Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 7
2.1. Плейотропия как отражение целостности развивающейся системы 7
2.2. Основные подходы к определению места и времени действия летальных генов 12
2.3. Система формирования пространственного патерна 28
2.4. Ступенчатость детерминации в процессе развития 44
3. Материал и методы 53
4. Результаты 72
4.1. Основные характеристики температурочувствительной летальной мутации welt 72
4.1.1. Локализация температурочувствительной летали 72
4.1.2. Определение летальной фазы мутантов welt 74
4.1.3. Определение температурочувствительного периода для основных проявле ний мутации welt 75
4.2. Роль клеточной гибели в формировании фенотипа температурочувствительных мутантов wt/wt 82
4.2.1. Определение автономности проявления мутации welt в имплантированных имагинальных дисках 82
4.2.2. Определение автономности проявления мутации welt в клонах гомози готных клеток 86
4.2.3. Роль клеточной гибели в формировании фенотипа welt (гистологическое исследование). 94
4.3. Временные изменения характера аномалий, вызываемых мутацией welt и регуляция патерна в поврежденных зачатках 104
5. Обсуждение 136
5.1. Автономность проявления мутации welt и нарушение клеточных контактов как возможный механизм действия мутации 137
5.2. Тканеспецифичность проявления мутации welt. 142
5.3. Стадиеспецифичность аномалий, вызываемых мутацией welt, и регуляция патерна 147
5.4. Роль границ компартментов и межсегментных мем бран в подцержании морфогенетических градиентов 153
Заключение 165
Вывода
- Плейотропия как отражение целостности развивающейся системы
- Ступенчатость детерминации в процессе развития
- Основные характеристики температурочувствительной летальной мутации welt
- Автономность проявления мутации welt и нарушение клеточных контактов как возможный механизм действия мутации
Введение к работе
К одному из наиболее распространенных типов мутаций у эукариот относятся летальные мутации, ведущие к гибели особей на определенных стадиях развития (Hadorn, 1961; Bryant, Zornetzer, 1973). Значительная часть этих мутаций вызывает повреждения или гибель клеток эмбриона, сопровождающиеся нарушениями в формировании и в конечном итоге - остановкой развития.
В 1951 году (Gliicksman, 1951) была установлена универсальность явления локальной гибели клеток в процессе эмбриогенеза у млекопитающих. С тех пор появилось множество работ, в которых гибель клеток, дегенерация, некроз, деструкция, дезинтеграция рассматриваются как явления физиологические, генетически детерминированные в нормальном развитии, а также как важный компонент в цепи патогенеза различных патологических процессов, происходящих в период внутриутробного развития млекопитающих и человека. В частности, замечено, что зачатки органов, в которых есть очаги физиологического некроза, обнаруживают тенденцию к частому нарушению морфогенеза. Клеточная гибель является важным событием и в морфогенезе насекомых: во время деструкции личиночных органов и при развитии зачатков имагинальных органов (Fristrom, I969;Poodry,Schneiderman,l970 Spreio, 1971; O'Brocnta, Bryant, 1983). Связь нарушений морфогенеза с процессами физиологической клеточной гибели отмечена и для крыловых имагинальных дисков дрозофилы. Так, начало образования обширных зон некрозов в крыловых зачатках многих мутантов дрозофилы соответствует началу периода физиологической клеточной гибели в нормальных дисках (James,Bryant, 1981).
В настоящее время несмотря на неослабевающий интерес генетиков к проблеме соотношения гена и признака, существует мало сведений о факторах, определяющих локализацию клеточной гибели в развивающемся мутантном организме, и о путях, по которым повреждение клеток и их гибель могут приводить к множественным аномалиям развития. Другими словами, существует мало данных о путях реализации плейотропного действия генов, вызывающих гибель клеток. В качестве модельной системы для выяснения основных параметров возникновения множественных врожденных аномалий развития могут быть использованы мутации Drosophila melanogaster с ПЛеЙОТропным проявлением.
