Содержание к диссертации
Введение
Литературный обзор 7
1. Мобильные диспергированные гены или сор/а подобные элементы 9
1) Локализация мдг в хромосомах II
2) Молекулярно-генетическая организация МДГ 12
2. Семейство FB (fold-back , или "шпилечных" последовательностей) 18
3. Вставки в рибосомные гены 20
4. Семейство"беспорядочно собранных" ( scrambled) последовательностей 22
5. Мобильные генетические элементы и нестабильность генных локусов 25
Материмы и методы 36
Результаты 41
Глава 1. Закономерности распределения мдг-1 и МДГ-3 в политенных хромосомах разных линий 41
1) Распределение мдг-І в хромосомах линий 42
2) Распределение мдг-3 в хромосомах линий 56
Глава 2. Анализ распределения мдг в родственных линиях НА, НА+ и ВА, полученных после длительной селекции и инбридинга и различающихся по уровню конкурентоспособности 60
Глава 3. Обнаружение транспозиций мдг, коррелирующих с увеличением индекса конкурентоспособности 72
Глава 4. Стабильность локализации мдг и их транспозиции, наблюдаемые в скрещиваниях
Обсуждение
Выводы 126
Литература
- Мобильные диспергированные гены или сор/а подобные элементы
- Молекулярно-генетическая организация МДГ
- Распределение мдг-І в хромосомах линий
- Обнаружение транспозиций мдг, коррелирующих с увеличением индекса конкурентоспособности
Введение к работе
Впервые нестабильные генетические элементы у эукариот были открыты с помощью генетического анализа на кукурузе /86,87/. Мак Клинток, исследуя возникновение пигментных пятен на кукурузе, пришла к выводу о существовании "контролирующих элементов", ответственных за наблюдаемые изменения генетической экспрессии. Оказалось, что контролирующие элементы способны к перемещению в геноме, вызывая структурные изменения хромосом и индуцируя мутантний фенотип.
Аналогичное явление было обнаружено позже у дрозофилы /58/ в случае мутации Wc Эта мутация с высокой частотой ревертировала к нормальному фенотипу и вызывала хромосомные абберации. Грин предположил, что мутация Wc возникла в результате встраивания чужеродных последовательностей ДЖ в ген whcte, # Таким образом, существование в геноме эукариотичес-ких организмов генетических элементов, способных к изменению своего местоположения в хромосомах, предполагалось уже давно. Однако, выделить их и изучить их свойства стало возможно только благодаря развитию методов генной инженерии.
Впервые мобильные генетические элементы были выделены из генома І>, ітіеміо0сиС&* в составе рекомбинантных клонов в Лаборатории Хогнесса в США /76/ и Георгиева в СССР /11,53/ по их способности связывать значительную часть клеточной РНК. Оказалось, что эти элементы обладают свойствами, отличающими
-8-их от всех ранее известных генов* Во-первых, они представлены
большим количеством копий на геном и при гибридизации ЇМ Situ. дают до нескольких десятков сайтов гибридизации, то есть являются множественными рассеянными по хромосомам генами. Во-вто-рых, Е.В.Ананьев показал, что члены одного семейства генетических элементов в разных лабораторных линиях располагаются в различных местах хромосом. Это была первая работа, указывающая на существование в геноме &. melxinOGcuteir множественных генетических элементов с варьирующей локализацией /24,53/. Отсюда возникло предположение, что выделенные генетические элементы являются мобильными. В дальнейшем они получили название мобильных диспергированных генов (мдг), или copia подобных элементов. Данные по гибридизации in sit-U. затем были подтверждены результатами рестрикционного анализа, с помощью которого было показано, что мдг могут находиться в соседстве с различными последовательностями хромосомной ЩК /45,62/.
В настоящее время у ). mefanooastzr выявлен целый ряд мобильных элементов разных типов /21,109/. Часто они обнаруживаются при детальном молекулярно-биологическом анализе выбранных фрагментов генома. Признак, на основании которого делают заключение о том, что данный фрагмент ЩК представляет собой мобильный элемент, это наличие коротких прямых повторов по его краям, которые образовались в процессе инсерции мобильного элемента и представляет собой дупликацию последовательности ДНК-мишени. Такая дупликация, например, возникает при внедрении бактериального транспозона /30/. Кроме того, как уже отмечалось, варьирующая локализация в хромосомах разных линий ). melaftOgoute*' также указывает на мобильность того или иного семейства последовательностей.
-9-На основании ряда структурных особенностей мобильных
генетических элементов можно разделить их на следующие типы: I) мдг - характеризуются наличием длинных прямых концевых повторов ; 2) FB - наличием длинных обращенных повторов с характерной структурой; 3) вставки в рибосомные гены - не содержат вышеперечисленных элементов ; 4) последовательности типа TLetbcL - содержат обращенные повторы небольшого размера; Ъ) „Sd'utiviucL - кластеры повторов, содержащие мобильные элементы; 6) Р-э лемент - заслуживающий специального рассмотрения в связи с особыми функциональными свойствами этого элемента (табл. I). Теперь рассмотрим более подробно, что известно о каждом классе мобильных генетических элементов.
I. Мобильные диспергированные гены, или сор^а подобные
элементы
Мобильные диспергированные гены можно отнести к наиболее изученному классу мобильных генетических элементов. Сейчас уже выделен целый ряд различных семейств мдг, по-видимому, составляющих существенную часть среднеповторяющихся последовательностей в геноме ). ivteianoQastw. Следует отметить, что все копии одного семейства достаточно сходны по размеру и по первичной нуклеотидной последовательности. С самого начала исследования мдг проводились в основном в двух направлениях: I) анализ локализации в хромосомах; 2) изучение молекулярно-генетической организации.
Таблица I. Молекулярная характеристика разных типов мобильных генетических элементов.
-II-
Локализация мдг в хромосомах
В этом разделе будут приведены только некоторые основные данные, касающиеся цитогенетической характеристики мдг. Вопросы, связанные с особенностями локализации мдг в хромосомах ). теЕапойсиШ" будут рассмотрены в разделе "обсуждение". Как уже говорилось, с помощью метода гибридизации ш М tu. . было обнаружено, что мобильные диспергированные гены могут располагаться в различных местах хромосом /53,62,45/. Число сайтов локализации каждого семейства мдг приблизительно соответствует числу его копий на геном (определяемых с помощью метода гибридизации по Саузерну /119/. Таким образом, в одном сайте находится, вероятнее всего, одна копия мдг. Данные по гибридизации їм jittL говорят также против модели тандемной организации, так как уникальные фрагменты ДНК, окружающие мдг, гибридизуют-ся с той же эффективностью с данным районом политенных хромосом, что и сам мдг /3/.
Высокая степень различий между разными линиями дрозофилы, требовала выяснения вопроса о том, в какой степени локализация мдг стабильна в клетках одного и того же организма. Анализ сайтов гибридизации в клетках одной слюнной железы показал, что между ними нет различий ни по числу, ни по местоположению мдг /24/. Число сайтов локализации и их местоположение в хромосомах разных тканей также оказалось идентичным /25/. На основании этих наблюдений Е.В.Ананьев предположил, что в процессе онтогенеза местоположение мдг в хромосомах не изменяется.
Мобильные диспергированные гены характеризуются высокой видоспецифичностью. Так, мдг, выделенные из ^.rnelcuboocbster'
-ia-
не удается обнаружить в геноме Ь. vLrilis , >. feuuSris
и Ь. Wbboroutlb /3, 10/. С другой стороны, мдг, выделенные
из ДНК В. vLrLLLb не имеют сайтов гибридизации в хромо-
сомах QmelCLhOCCutt*' /41/. В противоположность этому, ДНК,
соответствующая уникальным генам & rneianoaeu.'te*', гибриди-
зуется с хромосомами & virlllt, . Таким образом, уникаль-
ные гены более консервативны в эволюции, чем мдг /128/. Многие мобильные диспергированные гены (copta, мдг-1 и другие) показывают гибридизацию с политенными хромосомами близкородственного вида fi. sLmu&cuis /3,37,137/, Однако число копий мдг в геноме #. slmuUtfbS уменьшено примерно в три раза. Эта особенность локализации мдг выявлена более чем для десятка различных семейств мдг.
Молекулярно-генетическая организация мдг
Основные свойства нескольких наиболее хорошо изученных семейств мобильных диспергированных генов отражены в таблице 2. Мдг представлены большим числом копий на геном от 5 у мдг-4 и до 120 у семейства BI04 /112/. Интересно, что количество копий на гаплоидный геном резко возрастает в культуре клеток, в результате их транспозиций в новые районы хромосом /98/. Мдг представляют собой длинные (по 5-7 тыс. п.н.) последовательности ДНК. Характерной чертой строения мдг является присутствие на их концах прямых повторяющихся последовательностей длиной от 266 до 500 пар оснований (табл. 2) /19,26,45,74,134/. Важно отметить, что в отличие от Туї элементов у дрожжей /31/, длинные концевые повторы не обнаруживаются отдельно от центрального района, или "тела" мдг. Прямые концевые повторы содержат в своем составе два (copa,2>w4I2, мдг-1) или один (мдг-3) не-
Таблица 2. Молекулярная характеристика .разных семейств мобильных диспергированных генов.
