смесь, полученную после проведения ПЦР, смешивали с 1/10V раствора для нанесения (50% глицерин, 0,2% бромфеноловый синий) и проводили электрофорез в 1,5% агарозном геле, используя IxTAE буфер (Трис-ацетатный буфер, 1х рН = 7.6: Tris-acetate 40mM, EDTA ImM), при напряженности поля 2,5 в/см в течение 30 минут. Затем гель инкубировали в растворе 0,0006% бромистого этидия в течение 2 минут и промывали дистиллированной водой 5 минут. Результат электрофореза смотрела под УФ-излучением на трансиллюминаторе. Вырезали фрагмент геля, содержащий нужный ПЦР-продукт. Выделение фрагмента из геля проводили, используя набор QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Германия) по прилагаемой фирмой-производителем методике.
Полученную в ПЦР и очищенную ДНК подвергали гидролизу эндонуклеазами рестрикции Sacll и Xbal. Для этого к 20 мкл раствора, содержащего полученную ДНК (получение и очистка фрагментов ДНК описаны в пунктах 3.3 и 3.4), добавляли 1 мкл (15 единиц) рестриктазы, 3 мкл 10-кратного буфера («В» для Sac II, «О» для ХЬа I) и 6 мкл дистиллированной воды. Реакцию проводили 2 часа при 37С.
Реакционную смесь, полученную после проведения гидролиза эндонуклеазами рестрикции, прогревали 10 минут при 70С, смешивали с 1/10V раствора для нанесения. Препаративный электрофорез проводили в 1,0% агарозном геле в течение 40 минут, как описывалось ранее, и вырезали участок геля, содержащий нужный фрагмент. Выделение ДНК проводили при помощи набора QIAquick Gel Extraction kit (QUAGEN, Германия) по прилагаемой фирмой-производителем методике. Гидролиз ДІЖ pBluSKP и pUASp эндонуклеазами рестрикции Sacll и Xbal проводили аналогично описанному ранее.
Электронномикроскопические исследования семенников
Иммуноцитохимический анализ выявил, что мерлин локализуется только на небенкерне на стадии «луковицы» в сперматогенезе D. melanogaster. Для более детального изучения динамики изменения небенкерна в процессе созревания сперматид были проведены электронномикроскопические исследования двух электронноплотных митохондриальных тел, или паракристаллиновых тел, в процессе элонгации сперматид. Для исследования были сделаны тонкие срезы семенников, выделенных из самцов FM6 (контроль), а также из самцов Мег3 и Мег4. На поздних стадиях элонгации каждая сперматида в контрольной цисте содержит одно большое и одно малое митохондриальное тело, связанные с одной аксонемой (Рис. 15-А). Внутри каждой субъединицы митохондриального тела находится одно паракристаллиновое тело (Fabrizio et al., 1998). Однако, было обнаружено, что некоторые сперматиды в цистах Мег содержат по два паракристаллиновых тела в большом митохондриальном теле (Рис. 15-Б), в некоторых сперматидах имелось также по две аксонемы. Подобные нарушения были обнаружены также и в цистах Мег4 (Рис. 15-В).
Сперматиды в цистах Мег расположены свободно друг от друга (Рис. 15-Д), а в цистах Мег4 они к тому же очень сильно дезорганизованы (Рис. 15-Е), в то время как в контроле FM6, соседние сперматиды в пределах одной цисты плотно контактируют между собой (Рис. 15-Г).
В конце стадии индивидуализации в зрелых сперматидах в нормальных цистах существенно редуцировано количество цитоплазмы и значительно редуцируются в размере малые производные митохондрий (Lindsley, Tokuyasu, 1978; Fuller, 1993; Fabrizio et al., 1998). Паракристаллиновый материал виден как темное пятно внутри большой митохондриальной производной (Рис. 15-Ж).
Каждая из 64 сперматид в процессе индивидуализации в контрольных цистах содержит высокоупорядоченную пару аксонема-небенкерн, в цистах Мег3 наблюдается сильное нарушение этой строгой организации (Рис. 15-3). Хотя в некоторых сперматидах содержится нормальная пара аксонема-небенкерн, в других эта структура выглядят как структуры, связанные вместе, или взаимодействующие через тонкую цитоплазматическую нить. Серьезные нарушения также были обнаружены в цистах Мег4 (Рис. 15-И), но принципиальных отличий от нарушений в цистах Мег3 не наблюдалось. Вопреки всем этим изменениям, структура микротрубочек 9+2 в аксонеме (Альберте, 1987; Бурнашева, 1982) сохраняется в цистах мутантов по гену Merlin (вставка на рисунке 15-И), свидетельствуя о том, что мерлин не требуется для формирования аксонемы.
Мутации в гене Merlin приводят к неправильному формированию митохондриальных агломератов в сперматогенезе. Это подтверждает, как иммуноцитохимическое окрашивание, так и электронномикроскопические исследования. Связь мер лина с небенкерном дает основание полагать, что мерлин может играть роль в формировании митохондриальной структуры и в ее функционировании в течение различных стадий сперматогенеза.
Для изучения функциональных доменов белка мерлин были созданы различные усеченные копии кДНК гена Merlin (LaJeunesse et al., 1998).
Разные аллели гена Merlin (см. раздел 3.2) мы клонировали в вектор pUASp. К генам, кодирующим разные мутантные формы белка мерлин, добавлена последовательность, кодирующая myc-эпитоп. Это сделано для того, чтобы при цитологическом анализе эктопической экспрессии конструкций в соматической и генеративной тканях ее легко можно было бы детектировать.
Для каждой конструкции было получено несколько (не менее 4) независимых трансгенных линий мух. С помощью генетического картирования были определены хромосомы, в которые произошла инсерция конструкций, кодирующих разные аллели гена Merlin. Все полученные линии были проанализированы на способность экспрессировать мутантные формы белка в соматической и генеративной тканях (в крыловом имагинальном диске под действием специфичного для этой ткани драйвера 1096-GAL4 и в клетках зародышевого пути в семенниках под действием драйвера nanos-GAL4). Также все конструкции были проанализированы на способность восстанавливать жизнеспособность летальной мутации Мег4 под действием драйверов с повсеместной экспрессией da-GALA и Actin-GALA. Все линии мух, полученные для отдельно взятой конструкции, одинаково проявляли себя в способности восстанавливать фенотип летальной мутации Мег4. Уровень нарушений, вызываемых определенной конструкцией при эктопической экспрессии под действием всех использованных в работе драйверов, в разных независимых линиях был одинаковый. Мы полагаем, что все линии, полученные для каждой конкретной конструкции, бвли равнозначны. Поэтому для более детального исследования было взято по одной линии мух для каждой конструкции.
Линии, использованные в этой работе, содержали встроенные трансгены в следующих хромосомах: конструкция pUASp-mycMer1 169 встроена в первую хромосому D. melanogaster, pUASp-mycMer1 379 во вторую хромосому, pUASp-mycMer345 635 в третью, pUASp-mycMer3 во вторую, pUASp-mycMerMB во вторую, pUASp-mycMer+ в третью хромосому.