У дрозофилы известно всего лишь несколько летальных морфо генетических мутаций, о которых можно сказать, что они исследованы достаточно полно в смысле их нарушающего действия на развитие и формирование патерна (Poodry et al., 1973; Martin et al., 1977; Postlethwait, 1978; Jurgens, Gateff, 1979). Однако факты, найденные при изучении данных мутаций, не укладываются в единую картину закономерностей процессов формирования аномалий. В этом плане осталось еще много нерешенных вопросов. К ним относятся: вопрос об изменении способности к регуляции в процессе развития зачатка, вопрос о взаимообусловленности процессов сегрегации клеток разного проспективного значения и интегральной организации зачатка. Поэтому целью настоящей работы было подробное и комплексное исследование нарушений, производимых летальной температурочув-ствительной (ТЧ) мутацией welt на клеточном и органном уровне, в экспериментальных условиях. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
I) определить основные характеристики ТЧ летальной мутации (локализацию, летальную фазу, температурочуветвительные
периоды (ТЧЩ основных ее проявлений);
найти первичное место действия мутации welt и определить причину морфологических аномалий имаго на клеточном уровне;
исследовать временные изменения характера аномалий, вызываемых одной и той же мутацией welt в разные периоды развития.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Плейотропия как отражение целостности развивающейся системы
Предметом феногенетического анализа является путь от гена к признаку (фену). При этом каждая мутация, нарушающая процесс развития, позволяет вычленить из всего множества признаков, присущих развивающемуся организму, тот спектр нарушений, который возникает вследствие измененного функционирования всего лишь одного гена или группы генов. Таким образом, феногене-тический анализ - это особый, дискретный анализ становления фенотипа. Он сводится к поиску установимте различий между мутантними и немутантными особями, начиная с первых стадий эмбриогенеза и до формирования конечных признаков в постнатальном периоде развития (Н.В.Тимофеев-Ресовский и др., 1977). Как справедливо указывают Н.В.Тимофеев-Ресовский и В.И.Иванов (1966), отсутствие общей теории онтогенеза при наличии "... ряда частных теорий и большого числа гипотез и идей следует объяснить недостаточным проникновением генетики в физиологию развития". Поэтому в создании общей теории онтогенеза существенное значение имеет развитие феногенетики.
К традиционным подходам феногенетического анализа относятся: установление и изучение различными методами фенокрити-ческих фаз в развитии (Н.В.Тимофеев-Ресовский, 1928; Haecker, 1918, 1925; Bonnevie, 1940; Villee, 1943; Hadorn, 1961; Forster, Suzuki, 1970), изучение взаимозависимости, или неавтономности развития признаков (Sturtevant, 1932; Beadle, Ephrussi, 1937; Ephrussi, 1942) и изучение феноменологии проявления генов, а именно: изучение влияния генотипи-ческой и внешней среды на изменчивость конечных стадий онто - 8 генетического становления наследственных признаков (Н.В.Тимофеев-Ресовский, 1940). В предлагаемой работе в рамках этих традиций используются современные модификации феногенетиче-ского анализа.
Одним из феноменов, иллюстрирующих сложность соотношения генов и признаков, является плейотропия проявления действия генов. Тезис Бидля и Татума "один ген - один фермент" ни в коей мере не означает автоматического принятия линейной схемы "ген - признак" (Н.В.Тимофеев-Ресовский, В.Й.Иванов, 1966). Уже с давных пор на огромном материале хромосомных аномалий, особенно делеций, показано, что выпадение какого-либо гена из генотипа ведет не к выпадению соответствующего признака, а, как правило, к летальному эффекту (Poulson, 1940; 1945; Hadorn, 1948, 1961); т.е. генотип работает в онтогенезе не как сумма генов, определяющих соответствующую сумму признаков, а как целостная система, в которой каждый ген отвечает за многие признаки, и каждый признак определяется многими генами (Б.Л.Астауров, 1972).
И.И.Шмальгаузен (1982) в своих работах, посвященных развитию, подчеркивал, что развивающийся организм надо рассматривать как целое, как систему, в которой развитие всех ее частей скоординировано и взаимозависимо. Механизм такой скоор-динированности он называл корреляциями, или взаимосвязями и выделял три их типа: I) геномные, 2) морфогенетические и 3) функциональные. "Зависимость может определяться, по-видимому, непосредственными факторами развития, т.е. генами (вероятно, через какие-то биохимические процессы, идущие в клетках того самого материала, в котором реализуются изменения); такие взаимозависимости я называю геномными. Взаимозависимость может определяться собственно внутренними факторами развития (тоже наследственными, но осуществляемыми путем передачи веществ или возбуждения непосредственно от одной части к другой); такие взаимозависимости я называю морфогенетическими (в узком смысле слова). Наконец, взаимозависимость в формообразовании может определяться зависимостью в дефинитивных функциях (причем изменение в строении члена корреляционной пары или цепи зависит от самого функционирования данного члена); такие взаимозависимости я называл эргонтическими". Геномные корреляции могут "... покоиться на множественном действии одних и тех же генов (явления "плейотропизма", или феногенети-ческие корреляции) или на дифференцированном действии отдельных тесно сцепленных наследственных факторов (хромосомные корреляции)" (И.И.Шмальгаузен, 1982). Таким образом, явление плейотропии дает представление о развитии как целостном, о развитии системы с определенными взаимосвязями, которую невозможно разложить механически. Благодаря плейотропности действия генов, возможен мозаичный тип развития, при котором происходит ранняя автономизация развития зачатков особи. У насекомых, обладающих мозаичным характером развития и отсутствием миграций клеток, геномные корреляции выделяются в наиболее явном виде не сильно замаскированном морфогенетическими взаимосвязями. Это обстоятельство делает явление плейотропии более доступным для изучения.