-14-совершенных инвертированных повтора. Почти все исследованные мдг начинаются с последовательности ТСТ и оканчиваются последовательностью ТСА.
Данных относительно того, что представляет собой "тело" мдг, пока практически нет. Можно назвать только одну работу, в которой был проведен анализ последовательностей небольшого района в составе элемента copta (примерно в средней части "тела"). Был выявлен район со сложной структурой, представляющий собой повтор из трех родственных, но отличающихся по последовательности субфрагментов. Размер каждого субфрагмента приблизительно равен 35-37 нуклеотидам. Субфрагменты повторены три раза и расположены в следующем порядке: АВСА7 В7С А В С. функция таких последовательностей неясна. Предполагается, что они содержат сигналы полиаденилирования, а также сигнальные последовательности для процессинга и терминации транскрипции /51/.
Большинство данных, полученных к настоящему моменту, свидетельствуют о том, что варьирующая локализация мдг в геноме дрозофилы возникла в результате их транспозиции. Как уже говорилось, признак на основании которого делают заключение о том, что данный фрагмент представляет собой мобильный элемент - наличие коротких прямых повторов по его краям, которые образовались в процессе инсерции мобильного элемента и представляют собой дупликацию последовательности ДНК-мишени. Оказалось, что у всех изученных мдг к обеим сторонам несовершенных инвертированных повторов примыкают по два коротких прямых повтора. Размер дуплицированного участка может варьировать в зависимости от семейства мдг (см. таблицу 2). В случае copia и #^412 происхождение коротких концевых повторов
-15-за счет дупликации хозяйской последовательности строго доказано /38,77/.
Механизм транспозиции мдг пока остается неясным. Очевидно, что решающая роль принадлежит областям гомологии, расположенным на концах мдг. В клетках &. meianoocwte^ обнаружены кольцевые дак, гомологичные элементу copta. Это дает основание предполагать, что одним из возможных способов перемещения мдг может быть образование кольцевых экстрахромосомных копий мдг /49,50/. Способ образования таких кольцевых молекул неизвестен. Возможно, образование кольцевых молекул может осуществляться с помощью обратной транскрипции: FHK транскрибируется с мдг по аналогии ретровирусов. В пользу такой возможности говорит тот факт, что в составе мдг (как и в составе ретровирусов) есть последовательности, комплементарные участкам генома тНіК /13,19/.
Известно, что тРНК служит затравкой при обратной транс
крипции ретровирусной РНК. Однако, не исключено, что образова
ние колец происходит за счет вырезания ДНК из хромосомы или
за счет локальной экстрарепликации. Образование кольцевых мо
лекул, содержащих мдг, по-видимому, является редким событием.
В клетках, культивируемых ui vitho t обнаруживается в
среднем одна кольцевая молекула, содержащая сор/а, на 50 клеток /49/. С целью изучения функций мдг важно было исследовать их транскрипцию и трансляцию. Установлено, что мобильные диспергированные гены транскрибируются полностью, включая концевые повторы. Таким образом, каждый элемент представляет собой одну единицу транскрипции. Последовательность Хогнесса-Гольд-берга (TATA последовательность) находится в зоне первого концевого повтора, заканчивается транскрипция в зоне второго пря-
мого концевого повтора, в котором находится сайт терминации /45,14,22/.
Оказалось, что FHK считывается с обеих цепей ДНК мдг (симметричная транскрипция). Однако, одна нить транскрибируется примерно в 20 раз менее эффективно, чем вторая /22,54/. За счет симметричного характера транскрипции в ввделенных препаратах поли (А)+ FHK, выявляются двуспиральные молекулы. Поэтому, в лаборатории Г.П.Георгиева было предложено использовать гибридизацию клонированных фрагментов с дс РНК (дву-спиральной РНК) как диагностический тест для выявления мдг.
Главным продуктом синтеза является полный транскрипт мдг. Наряду с этим транскриптом в цитоплазме обнаружена минорная фракция поли Ш+РНК. В случае мдг-1 и мдг-3 /13,14/ такая FHK содержит длинные 3* и короткие 5* концевые части первичного транскрипта. Таким образом, РНК, транскрибируясь с мдг-1 и мдг-3, по-видимому, подвергается сплайсингу с вырезанием центрального участка этой РНК. Длинные и короткие транскрипты были обнаружены также для сор/а /32,113,137/, Dm4I2 /45,137/ и BI04 /112/. Например, в случае сорга обнаружены 4 РНК разных размеров, гомологичные различным участкам copta. В данном случае разные транскрипты возникли, вероятно, в результате процессинга.
По-видимому, транскрипция мдг происходит на поздних стадиях эмбриогенеза. Так, РНК, гомологичная сор* а элементу, наиболее полно экстрагируется на стадии развития личинки /43,106/. Хотя транскрипты с мдг-1 могут составлять до 10% от цитоплазматической поли (А+) РНК, в полисомах обнаруживается лишь незначительная их фракция, и мдг преимущественно локализованы во фракции свободных РНП частиц неизвестной природы /12,42,45,63,137/. Более того, оказалось, что значительная
-17-часть РНК (около 10%), гомологичная D.mAlZ и copia находится
в ядре и не переходит в цитоплазму /43,137/. До сих пор оста-ется неизвестным, происходит ли трансляция МДГ 1Л VLVO Пока трансляция РНК in vitro показана только для элемента сор1а /42,48/, Были обнаружены три новообразованных пептида размером от 5000 до 18000 аминокислот. В этом случае активно транслируется малая РНК длиной 2 тыс.п.н.
Суммируя данные, полученные в результате детального изучения биохимической структуры и цитологической локализации мдг в хромосомах D.теМло^саъе^ % можно заключить, что для мобильных диспергированных генов характерны следующие основные свойства: I) мдг представлены сравнительно большим числом копий на геном (от 5 до 100) ; 2) они могут быть локализованы в различных местах хромосом. В каждом районе, по-видимому, находится одна копия мдг; 3) расположение мдг отличается в различных линиях D. тьитодалЫг' и в меньшей степени у особей из одной линии; 4) мдг активно транскрибируются и каждое семейство связывает от 0,3 до 3% клеточной поли (А+)РНК; 5) мдг амплифицируются в культуре клеток; 6) для мдг характерна симметричная транскрипция; 7) одно из важных свойств мдг, отличающее их от других мобильных генетических элементов, состоит в том, что члены одного семейства мдг практически идентичны ; 8) мобильные диспергированные гены характеризуются общей структурой: они состоят из центрального района (длиной от 5 до 7 тыс.п.н.), который ограничен прямыми повторами от 300 до 500 п.н. По краям длинных прямых повторов расположены короткие несовершенные инвертированные повторы. Вся структура окружена в геноме прямыми повторами от 4 до 5 н.п., которые возникают за счет дупликации хозяйской ДНК в процессе
-18-встраивания мдг.
В последнее время многие исследователи склонны предполагать, что мдг подобны ретровирусам, интегрированным в геном дрозофилы /47/. На это указывает большое сходство, -которое имеется между мдг-элементами и эндогенными проретровирусами мыши /6/. Приведу основные черты сходства этих генетических элементов: I) большое число копий на геном; 2) активная транскрипция ; 3) множественная локализация ; 4) вариабельность локализации в различных линиях ; 5) симметричная транскрипция ; 6) существование двух типов FHK (процессинг) ; 7) прямые длинные и короткие инвертированные повторы необходимые для интеграции; 8) транскрипция FHK начинается и оканчивается в концевых прямых повторах и охватывает весь интегрированный геном. Усиливают это предположение данные о том, что в составе вирусоподобных частиц в клетках дрозофилы были обнаружены последовательности, гомологичные элементу copia /114/.
Теперь коротко будут рассмотрены другие мобильные генетические элементы, обнаруженные в геноме D. yneEu/iooaAter.
Семейство FB ( фоШ--6сс(Ж> или "шпилечных") последо вательностей
Ко второму классу мобильных генетических элементов генома D. mexino^owtf можно отнести так называемые FB-последо-вательности. Поттером с соавторами /99/ была выделена фракция палиндромных последовательностей ДіК, которую они использовали для обнаружения клонов, несущих комплементарные им последовательности JPK. Этим способом из библиотеки рекомбинантных клонов был отобран один ( р Dm Ffbl ), у которого при исследова-
-19-нии под электронным микроскопом были обнаружены палиндромные
последовательности ДНК. С помощью FBI было выделено еще 9 членов этого семейства. Методом гибридизации ия Situ. было показано, что местоположение FB последовательностей отличается у разных линий D. melanogcuter.
Для каждого из 9 клонов были построены подробные реет-риктные карты. Оказалось, что концы выделенных фрагментов ДНК ограничены инвертированными повторами длиной до 1,6 тыс. п.н.
Следует отметить, что в отличие от мдг, члены одного FB-семейства имеют гомологичные инвертированные повторы, но разные по длине и нуклеотидной последовательности центральные районы или "петли" /99,129/. Структура концевых последовательностей оказалась достаточно сложной. В начале инвертированного повтора (показано для FB4) находятся несовершенные прямые повторы длиной в 10 н.п., которые разделены между собой другими последовательностями ДНК нерегулярной структуры. Начиная с 220 нуклеотида, следует участок, состоящий из повторяющихся последовательностей в 20 н.п., которые перемежаются с более короткими АТ-богатыми последовательностями ДНК. В состав повтора в 20 н.п. входит предыдущий повтор в 10 н.п. С пятисотого нуклеотида продолжаются прямые тандемные 31-нуклеотидные повторы, они включают в себя повторяющиеся последовательности длиной в 20 нуклеотидных пар. Найдено 5 типов 31 нуклертидных последовательностей, которые периодически повторяясь, образуют единицу в 155 нуклеотидов, выделяемую при рестрикции Тоді. Таким образом, инвертированный повтор в составе FB элемента представляет собой сложную структуру (повтор внутри повтора). Его наличие в составе FB элементов авторы этой работы связывают с особенностями транспозиции этих элементов.
Как и в случае бактериальных транспозонов, а также мдг
-20-элементов, при встраивании РВ последовательностей появляется
дупликация в сайте-мишени, длиной в 9 н.п. /100/. Возможно, что механизм переноса FB элемента сходен с бактериальным.
По-видимому, FB элементы могут транскрибироваться (хотя прямых данных, свидетельствующих о транскрипции FB элементов, получено не было), так как в их составе обнаружены "последовательности Хогнееса" и сигналы полиаденилирования /49/,
Вставки в рибосомные гены
Образование дупликаций в сайте-мишени является одним из признаков перемещающихся последовательностей ДЩ, Именно благодаря этому свойству, инсерционные последовательности, обнаруженные в рибосомных генах /). т&й,гюооиЫг і можно отнести к классу мобильных генетических элементов /55,133/, Эти элементы представляют собой родственные последовательности ДНК, дивергировавшие в процессе эволюции, так как копии, принадле-жещие к одному семейству, различаются как по размеру, так и последовательности оснований.
Различают два типа инсерционных последовательностей или вставок /35,135/. Вставки первого типа найдены у 60$ 28д* FHK генов в Х-хромосоме и не обнаружены в рибосомных генах У-хромосомы /96,126,130/. Они могут быть различной длины: 5 тыс.н.п., 1,0 тыс.п.н., 0,5 тыс. п.н. /131/. Вставки второго типа обнаруживаются у 1Ь% рДНК как в Х-, так и в У-хромосомах, и могут варьировать в размерах от 2,5 до 4 тыс. п.н. /18,103, 130/. По краям вставок первого типа найдены прямые короткие повторы длиной от 7 до 15 п.н,, которые, как уже говорилось, возникли в результате дупликации хозяйской ДНК. В местах лока-
-21-лизации инсерционных последовательностей второго типа дупликации хозяйской ДНК не происходит и, напротив, вставки такого размера могут вызывать делецию хозяйской ДНК длиной в 9 нукле-отидов /104/. Таким образом, возможно, что вставки, по крайней мере первого типа, появились в рибосомных генах в результате их транспозиций. Это предположение усиливают данные о том, что в хромоцентре и в одном районе 4-й хромосомы существуют последовательности, представленные большим числом копий на геном (100 копий/геном), гомологичные вставкам первого типа.
Вставки первого типа, по-видимому, препятствуют транскрипции рДНК. Это предположение согласуется с данными о том, что уровень транскрипции рДНК, содержащих вставки первого типа, очень низкий /80,66/. Вероятно рДНК, содержащие вставки второго типа, транскрибируются также с очень низкой эффективностью /81/.
Следует отметить, что последовательности в хромоцентре и в одном из районов хромосомы 4, подобные вставкам 1-ого типа, могут встречаться в виде тандемных повторов по 5 тыс.н.п., а также перемежаться с другими среднеповторяющимися последовательностями ДНК, которые были названы фланкирующими, или прерывающими последовательностями. При гибридизации In situ. прерывающие последовательности дают от нескольких до 50 сайтов гибридизации, причем их распределение в различных линиях D. УпеЖаподл&'Ы*' отличается. Таким образом, данные последовательности также можно отнести к мобильным генетическим элементам генома D. гґіеідлодал ъе^. 0 способности этих элементов к транспозиции говорит также тот факт, что на их концах обнаружены повторы длиной 13 н.п., образованные в результате дупликации хозяйской ДНК /101/. Было выделено несколько таких
-22-семейств ДОК, из которых наиболее подробно изучено семейство,
получившее название zettci. , Размер последовательностей, входящих в это семейство, равен 7,4 тыс.п.н. На концах элемента zetcv расположены короткие инвертированные последовательности длиной до 10 н.п. /36,69/. Оказалось, что два бСОЇІХ фрагмента, составляющих iLetboL. , могут распре-деляться в геноме независимо друг от друга как в составе ин-серционных последовательностей, подобных вставкам 1-ого типа, так и в ином окружении. Основное отличие последовательностей типа %еЬ&. состоит в том, что они составляют семейства, члены каждого из которых дивергировали по последовательности оснований, транскрибируются с низкой эффективностью с образованием поли(А") РНК и не содержат длинных концевых повторов.
Семейство "беспорядочно собранных" ( scuunitecL )
последо вательностей
"Беспорядочно собранные" последовательности по своим свойствам резко отличаются от других уже описанных типов мобильных генетических элементов. Эти последовательности представляют собой довольно крупные кластеры умеренных повторов от 300 до 1000 н.п. Каждый кластер длиной в несколько тыс.н.п. содержит различные семейства таких умеренных повторов. Последовательности часто повторяются внутри одного кластера, причем иногда в обратной ориентации. Повторы из одного кластера встречаются примерно в тысячи хромосомных районов как в гетерохроматине, так и в хромосомных плечах. В связи с этими особенностями их локализации было выдвинуто предположение, что повторы такого типа могут перемещаться в геноме за счет рекомбинации по гомо-
-23-логичным последовательностям. При подробном изучении четырех
кластеров в их составе было обнаружено 17 различных семейств повторяющихся последовательностей. Таким образом, по приблизительной оценке, четверть умеренно повторяющихся последовательностей может быть организована в подобные кластеры /132/. Последовательности, обнаруженные Венсинком, по-видимому, могут входить в состав других мобильных генетических элементов. Например, обнаружена гомология между одним из кластеров повторов и copta подобным элементом Dm 412.
Р-элементы
К мобильным генетическим элементам генома D./nelosio-Qcwber можно отнести Р-элемент, интерес к которому в последнее время очень возрос. В этом разделе будут кратко рассмотрены некоторые его свойства. Р-элемент был выделен Рубиным с соавторами /108/ в составе локуса whiZL . Р-элемент может быть различной длины. Основным элементом является последовательность длиной в 3 тыс.н.п., из которой в результате простой делеции центрального участка могут возникать малые Р-элементы от 0,5 до 1,6 тыс. н.п. В то же время, концы всех элементов гомологичны - это инвертированные повторы, содержащие 31 ну-клеотид /92/. Предполагается, что инвертированные повторы являются сайтами узнавания транспозаз. Как и для других типов мобильных элементов, для Р-элемента характерна множественная варьирующая локализация. Биологическая роль Р-элементов будет рассмотрена позднее.
Подробный сравнительный анализ структуры различных семейств мобильных генетических элементов у D. fweiamo&cutet-
-24-к настоящему времени проводить еще преждевременно. Если структура мдг изучена достаточно подробно, то данные по структуре других семейств мобильных генетических элементов являются далеко не полными. Тем не менее, определенное сходство в структуре различных типов мобильных элементов можно выявить (табл. I). Почти для всех мобильных генетических элементов характерно наличие центрального района, окруженного с обеих сторон повторяющимися последовательностями различной длины, которые, вероятно, непосредственно вовлечены в процесс транспозиции.