Ступенчатость детерминации в процессе развития
В настоящее время доказано, что процесс развития, в результате которого формируется конечный патерн, является не монотонным, а ступенчатым.
Идея существования в развитии ступенчатой сегрегации области широкого проспективного значения на области с более ограниченными качествами не нова в экспериментальной эмбриологии (Wilson, 1925; Weiss, 1939). Опыты Вейса по фрагменти-рованию эмбрионального зачатка показали, что первоначально гомогенная клеточная популяция делится на несколько областей с различными проспективными значениями. Сегрегация клеток различного эмбрионального происхождения в агрегатах (Holtfreter, 1943; Moscona, 1957) и сегрегация клеток разных клонов мела-нобластов у аллофенных мышей (Mintz, 1969) демонстрируют свойства клеток, приводящие к проспективному ограничению областей.
Одним из классических подходов к изучению основных факторов морфогенеза и детерминации является клональный анализ (Becker, 1957; Bryant, Schneiderman, 1969; Bryant, 1970). Использование индуцированной митотической рекомбинации дает возможность метить потомков клетки, в которой произошла ре комбинация, устанавливая таким способом общее происхождение маркированных клеток. Частота клонов, их средний размер, форма и преимущественная локализация дают сведения о процессах морфогенеза и детерминации. Так было установлено, что детерминация происходит в группах клеток, а не в одиночных клетках (Bryant, Schneiderman, 1969; Postlethwait, Schneiderman, 1969; Bryant, 1970).
С помощью клонирования в разные моменты развития между откладкой яйца и окукливанием обнаружено прогрессирующее разграничение областей глазоантенного зачатка (Е.К.Гинтер, В.И. Иванов, 1973; Postlethwait, Schneiderman, 1971). Такое же постепенное определение "судьбы" развития продемонстрировано ДЛЯ НОЖНЫХ имагинальных ДИСКОВ (Bryant, Schneiderman, 1969), крыловых (Bryant, 1970; Murphy, Tokunaga, 1970; Garcia-Bel-lido, Merriam, 1971 а) и глазных (Becker, 1957). Однако результаты такого рода клонального анализа давали лишь косвенное представление о наступлении каждого последующего шага детерминации. По ним можно судить о тех моментах в развитии, когда клетка еще не детерминирована для формирования определенной структуры, т.е. когда ее потомки обнаруживаются еще и в смежных структурах. О наступлении самого события детерминации судить трудно, так как по мере роста средний размер индуцированных клонов уменьшается. Вместе с уменьшением размера клона падает его способность захватывать соседние области, уменьшается разрешающая способность метода.
Проблемы, возникавшие в связи с малым размером клонов, были разрешены при введении нового способа клонирования, методики Minute. У дрозофилы существует серия доминантных ло-кусов Minute (Lindsley, Grell, 1968) летальных в гомозиготном состоянии. Гетерозиготные особи М+/М характеризуются уменьшенными размерами, маленькими щетинками. Мората и Риполл (Morata, Ripoll, 1975) показали, что гомозиготные клетки в клонах дикого типа (м+/м+ ), полученных посредством индуцированной митотической рекомбинации, делятся быстрее, чем окружающие клетки Minute (м+/М ), создавая на их фоне клоны огромных размеров. Неожиданное и важное свойство индуцированных клонов м+/м+ заключается в том, что,несмотря на свою величину, они не изменяют средний размер и форму крыла, хотя могут занимать значительную часть его (Morata, Ripoll, 1975).