Для сора подобных элементов показана интенсивная транскрипция. В случае FB и Р-элементов обнаружены "открытые рамки считывания". Поэтому можно говорить об экспрессии генов, заключенных внутри ряда мобильных элементов. Предполагается, что они могут кодировать транспозазы. Вероятно, разные мобильные элементы, различающиеся по строению концевых повторов и центрального района, характеризуются разными механизмами транспозиции. Отметим также, что для каждого семейства мобильных эле-, ментов характерна разная степень полиморфизма по молекулярной структуре: высокая - для FB и Р-элементов и сравнительно небольшая для мдг подобных элементов. Хотя сейчас уже много известно о молекулярной структуре мобильных элементов, вопрос об их функциональной роли остается еще далеко невыясненным. Отметим, что основная часть средиеповторяющейся фракции ДВК эука-риот, по-видимому, представлена мобильными генетическими элементами /4,83/. Существует большая литература, в которой уже много лет дискутируется вопрос о функциональной роли средних повторов. Теперь к исследованию этих вопросов можно будет вернуться с новых позиций. Сопоставление количества среднеповто-
-25-
ряющейся ДНК в геноме Drosophila. те1стода*>Ь>г< /75/
с частотой выявления мобильных генетических элементов в составе клонированных сегментов ДНК /136/ позволяет заключить, что и в случае D. теІйлОйаяЬе*' подавляющая часть умеренных повторов может быть представлена мобильными элементами.
Мобильные генетические элементы и нестабильность
генных локусов
Накопленные к настоящему времени данные дают основание считать, что мобильные элементы могут принимать непосредственное участие в мутационном процессе и отвечать за нестабильность структурных генов. У дрозофилы, так же как и у других организмов, описаны мутации по некоторым генам у, W, *}-, с-/59,60,102/, которые проявляют высокую нестабильность: как частота их возникновения, так и реверсия к норме может значительно превышать в 10-100 раз частоту спонтанного мутирования. Например, в случае гена J>n частота возникновения мутаций может достигать 20-50% от числа всех особей /8/.
По аналогии с данными, ранее полученными в отношении транспозонов бактерий /30/, была выдвинута гипотеза, согласно которой нестабильные аллели разных ло кусов З.теЛаяодсц.'Ыг' возникают в результате внедрения перемещающихся элементов /57/.
Первые, достаточно косвенные, данные относительно роли мобильных элементов в генетической нестабильности, были получены для локуса wkitt. . Было показано /27/, что клонированные фрагменты ДНК, содержащие элемент сор/а, гибридизуются в политенных хромосомах с районом локуса white- , если в нем находится аллель W*- $ но не дикий аллель. В нашей совме-
-26-стной работе с Рассмусоном /102/ было обнаружено, что приобретение локусом wkitt. нестабильности может коррелировать с интеграцией мобильного элемента мдг-І в район этого локуса.
В последнее время все больше стало появляться работ,
в которых уже с помощью прямых молекулярно-биологических ме
тодов показано встраивание мобильных генетических элементов
в гены дрозофилы. Благодаря этим исследованиямк настоящему
времени уже известно, что многие мутации в локусах W, ot, зп,
&'Моґа#.р % , se. , f и т.д. /89,108,138/ вызваны встраи-
ванием мобильных генетических элементов типа мдг, FB и Р-элементов.
Зачар и Бингхам /138/ с помощью рестрикционного анализа
провели исследование 19 мутантных аллелей white- локуса
д.теЛаподосьЬе*' . Оказалось, что из 13 спонтанных мутаций в
локусе white. 7 вызваны инсерциями фрагментов чужеродной
ДБК. Природа этих инсерций подробно не была изучена. Однако, авторы предполагают, что большинство, если не все инсерций, являются перемещающимися генетическими элементами. Встроенные фрагменты ДТіК у 6 мутантов авторы предположительно относят к классу copta подобных элементов. Мутации в локусе white. , вызванные инсерциями этого типа, оказались относительно стабильными, так как реверсия к нормальному цвету глаз происходила с низкой частотой. Все 6 инсерций, судя по фенотипу, подавляют экспрессию гена white. Следует отметить, что встраивание copta-подобных элементов происходило во всех случаях в левую, по-видимому, кодирующую область локуса white. Седьмая мутация wDzL (dornincubt zwte. -іік<е-} подверглась наиболее тщательному изучению. Было установлено, что мутация вызвана встраиванием фрагмента ДНК длиной 13-14 тыс.н.п.
-27-
в пограничный район локуса wkluL в правой его части.
Этот аллель был обнаружен как спонтанная мутация в линии Oregon fid /77/. Мутация частично репрессирует функцию локуса как в цис-, так и в транс-положении. Предполагается, что фрагмент ДНК встроен в регуляторную зону локуса white- . Было установлено, что реверсия к дикому типу глаз происходит за счет неточного вырезания инсерции. Оставшийся фрагмент продолжает во многих случаях вызывать с высокой частотой дальнейшие мутации в локусе wh/te. . Центральный район инсерции вероятно не влияет на нестабильность аллеля wkitl. , так как ре-вертанты, в которых этот район полностью делетирован, продолжают оставаться нестабильными.
Мутация \^/criynson. (малиновый цвет глаз) была
первой, генетические свойства которой позволили предположить
встраивание перемещающегося элемента /57/. Мутация wcr'U71sc>n'
была выделена как частичный фенотипический ревертант WL
( и/ wory , глаза цвета слоновой кости) аллеля /68/. Было
показано, что мутация wL возникла в результате дупликации фрагмента ДНК. Мутация Wc обусловлена встраиванием ДНК длиной 10 тыс.н.п. в район дупликации. Мутация Wc , так же
как и W DzL оказалась нестабильной и ревертировала с час-
—2 —3 тотой 10*" -10"* и с той же частотой вызывала перестройки
прилежащих последовательностей /57,27/. Отличие этих двух мутаций в локусе whlUL. состоит в том, что в случае W^ происходит точное вырезание инсерции /33/, а в случае W2L -неточное вырезание /78/. Была выяснена природа инсерционных последовательностей. Оказалось, что обе мутации возникли в результате встраивания FB-последовательностей. В случае W0" про-изошло встраивание одного FB-элемента, а в случае VV -двух FB-элементов. Центральный район между двумя FB-последова-
-28-тельностями оказался уникальным, так как в дикой линии
О. mzEasiOGastes" представлен одной копией на геном.
По предположению Левиса с соавторами /79/ точная эксцизия VVC происходит за счет рекомбинации коротких дупликаций в сайте-мишени, как это было показано ранее для бактериальных транспозонов Ти 10 и Тп 5 , также несущих на концах инвертированные повторы. В этом случае, за счет гомологичного спаривания концевых последовательностей, облегчается рекомбішация между короткими дупликациями. В случае WZL неточное вырезание может происходить за счет рекомбинации между инвертированными повторами из разных FB-элементов.
Итак, в результате рестрикционного анализа спонтанных мутаций в локусе wrUlL. было обнаружено, что примерно половина из них возникла в результате встраивания чужеродных последовательностей ДНК. Встраивание мобильных генетических элементов может происходить в функционально различающиеся районы локуса WnttjL . Инсерции чужеродных последовательностей ДТіК в большинстве исследованных случаев привели к подавлению экспрессии гена white* . Только в случае Wc (малиновые глаза), судя по фенотипу, стимулируется (по сравнению с состоянием WL ) транскрипционная активность локуса wniti* , Вопросы, связанные с изменением экспрессии генов в результате встраивания мобильных элементов, будут подробнее рассмотрены в разделе "обсуждение".
Получены интересные данные, указывающие на роль клонированных Р-элементов в нестабильности генома. Группа исследователей во главе с Рубиным показала /108/, что этот элемент может вызывать синдром гибридного дисгенеза. Гибридный дис-генез - название, данное синдрому, коррелирующему с генетическими последствиями, которые происходят в потомстве, получен-
-29-ном в результате скрещивания между определенными линиями дрозофилы. Эти последствия включают стерильность, высокую частоту рекомбинации у самцов, высокую мутабильность, хромосомные аб-берации и т.д. /70,71/. У D. Упе&алода&'Ы*' различают по крайней мере 2 системы взаимодействия линий Т- R їй. Р-И /72/. Р-М система гибридного дисгенеза проявляется, когда самцы линии Р скрещиваются с самками линии М, но не при реципрок-ном скрещивании. Энгельс выдвинул предположение о том, что причиной гибридного дисгенеза является семейство перемещающихся элементов - Р-факторов /39,40/. Согласно его гипотезе множественные копии Р-фактора разбросаны по геному Р-линии и отсутствуют в М линии. Перемещение Р-факторов подавляется в Р-цитоти-пе и не запрещается в М цитотипе, где материнская линия определяет природу цитотипа. В том случае, когда хромосомы Р-линии попадают в окружение М цитотипа происходит дерепрессия Р-факторов, в результате чего они приобретают способность к транспозициям в различные районы хромосом и тем самым вызывают мутации и другие аномалии, присущие синдрому гибридного дисгенеза /71,124,125/.
Результаты, полученные Рубины с соавторами /108/, могут служить подтверждением гипотезы, предложенной Энгельсом. На первом этапе своей работы исследователи провели анализ мутаций в локусе white. » которые возникли в результате дисгене-тических скрещиваний между Р и М линиями. С помощью рестрикци-онного анализа было установлено, что все мутации возникли в результате встраивания фрагментов ДНК различной длины. Пять из них вызваны встраиванием членов из одного семейства элементов, которые авторами этой работы были названы Р-элементами. Эти элементы оказались гомологичными между собой по последовательности нуклеотидов, но гетерогенными по размерам, варьируя по
-30-длине от 0,5 до 1,4 тыс. н.п. По-видимому, встраивание Р-элемента в район локуса white. является сайт специфичным, так как места расположения Р-элементов у трех независимых мутантов или совпадают (согласно рестриктной карте), или находятся в очень близком соседстве.
Оказалось, что мутации в whlLL локусе, вызванные встраиванием Р-элемента, являются нестабильными, и с частотой 4-6x10 могут появляться ревертанты с диким типом глаз. Во всех изученных случаях реверсия к норме сопровождалась эксци-зией Р-элемента из района локуса wniuL В пределах точности рестрикционного анализа авторы показали, что вырезание Р-элемента происходит по его границам. Выяснилось также, что нестабильность мутаций, вызванных внедрением Р-элемента, строго зависит от цитоплазматического окружения. Реверсия к норме происходила у особей с цитотипом М, и те же самые мутации оказались стабильными в окружении Р цитотипа.
Две инсерции в локусе white , возникшие в результате дисгенетических скрещиваний Р и М линий, при гибридизации по Саузерну показали гомологию с элементом сор/а. Мутации, вызванные сорія, были стабильными как в окружении Р, так и М цитотипа. Эти данные свидетельствуют о том, что в процессе дисгенетических скрещиваний резко возрастает скорость транспозиций Р-элемента, а также индуцируется перемещение и других мобильных элементов генома.
На основании этой работы авторы предположили, что Р-элементы являются теми факторами, которые, согласно гипотезе Энгельса, могут вызывать синдром гибридного дисгенеза. Усиливают это предположение и другие данные, полученные этой же группой исследователей /28/. Во-первых, в соответствии с гипо-
-31-тезой Р-фактора, Р-элементы оказались локализованы примерно в
30 районах в различных Р линиях и отсутствовали в М линиях. Во-вторых, было показано, что Р-элементы с высокой частотой перемещаются в Р-М дисгенетических гибридах. По приблизительной оценке транспозиции Р-элементов происходят с частотой 4 копии за одну генерацию. Кроме того, Х-хромосомы, которые приобрели Р-элементы, способны индуцировать стерильность в М цитотипе /73/. Интересно, что способность индуцировать стерильность зависит от количества приобретенных копий Р элемента. Наконец, оказалось, что хромосомы из Р-линии (но не из М линии) с большой частотой в дисгенетических скрещиваниях подвергаются перестройке, причем точки разрыва являются сайтами локализации Р-элементов. Таким образом, на основании этих работ, был сделан вывод о том, что все аномалии гибридного дисгенеза могут быть объяснены поведением Р-элементов в дисгенетических скрещиваниях.
Способность Р-элементов к самостоятельной транспозиции
была блестяще продемонстрирована Рубиным и Спрадлингом /107/.
Исследователи вводили с помощью микроинъекции в линию М (она
была маркирована рецессивным геном Sn w ) в составе плазмиды
pBR 322 фрагмент ДНК, который включал в себя Р-элемент длиной
3 тыс.п.н. Оказалось, что в потомстве от скрещивания такой ли
нии с самцами М линии или с самками со сцепленными XX хромосо
мами с высокой частотой (до 48$) могут появляться особи с фе
нотипом Sh ** v'e^n^ и sn* . Дальнейшие эксперименты пока
зали, что эти изменения в мутабильности вызваны встраиванием
Р-элемента в.район локуса Sn . Таким образом, впервые для
эукариотических организмов, продемонстрирована способность к
перемещению ДНК из плазмид в хромосому хозяина /107/.
В другой серии экспериментов авторы показали (на примере гена rosy. ) /121/, что Р-элемент может служить в качестве вектора для включения структурных генов в хромосомную ДЦК. Следует отметить, что для успешной трансформации оказалось необходимым присутствие интактного Р-элемента длиной 3 тыс.п.н. Эти данные указывают на то, что Р-элементы могут служить переносчиками различных последовательностей ДНК в геноме D. теІалодси'Ье*'.
Результаты, полученные в этих модельных экспериментах, свидетельствуют в пользу того, что Р-элемент длиной 3 тыс.п.н. способен к самостоятельной транспозиции, и, вероятно, кодирует собственную транспозазу, которая обеспечивает перемещение как этого Р-элемента, так и Р-элементов меньших размеров. Возможно, что инвертированные повторы, обнаруженные на концах Р-элемента, являются сайтами связывания транспозазы /84/. Поскольку транспозиции Р-элементов в линии Р не происходит, то 3 тыс. п.н. Р-элемент, по-видимому, кодирует также образование белка-репрессора, функция которого подавлять действие транспозазы в линии Р.
Герасимова с соавторами исследовала целое семейство нестабильных мутаций в локусе cut , которые были получены в условиях гибридного дисгенеза /7/. Исходная мутация с
характеризовалась высокой частотой реверсий (I0*"Q), с выщеп-лением сии мутаций с новым фенотипом, в том числе деталей и сверхнестабильных d мутаций, а также появлением новых мутаций по другим локусам Х-хромосомы. С помощью гибридизации in situ. было показано, что мутации произошли в результате внедрения в район расположения локуса ctfti мдг-4. Реверсии дикого типа сопровождались эксцизией мдг-4. Таким образом, в
-33-этой работе еще раз продемонстрировано, что Р-элементы могут
быть факторами, индуцирующими транспозиции других семейств
мобильных генетических элементов, например, за счет синтеза
ферментов транспозиции. При этом положение мдг при встраивании
в районы структурных генов может быть стабильным (это показано
для элемента сор^а) или нестабильным (как в случае мдг-4).
Возможно, что перемещения мобильных элементов, которые
индуцируются в дисгенетических скрещиваниях, являются направ
ленными. В пользу этого свидетельствует, например, тот факт,
что встраивание Р-элемента в район локуса wrutz. являет-
ся сайт специфичным, а также и некоторые другие данные, кото
рые будут рассмотрены в разделе "обсуждение". Возможно, что
перемещения мобильных элементов в определенные районы хромосом
могут контролироваться с помощью генных факторов, регулирующих
их транспозиции. Об этом свидетельствуют, например, опыты,
проведенные Мезельсоном с соавторами /89/. Авторы исследовали
мутации у дрозофилы, супрессируемые супрессором Su. (ИW/
и обнаружили, что они возникли в результате инсерции мобильно
го элемента, который получил название ^^fcus^ (guzsy ана
логичен мдг-4, Ильин, личное сообщение). Была выявлена связь
gipsy с 19 супрессируемыми аллелями в 10 различных локусах.
Наиболее интересным оказался тот факт, что $Lp$*f последо-
вательности не встречаются ни в одном из этих локусов, если мутации в них не супрессируются. Поэтому супрессор Su [U*) можно рассматривать как регулятор транспозиций ^LPJtf в районы этих генетических локусов.
К настоящему моменту у дрозофилы выделено много нестабильных мутаций, затрагивающих различные локусы. Степень нестабильности локусов может быть различной. Например, в локусе yellow - уровень реверсий всего в несколько раз превышает
-34-уровень спонтанных мутаций /59/, а в случае Sh реверсии к
норме обнаруживаются у значительной доли особей. Хотя молекулярная природа упомянутых локусов неизвестна, предполагается, что мутации в них вызваны встраиванием перемещающихся элементов /8/. Возможно, уровень нестабильности возникающих мутаций зависит от типа инсерционного элемента. Например, большинство данных говорит за то /138/, что мутации, возникшие в результате инсерции сор/а подобных элементов, являются стабильными и частота их реверсий приближена к уровню спонтанных мутаций. Реверсии к нормальному фенотипу в результате эксцизии Р- и FB-элементов из районов структурных генов происходят со зна-чительно большей частотой (до 10 ), Таким образом, мобильные генетические элементы играют большую роль в нестабильности генетических локусов у В.юеЕлпода&Ьег і причем вклад каждого семейства перемещающихся последовательностей в определение уровня нестабильности может быть различным.