При использовании метода Minute для клонального анализа дорзального мезоторакального диска были найдены линии клонального ограничения (Garcia-Bellido et al., 1973, 1976). Оказалось, что индуцированные после определенного момента в развитии клоны не пересекают определенных демаркационных линий на кутикуле взрослого насекомого. Области покровов, производных данного зачатка, разделенные демаркационными линиями были названы компартментами (Garcia-Bellido et al., 1976), а группа клеток, образующих компартмент, - поликлоном (Crick, Lawrence, 1975). Термин "поликлон" введен для обозначения того факта, что для формирования компартмента обособляются сразу несколько клеток, не обязательно связанных непосредственным клональным родством.
В процессе развития имагинальных дисков происходит разделение их на альтернативные компартменты (Garcia-Bellido et al., 1976; Steiner, 1976; Backer, 1978; Morata,Lawrence, 1979; struhl, 1981). Еще до своего обособления дорзальный мезоторакальный диск разделен на передний и задний компартменты. В первой личиночной стадии происходит дальнейшее разделение его на дорзальный и вентральный компартменты, noturn и крыло.
Основные характеристики температурочувствительной летальной мутации welt
Для любого экспериментального генетического исследования первым необходимым условием анализа является известная локализация мутации. Поскольку мутация welt является термочувствительной в своем проявлении (Lindsley, Grell, 1968), логично было бы предположить, что и ТЧ летальный эффект, обнаруженный ранее в культуре мух fj wt (В.А.Мглинец, В.И.Иванов, 1976), сцеплен с мутацией welt. Локализацию, как уже упоминалось, производили в 3 этапа (рис. 7). В резрьтате первого этапа (ориентировочной локализации летали) было установлено, что кросеоверные хромосомы, маркированные al, al dp, al-"b,al-cn bw-sp, mr sp несут ТЧ леталь, а кросеоверные хромосомы al-bw, Ъ-sp, pr-sp,cn-sp, vg-sp, c-sp не несут ТЧ летали (рис. 8). Рекомбинанты al-vg,al-c, al-a и al-px фенотипически неразличимы, так как мутации с, а и рх на фоне vg практически не обнаруживают своего действия. Поэтому они были классифицированы как al-vg.Среди этого класса кроссоверов на 2 с ТЧ-ле-талыо приходилось 8 без нее. Из общего числа фенотипически неразличимых рекомбинатов a-sp и px-sp обнаружено 19, несущих леталь, и II без летали. Эти результаты позволили отнести ТЧ-леталь в интервал второй хромосомы между локусами curved (с; 2-75,5) и plexus (рх; 2-100,5). В том же районе расположены и локусы fj и wt.
Для дальнейшего анализа были получены и использованы лишь рекомбинанты px-sp, возникшие в результате кроссинговера на участке с-рх (рис. 8). Кросеоверные хромосомы px-sp гомози готизировали и исследовали жизнеспособность гомозигот при 29С (рис. 7 П). 24 рекомбинанта px-sp не несли мутаций fd и wt и давали жизнеспособное при 29С потомство px-sp; 32 кроссовера несли и мутации fd wt,H ТЧ-леталь. Кроссоверов px-sp fd или px-sp wt выявить не удалось, очевидно, из-за малочисленности выборки и очень тесного сцепления мутаций fa» wt и летали. Эти данные говорят о том, что ТЧ-леталь располагается в исследованном районе с-рх, примерно на расстоянии 2/5 интервала от локуса с, т.е. вблизи локусов fd и wt.
В предположении, что ТЧ-леталь расположена или очень близко к мутациям fd и wt или сцеплена с одной из них, был сделан рекомбинационный анализ при рестриктивной t с использованием в качестве маркеров только мутаций fо и wt (рис. 7 Ш). В результате скрещивания на 4430 потомков fd wt / ++ было обнаружено 55 особей fd wt /fd wt 16 fd wt / f3 + и ни одной генотипа fj wt /+wt или fj wt /+ wt. Гомозиготы fd wt были полностью сформированы, но из куколок не вылетали. Появление мух fd wt /f д + свидетельствует о том, что ТЧ деталь отделима от fd с частотой 0,36% и, следовательно, находится справа от fd на расстоянии, не превышающем дистанцию между fd и wt. Так как локализация генов fd и wt дана неточно (Lindsley, Grell, 1968), вполне возможно, что расстояние между ними составляет менее одной морганиды, и можно предполагать, что ТЧ-леталь скорее всего связана с мутацией локуса wt или очень тесно с ним сцеплена.