В ряде случаев показано, что сами нестабильные локусы могут перемещаться в различные места генома, захватывая с собой смежные гены /64,65,102/. Обнаружено совместное перемещение сорг'а элемента и нестабильного гена white /52/. FB-элементы выделены на концах большого транспозона /46,56/. Таким образом, мобильные генетические элементы могут выполнять функцию переносчиков структурных генов в новые районы хромосом.
Существуют также данные о том, что транспозиции мобильных генетических элементов могут приводить к сайт специфическим делециям и инверсиям у дрозофилы /102,115/. Таким образом, у дрозофилы, также как и у других организмов, мобильные элементы могут резко усиливать мутационные процессы и контролировать работу генов. Молекулярные механизмы, лежащие в основе этих про-
-35-цессов, предстоит еще выяснить.
Обсуждая роль мобильных элементов в дестабилизации генома и мутагенезе, мы не касались рассмотрения многих других гипотез, предполагающих их роль в эволюции и функционировании хромосом. Высказывалось предположение, что мобильные генетические элементы могут относиться к так называемой "эгоистической" ДНК, у которой нет определенных функций и она существует в хозяйской ДНК как паразит /93/. По мнению других авторов, единственной функцией мобильных генетических элементов является кодирование ферментов, обеспечивающих поддержание этих элементов в геноме и их перемещение /123/. "Эгоистическая" ДНК, согласно этим представлениям, участвует тем не менее в эволюционных преобразованиях генома.
Ананьев считает, что одной из функций мобильных элементов может быть создание структурной гетерозиготности гомологичных хромосом. Это может вести к поддержанию оптимального уровня рекомбинации, что особенно важно в районах повторяющихся генов /3/.
Дэвидсон и Бриттен высказали гипотезу, согласно которой умеренно повторяющиеся последовательности ДНК, несмотря на эффективную транскрипцию, не кодируют белки. Транскрипты с мобильных генетических элементов могут контролировать образование РНК, взаимодействуя с гетерогенной ядерной РНК и формируя тем самым гибридные РНК-РНК комплексы /34/.
В последнее время высказывается мнение, что Р элемент играет большую роль в изоляции популяций и видообразовании /29/, так как в результате дисгенетических скрещиваний появляется стерильное потомство. Вопрос о возможной биологической роли мобильных элементов у дрозофилы будет также рассмотрен в разделе "обсуждение".
-36-МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Получение цитологических препаратов для гибридизации
ио situ.
Личинок выращивали до поздней третьей стадии развития или до стадии предкуколки при I6-I8G на стандартном корме. Слюнные железы извлекали из личинок препаровальными иглами непосредственно в капле 50$ уксусной кислоты, накрывали сили-конизированным стеклом и раздавливали. Стекла замораживали в камере с жидким азотом, покровные стекла удаляли с помощью бритвы. Препараты фиксировали в нескольких сменах 96 спирта, высушивали и хранили до использования, В работе использовали препараты политенных хромосом, которые имели четкую диско-идальную структуру, видимую в фазовоконтрастный микроскоп, и были хорошо расправлены.
Гибридизация in situ.
Для гибридизации иг sitic клонированных последо-
вательностей ДНК в основном была использована методика Пардью /94,95/.
При гибридизации препараты прогревали при 70С в течение 30 минут в растворе А$С f промывали в двух сменах 70 и в двух сменах 96 спирта, высушивали. После этого препараты обрабатывали раствором РНК-азы в й> SSC в течение 30 минут при 37С, снова споласкивали в трех сменах 3>S , в двух сменах 70 и 96 спирта и высушивали. Далее препараты политенных хромосом обрабатывали 0,07Н Ига ОН в течение одной минуты, споласкивали в 70 и 96 спирте и высушивали.
-37-При гибридизации с политенными хромосомами препаратов
ДНК меченой тритием или ^3 на предметные стекла наносили 1-2 мкл раствора меченой ДНК (100000-300000 имп/мин) в b2$t , накрывали покровными стеклами и помещали во влажную камеру на 12 часов при температуре 65. Препараты отмывали от метки в четырех сменах JLJStSC при 60С (по 10 минут в каждой), споласкивали в двух сменах 70 и 96 спирта и высушивали.
Препараты покрывали авторадиографической эмульсией типа М для ядерных исследований. Сроки экспозиции радиоавтографов варьировали в широких пределах: от нескольких дней до месяца, в зависимости от количества наносимой метки и эффективности гибридизации.
Препараты проявляли амидоловым проявителем 2 минуты при 18С. Окрашивали с помощью красителя азур-эозина, высушивали и анализировали под световым микроскопом.
Статистическая обработка
Случайное распределение мдг-1 и мдг-3 по участкам поли-
тенных хромосом строили на основании формулы для вычисления
теоретических частот распределения Пуассона: А J)m -А
fim - теоретически ожидаемое число участков с уг) сайтами;
Пт - наблюдаемое в эксперименте число участков с гп сайтами ;
X - среднее число сайтов на участок. Для сравнения теоретически ожидаемого и наблюдаемого распределений сайтов мдг применяли критерий jCz \
м=о fitn
При расчетах использовали допущение о том, что техника гибридизации и? Situ, позволяет выделить в политенных хромосомах 400 участков локализации мдг. Выявляя одинаковые (общие для нескольких линий) сайты локализации мдг, учитывали, что в проведенных опытах локализовать мдг, как правило, можно только с точностью до подсекции.
Сравнение частоты встречаемости сайтов мдг-I и мдг-3 в группе лабораторных линий и в группе линий, полученных из НА, проводилось на основе 1L критерия с использованием ~f преобразо вания:
и^Ы(РК)- 1(Ро%)ПГгГ
Нулевая гипотеза о случайности наблюдаемого распределения сайтов в группе линий, полученных из НА, отвергалась на 1%-ом уровне значимости.
Достоверность отличий наблюдаемого распределения числа сайтов мдг-I и мдг-3 между хромосомами от ожидаемого при равномерном распределении оценивали по критерию Стьюдента:
где X - среднее количество сайтов, обнаруживаемое в данной хромосоме; J4 - ожидаемое среднее количество сайтов в данной хромосоме при условии равномерного распределения числа сайтов между хромосомами ; S / - квадратичная ошибка X .
Для сравнения расположения мдг и районов интеркалярно-го гетерохроматина вычисляли коэффициент корреляции Юла ґа. :
''т&ЩЯ)(а.+У(б72)'
где a. - число сайтов гибридизации, совпадающих с районами интеркалярного гетерохроматина; ё - число сайтов локализации, не совпадающих с районами интеркалярного гетерохроматина; С - число районов интеркалярного гетерохроматина, с которым мдг не гибридизуются ; oL - сайты эухроматической части генома, с которыми мдг не гибридизуются.
Локализацию мдг-1 и мдг-3 определяли в следующих лабораторных линиях
C(I)RM, у w/y ас w YS Yb У*; Dp(I;3)wVC0/+ у ас w, Dp(I;3) wvco/+ In(I) wm4, wm4/Df(Y) ЪЪ
НА,
6 2 sc ее cv ct V g f
sc z ec ct
Oregon RC
j. a gt w
sc ec cv ct V g
sc ec cv ptg/C(I)RM, у v f car wm4/YSu Var/c(I)> y w bb
br we ec rb t4/M1, y31dsc8 wa lzs В T007/Cy
GB-39
OK1
ru h th st sr es ca
ru h st pp ss es
yZ; C(2L)RM, dp; C(2R)RM, px; C(3L)RM, h; C(3R)RM
Swedish-b
При постановке генетических скрещиваний использовали линию А с генотипом: EM4f У sc dm В/+; SM1, al Су en sp / In(2LR)Pm, dp bj Pm; Sb/In(3LR) Ubx130, Ubx130 es Обозначения генетических маркеров хромосом, использованных в работе см. в каталоге (Lihdsley, Grell, Carnegie Inst. Wash. Publ., 627, 1968.
-41-РЕЗУЛЬТАТЫ
Мобильные диспергированные гены или сор/а подобные элементы
Мобильные диспергированные гены можно отнести к наиболее изученному классу мобильных генетических элементов. Сейчас уже выделен целый ряд различных семейств мдг, по-видимому, составляющих существенную часть среднеповторяющихся последовательностей в геноме ). ivteianoQastw. Следует отметить, что все копии одного семейства достаточно сходны по размеру и по первичной нуклеотидной последовательности. С самого начала исследования мдг проводились в основном в двух направлениях: I) анализ локализации в хромосомах; 2) изучение молекулярно-генетической организации.