В связи с возникшей необходимостью для других опытов была предпринята попытка отделить мутацию welt от four jointed. Точно также скрещивали гетерозиготных самок fd wt /++ с самцами исходной культуры, но потомков скрещивания помещали в условия 26,5С. При этой температуре мутация welt имеет дос таточно хорошую экспрессивность и в то же время мутантные особи еще жизнеспособны. Таким образом было проанализировано около 20000 потомков, среди которых обнаружено множество с одной мутацией fj и ни одного с welt и ТЧ-леталью или с мутацией welt без летали. Этот факт можно объяснить тем, что мухи без ТЧ-летали при 2б,5С имеют большое селективное преимущество по сравнению с условно летальными. На это указывает существование уменьшенной доли некроссоверных особей f j wt / fj wt . Однако факт, что не было обнаружено ни одной мухи с wt, но без ТЧ-летали, которая в данных условиях также имела бы селективное преимущество, можно объяснить только тем, что леталь неотделима от локуса welt. Так вероятность их разъединения меньше 0,5хЮ . Это подтвердило наше предположение о связи ТЧ-летали с мутацией welt.
Автономность проявления мутации welt и нарушение клеточных контактов как возможный механизм действия мутации
В результате трансплантации мутантных зачатков wt/wt и исследования проявления данной мутации в клонах гомозиготных клеток, индуцированных у гетерозигот wt/+ , установлено, что все дефекты мутантов возникают вследствие непосредственного повреждения клеток определенных участков имагинальных дисков. Аномалии кутикулярных покровов имаго являются прямым следствием первичного проявления мутации welt и не зависят от нарушения других личиночных или имагинальных органов, вызванного мутацией. Однако при определении существующих взаимосвязей между органом и всем организмом, между разными органами одного организма и между клетками внутри одного органа необходимо помнить, что автономность устанавливается в каждом из этих соотношений, не являясь абсолютной. Так как развивающийся организм характеризуется множеством связей на разных уровнях, то, говоря об автономности проявления мутации, мы всегда имеем в виду определенную связь и определенный уровень. Например, зачатки мутантов welt обнаруживают неавтономность в способности дифференцироваться (связь органа и всего организма). Бели принимать их способность дифференцироваться за критерий непроявления мутации, то можно ошибочно прийти к выводу о неавтономности действия мутации welt в этих зачатках. Но это не так. При детальном исследовании имплантатов, развивавшихся в нормальном хозяине при высокой и низкой температурах, выяснилось, что в рестриктивных условиях, несмотря на нормальную среду, развивается имплантат со множеством аномалий, характерных для мутации welt, тогда как в пермиссивных условиях фенотип дифференцированного зачатка соответствует нормальному (табл. I). То есть, пересадка мутантных зачатков welt нормальным реципиентам выявила зависимость их развития от среды нормального хозяина, которая не способна скомпенсировать недостаточность функции продукта мутантного гена welt в имплантате, но способна обеспечить "выживание" и проявление собственных потенций имагинального диска.
Анализ действия мутации welt в трансплантатах и в больших клонах гомозиготных клеток показал ее автономность на органном и клеточном уровнях (отсутствие связи разных органов и клеток внутри одного зачатка), свидетельствуя о том, что нормальный продукт локуса welt не диффундирует или диффундирует, но не усваивается мутантними клетками. Однако в малых клонах клеточное летальное действие мутации welt не обнаружено, что может свидетельствовать: во-первых, о локальном проявлении мутации в небольших участках ткани и, во-вторых, о неабсолютной автономности его на клеточном уровне. Хотя и не обнаружено взаимодействия клеток, опосредованного диффузией нормального продукта локуса welt, не исключено их взаимовлияние в прямом контакте и также не исключена реакция клеток, окружающих погибшую ткань, на изменение их взаиморасположения вследствие некроза соседних клеток. В первом случае можно ожидать, что в зоне мутантных клеток по границе пятна yellow welt влияние мутации не будет обнаружено. Если еще допустить, что мутация welt ив полностью гомозиготных особях проявляется лишь в ограниченных областях эпидермальной ткани, и значительная доля малых клонов не захватывает эти участки, то становится ясной причина различного поведения мутации в больших и малых пятнах. Аналогично мутации we it неполную клеточную автономность проявляют две известные мутации prickle (рг) и frizzled (fz) , изменяющие полярность щетинок и трихом. Для них также характерно проявление только в больших клонах (Gubb, Garcia-Beilido, 1982). Авторы объясняют этот факт тем, что по границам клонов имеется взаимодействие мутантных гомозиготных клеток и соседних гетерозиготных клеток. К сожалению, механизм действия мутаций рг и fz пока еще не выяснен.