В этом разделе будут приведены только некоторые основные данные, касающиеся цитогенетической характеристики мдг. Вопросы, связанные с особенностями локализации мдг в хромосомах ). теЕапойсиШ" будут рассмотрены в разделе "обсуждение". Как уже говорилось, с помощью метода гибридизации ш М tu. . было обнаружено, что мобильные диспергированные гены могут располагаться в различных местах хромосом /53,62,45/. Число сайтов локализации каждого семейства мдг приблизительно соответствует числу его копий на геном (определяемых с помощью метода гибридизации по Саузерну /119/. Таким образом, в одном сайте находится, вероятнее всего, одна копия мдг. Данные по гибридизации їм jittL говорят также против модели тандемной организации, так как уникальные фрагменты ДНК, окружающие мдг, гибридизуют-ся с той же эффективностью с данным районом политенных хромосом, что и сам мдг /3/.
Высокая степень различий между разными линиями дрозофилы, требовала выяснения вопроса о том, в какой степени локализация мдг стабильна в клетках одного и того же организма. Анализ сайтов гибридизации в клетках одной слюнной железы показал, что между ними нет различий ни по числу, ни по местоположению мдг /24/. Число сайтов локализации и их местоположение в хромосомах разных тканей также оказалось идентичным /25/. На основании этих наблюдений Е.В.Ананьев предположил, что в процессе онтогенеза местоположение мдг в хромосомах не изменяется.
Мобильные диспергированные гены характеризуются высокой видоспецифичностью. Так, мдг, выделенные из .rnelcuboocbster не удается обнаружить в геноме Ь. vLrilis , . feuuSris и Ь. Wbboroutlb /3, 10/. С другой стороны, мдг, выделенные из ДНК В. vLrLLLb не имеют сайтов гибридизации в хромо сомах QmelCLhOCCutt /41/. В противоположность этому, ДНК, соответствующая уникальным генам & rneianoaeu. te , гибриди зуется с хромосомами & virlllt, . Таким образом, уникаль ные гены более консервативны в эволюции, чем мдг /128/. Многие мобильные диспергированные гены (copta, мдг-1 и другие) показывают гибридизацию с политенными хромосомами близкородственного вида fi. sLmu&cuis /3,37,137/, Однако число копий мдг в геноме #. slmuUtfbS уменьшено примерно в три раза. Эта особенность локализации мдг выявлена более чем для десятка различных семейств мдг.
Молекулярно-генетическая организация мдг
Основные свойства нескольких наиболее хорошо изученных семейств мобильных диспергированных генов отражены в таблице 2. Мдг представлены большим числом копий на геном от 5 у мдг-4 и до 120 у семейства BI04 /112/. Интересно, что количество копий на гаплоидный геном резко возрастает в культуре клеток, в результате их транспозиций в новые районы хромосом /98/. Мдг представляют собой длинные (по 5-7 тыс. п.н.) последовательности ДНК. Характерной чертой строения мдг является присутствие на их концах прямых повторяющихся последовательностей длиной от 266 до 500 пар оснований (табл. 2) /19,26,45,74,134/. Важно отметить, что в отличие от Туї элементов у дрожжей /31/, длинные концевые повторы не обнаруживаются отдельно от центрального района, или "тела" мдг.
Молекулярно-генетическая организация МДГ
Данных относительно того, что представляет собой "тело" мдг, пока практически нет. Можно назвать только одну работу, в которой был проведен анализ последовательностей небольшого района в составе элемента copta (примерно в средней части "тела"). Был выявлен район со сложной структурой, представляющий собой повтор из трех родственных, но отличающихся по последовательности субфрагментов. Размер каждого субфрагмента приблизительно равен 35-37 нуклеотидам. Субфрагменты повторены три раза и расположены в следующем порядке: АВСА7 В7С А В С. функция таких последовательностей неясна. Предполагается, что они содержат сигналы полиаденилирования, а также сигнальные последовательности для процессинга и терминации транскрипции /51/.
Большинство данных, полученных к настоящему моменту, свидетельствуют о том, что варьирующая локализация мдг в геноме дрозофилы возникла в результате их транспозиции. Как уже говорилось, признак на основании которого делают заключение о том, что данный фрагмент представляет собой мобильный элемент - наличие коротких прямых повторов по его краям, которые образовались в процессе инсерции мобильного элемента и представляют собой дупликацию последовательности ДНК-мишени. Оказалось, что у всех изученных мдг к обеим сторонам несовершенных инвертированных повторов примыкают по два коротких прямых повтора. Размер дуплицированного участка может варьировать в зависимости от семейства мдг (см. таблицу 2). В случае copia и # 412 происхождение коротких концевых повторов за счет дупликации хозяйской последовательности строго доказано /38,77/.
Механизм транспозиции мдг пока остается неясным. Очевидно, что решающая роль принадлежит областям гомологии, расположенным на концах мдг. В клетках &. meianoocwte обнаружены кольцевые дак, гомологичные элементу copta. Это дает основание предполагать, что одним из возможных способов перемещения мдг может быть образование кольцевых экстрахромосомных копий мдг /49,50/. Способ образования таких кольцевых молекул неизвестен. Возможно, образование кольцевых молекул может осуществляться с помощью обратной транскрипции: FHK транскрибируется с мдг по аналогии ретровирусов. В пользу такой возможности говорит тот факт, что в составе мдг (как и в составе ретровирусов) есть последовательности, комплементарные участкам генома тНіК /13,19/.
Известно, что тРНК служит затравкой при обратной транс крипции ретровирусной РНК. Однако, не исключено, что образова ние колец происходит за счет вырезания ДНК из хромосомы или за счет локальной экстрарепликации. Образование кольцевых мо лекул, содержащих мдг, по-видимому, является редким событием.
В клетках, культивируемых ui vitho t обнаруживается в среднем одна кольцевая молекула, содержащая сор/а, на 50 клеток /49/. С целью изучения функций мдг важно было исследовать их транскрипцию и трансляцию. Установлено, что мобильные диспергированные гены транскрибируются полностью, включая концевые повторы. Таким образом, каждый элемент представляет собой одну единицу транскрипции. Последовательность Хогнесса-Гольд-берга (TATA последовательность) находится в зоне первого концевого повтора, заканчивается транскрипция в зоне второго пря мого концевого повтора, в котором находится сайт терминации /45,14,22/.
Оказалось, что FHK считывается с обеих цепей ДНК мдг (симметричная транскрипция). Однако, одна нить транскрибируется примерно в 20 раз менее эффективно, чем вторая /22,54/. За счет симметричного характера транскрипции в ввделенных препаратах поли (А)+ FHK, выявляются двуспиральные молекулы. Поэтому, в лаборатории Г.П.Георгиева было предложено использовать гибридизацию клонированных фрагментов с дс РНК (дву-спиральной РНК) как диагностический тест для выявления мдг.
Главным продуктом синтеза является полный транскрипт мдг. Наряду с этим транскриптом в цитоплазме обнаружена минорная фракция поли Ш+РНК. В случае мдг-1 и мдг-3 /13,14/ такая FHK содержит длинные 3 и короткие 5 концевые части первичного транскрипта. Таким образом, РНК, транскрибируясь с мдг-1 и мдг-3, по-видимому, подвергается сплайсингу с вырезанием центрального участка этой РНК. Длинные и короткие транскрипты были обнаружены также для сор/а /32,113,137/, Dm4I2 /45,137/ и BI04 /112/. Например, в случае сорга обнаружены 4 РНК разных размеров, гомологичные различным участкам copta. В данном случае разные транскрипты возникли, вероятно, в результате процессинга.
Распределение мдг-І в хромосомах линий
Изучение закономерностей распределения мобильных диспергированных генов может пролить свет на их возможную роль в функционировании генома. Было показано, что мдг-I не случайно попадают в районы интеркалярного гетерохроматина /I/. Этот вопрос требовал более углубленного изучения с привлечением большего количества линий.
Следует отметить, что мдг, по-видимому, располагаются в геноме 7). meCasioGasterb виде отдельных копий. В пользу этого предположения свидетельствует, например, тот факт, что число копий мдг, обнаруживаемых с помощью гибридизации по Саузерну, довольно хорошо соответствует числу сайтов гибридизации, выявляемых в политенных хромосомах /б/.
Подробнее этот вопрос рассмотрен в литературном обзоре. Другими словами, можно с достаточной уверенностью считать, что число копий мдг в геноме может быть оценено с помощью гибридизации иь situ. , поэтому, при обсуждении вопроса о закономерностях распределения мдг, будем пользоваться взаимозаменяемыми понятиями "число сайтов" или "число копий" мдг как равнозначными.
Было исследовано 15 лабораторных линий &.гпеІ хпо$а&І&л в хромосомах которых определяли локализацию мдг-I и мдг-3. Кроме того, локализация мдг-I была определена еще у пяти других лабораторных линий. Местоположение сайтов мдг в линии устанавливали на основании анализа нескольких особей. Полученные результаты представлены в развернутом виде на рис. 14.и 15 , см. приложение). При наличии индивидуальных различий для данной линии, указывали все обнаруженные места локализации мдг. Генотипы и названия пронумерованных линий приведены в разделе "методы". Распределение мдг-I в хромосомах 20 линий
При анализе распределения мдг-I обнаружились как межлинейные, так и внутрилинейные различия в локализации. Однако последние, как это было показано и ранее /2/, как правило, оказывались менее существенными: особи из одной линии отличались по одному, реже по двум-четырем сайтам локализации. Иногда, как например, в случае линии № 17 (табл. 3) и № б (анализ сайтов проводили у четырех особей, см. их распределение на рис. І в приложении) все исследованные особи не различались по распределению мдг-I. В линии $ 4 (линия НА, см. подробнее главу 2) обнаружено более 100 личинок с одинаковым расположением мдг-I. Однако, в некоторых линиях, например, № 7 и № 15, особи значительно отличались по местоположению мдг-I (см. табл. 3). Например, у личинок № I и № 3 из линии № 15 обнаружено только 4 общих района локализации мдг-I: 7АВ, 37CD, 42А, 99 CD .В данном случае различия по сайтам гибридизации мдг-I очень значительны и достигают уровня межлинейных (табл.3).
Следует отметить, что даже в том случае, когда линия № 15 в течение 10 поколений подвергалась тесному инбридингу, полиморфизм по сайтам мдг-I в ней сохранялся (личинки № 3 № б). Известно, что линия № 15 содержит генный фактор ( ҐІҐ, mafe. xXtom lnoLtion ), вызывающий рекомбина цию у самцов /71,117/. Кроме того, этот фактор повышает частоту хромосомных перестроек и вызывает другие аномалии, характерные для гибридного дисгенеза /125/. Нельзя исключить, что высокая степень полиморфизма по признаку локализации мдг-1 связаны именно с этими особенностями линии.
Рассмотрим, каковы межлинейные различия по местоположению мдг-1 в политенных хромосомах 20 лабораторных линий (рис. 14). Видно, что расположение сайтов гибридизации резко отличается у разных линий. Например, в Х-хромосоме линии № б гибридизация с мдг-1 обнаруживается в районах X, 13 JDt I9B, а в линии № 9 - в районах ЗС, 4Vt 5А. В этом случае только сайт X является общим для обеих линий. Некоторые линии, например № I и № 20 в Х-хромосоме, не имеют общих сайтов. Большие межлинейные различия наблюдаются и при сравнении генома в целом. Так, в линии № I было обнаружено 19 копий мдг-1, а в линии № 20 - 17, но только 2 сайта гибридизации оказались общими для обеих линий (98D, 4IA ). Можно найти линии (№ I и №4), не имеющие ни одного сайта локализации мдг-1 (рис. 14).
Говоря об одинаковых (общих для сравниваемых линий) сайтах локализации, необходимо помнить, что гибридизация in SLLU. позволяла локализовать мдг только с точностью до подсекции (около 200 тыс.нукл. пар) по цитологической карте Бриджеса.
Общее число мест локализации мдг-1 в линии, в расчете на весь геном, составляет в среднем 20 (табл. 4), варьируя от 15 до 27. Наблюдаются и случаи резкого отклонения числа сайтов локализации от среднего. Например, у отдельных особей из линии № II число сайтов может достигать 48.
Обнаружение транспозиций мдг, коррелирующих с увеличением индекса конкурентоспособности
Можно было предположить, что изменение сайтов локализации мдг и увеличение жизнеспособности особей являются взаимосвязанными процессами. В этой главе будут представлены данные, демонстрирующие корреляции между транспозициями мдг в линии НА и изменением индекса конкуренции (уровня приспособленности).
Линии НА+ и ВА были получены в результате длительной селекции. Анализ локализации мдг в этих линиях проводился уже на последнем этапе этой селекции, поэтому остается неясной динамика происходящих изменений в расположении мдг. Согласно наблюдениям, сделанным в лаборатории Л.3.Кайданова, при поддержании линии НА достаточно редко (частот не оценивали) наблюдаются случаи появления пробирок со сравнительно большим количеством активных мух, которые при поддержании линии НА обычно выбрасывают. Поэтому мы провели массовое аутбредное разведение мух линии НА с целью уловить такие случаи спонтанного возрастания приспособленности, которые могли бы сопровождаться изменением в локализации мдг.
"Оживление" линии НА и возрастание ее репродуктивных способностей в результате массового разведения удалось обнаружить уже через три-четыре поколения. В опыте №1 - этот процесс наблюдался с третьего поколения, в опыте №2 - с первого же поколения, в опыте №3 - с четвертого поколения. О восстановлении адаптивных свойств у мух в этих экспериментах, также как и в последующих описанных в этой главе, судили по количественной оценке конкурентоспособности.
Данные таблицы 12 отражают изменения в локализации мдг-1, сопровождающие увеличение приспособленности. Здесь же представлены результаты 4-го эксперимента (линия 96), в котором изучали особей из отводки линии НА, восстановившей положительные адаптивные свойства в отсутствие инбридинга, когда НА поддерживали как обычную лабораторную линию. Из таблицы следует, что у особей с увеличенной жизнеспособностью изменен набор сайтов мдг-І в хромосомах. Появляется ряд новых сайтов, а ряд старых сайтов, характерных для линии НА, исчезает.
Отметим следующие характерные изменения локализации мдг-І. В Х-хромосоме, во всех 4-х опытах наблюдается появление мдг-І в районе I7F (табл. 12, рис. 4). В хромосоме 2 отмечено воспроизводимое в независимых экспериментах появление у части особей мдг-1 в районах ЗОСД 37СД 39СД 4IAD, 42А, 45CD, 48EF, 5IG, 59А (табл. 12, рис. 5). Утрата сайтов, характерных для линии НА, в трех опытах (за исключением опыта 3) наблюдается у отдельных особей в районах ЗОА, ЗЗС, 34F, 35D Е (рис. 56). В районе 59G у многих особей появляется дополнительный сайт локализации мдг-1.
В линии НА вЗЬ -плече метится только один район 75F (рис. 6а, табл.12). После "оживления" в нескольких опытах воспроизводимо появляются новые сайты локализации в районах 62А, 62BG, 65Е, 69D, в пуффурующем районе 75В (табл. 12, рис. 6 б,в), в районах 79G, 79F. В дистальном районе 3R -плеча в линии НА имеется только три сайта - 96BG, 98ВС, 99А (табл. 12). Увеличение жизнеспособности положительно коррелирует с воспроизводимым появлением новых сайтов гибридизации в районах 87В, 89А, 90АВ, 93DE, 98DE. Сайты локализации в хромосоме 3, характерные для линии НА, как правило, сохраняются. У четырех особей из опыта 2, например, расположение последовательностей мдг-1 в 3R -хромосоме остались такими же, как в линии НА, хотя в остальных хромосомах произошли значительные изменения в локализации мдг.
Одновременно в двух опытах, первом и третьем, было зарегистрировано возникновение инверсии с разрывами в районах 94 и 99А. В районе конъюгации инвертированного участка с нормальным гомологом удается видеть до 6 новых сайтов локализации мдг-1, отсутствующих в линии НА (рис. 7). В последующих поколениях, вплоть до 2д в опыте 3, инверсия сохранялась и обнаруживалась примерно у половины исследованных особей.
При увеличении жизнеспособности линии НА в четырех опытах, общее число сайтов локализации возрастает в 1,5- раза.
В экспериментах по массовому разведению мух было определено также местоположение сайтов гибридизации мдг-3. Из -83-таблицы ІЗ видно, что в процессе "оживления" появляются новые сайты. Зарегистрировано воспроизводимое в экспериментах (в опыте 4 локализация мдг-3 не проводилась) появление новых сайтов в районах 8Z), 9В, ІЗАВ, I7EF и I9C.D в Х-хромосоме (табл. 13, рис. 8), в районах 24А, 35CZ), 36А, 42В, 45Е, 50А, 55F в хромосоме 2, в районах 64АВ, 67F, 72А, 79F, 83А хромосомы 3 (рис. 9, табл. 13).
Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что восстановление жизнеспособности особей, которое наблюдали в трех опытах по массовому разведению мух в первых 4-х поколениях, сопровождается изменением локализации мдг. Следует подчеркнуть, что эти изменения носят скачкообразный характер, и в последующих поколениях новый порядок сайтов мдг-1 и мдг-3 в основном сохраняется.
В процессе массового разведения мух не исключена возможность засорения материала, что могло привести к ложному заключению о транспозициях мдг. Однако, при исследовании местоположения мдг у одной и той же особи, было показано (табл. 14), что порядок сайтов мдг-1, например в хромосоме 2, может оставаться таким же, как и в исходной линии НА, а расположение последовательностей мдг-3 в этой хромосоме отличаться (подробнее опыт описан ниже). Это наблюдение исключает возможность объяснения полученных результатов простым засорением.
